RNA干扰对阿尔茨海默病家族性瑞典型APP突变的沉默作用

目的诱导小干涉RNA(small interference RNA，siRNA)对阿尔茨海默病淀粉样前体蛋白家族性瑞典型突变(APPswe)的沉默作用。方法设计一对针对APPswe的寡核苷酸，构建成内源性表达相应siRNA的质粒，与构建的APP-EGFP重组质粒瞬时共转染COS-7细胞，利用GFP报告基因来间接观察siRNA对APPswe的沉默作用。结果siRNA可有效地下调突变型APP，相比APPwt而言，针对突变型APP的siRNA对APPswe的沉默作用更强。结论针对APPswe的siRNA可有效地沉默APPswe基因，并有一定的等位基因特异性。因此，针对APPswe的siRNA将在阿尔茨海默病治疗研究领域扮演重要角色。     

人淀粉样前体蛋白基因与绿色荧光蛋白融合基因筛选系统的建立

目的 构建携带人淀粉样前体蛋白（APP）的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）载体。以利于初步筛选对APP mRNA水平作用的药物。方法 将pEGFP质粒和携带野生型APP695亚型的pXCJL经Hind Ⅲ酶切，连接．PCR初筛，酶切鉴定。进一步经测序证实。携带野生型人类APP751亚型cDNA的pCDNA3．1质粒用XbaⅠ酶切．Klenow酶填平．再用HindⅢ酶切．回收APP751片段；质粒EGFP用SmaⅠ和Hind Ⅲ酶切。将目的基因APP751片段与EGFP载体片段连接生成重组质粒．酶切鉴定．测序证实。构建好的重组质粒转染COS-7细胞．观察EGFP的表达情况。结果 APP695和APP751重组质粒上的EGFP在COS-7细胞内得以表达。结论 构建的APP—EGFP融合基因重组质粒．有助于方便、快速地初筛出作用于APP mRNA水平的药物。     

携带绿色荧光蛋白基因的APP695真核细胞表达载体的构建及鉴定

目的 构建大鼠淀粉样前体蛋白(APP)695基因真核细胞荧光表达载体,进行细胞转染、表达,为阿尔茨海默病(AD)治疗药物的研究提供一种有效的细胞模型.方法 设计并合成APP695基因的引物,以携带APP695基因的真核细胞表达载体pCB6质粒为模板,PCR扩增得到APP695基因全序列:将APP695基因连接到携带绿色荧光蛋白基因的载体pIRES2-EGFP上;应用酶切分析、PCR检测及DNA测序分析等鉴定所构建的真核细胞表达载体.结果 以重组载体为模板扩增得到的片段大小与已知APP695基因大小相同,酶切也得到目的 基因片段,测序结果显示与已知APP695基因序列相同.结论 成功构建了携带绿色荧光蛋白基因的APP695基因真核细胞表达载体,为AD治疗药物的研究提供了一种有效的分子工具.     

突变型APP双荧光融合基因的构建和FRET对其表达的研究

目的探讨Alzheimer病的发病机制,研究淀粉样蛋白前体(APP)酶解过程,构建含有Swedish突变的双荧光真核表达系统。方法通过聚合酶链式反应(PCR)得到蓝色荧光蛋白(CFP)和黄色荧光蛋白碱基序列(YFP),生物合成含有Swedish突变的APP中间54个碱基片段(54bp),利用基因工程技术将CFP、54bp、YFP片段克隆至载体质粒pcDNA3.0中,得到重组质粒pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP,将其转染至人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)中,利用激光共聚焦显微镜观察荧光表达,检测荧光共振能量转移(FRET)。结果酶切和基因序列分析证明重组质粒构建成功;对转染细胞的荧光和FRET检测发现融合基因能够准确表达荧光,同时可以观测到FRET现象。结论含有Swedish突变的荧光融合基因的构建为探索AD的发病机制、活体观察APP裂解奠定了基础。     

水通道蛋白4小RNA干扰技术优化亚低温治疗脑水肿

目的 应用针对靶向水通道蛋白4(aquapofin 4,AQP-4)的小RNA(siRNA)干扰技术优化亚低温减轻颅脑创伤(traumatic brain injury,TBI)后脑水肿程度的治疗效果.方法 构建沉默AQP-4 mRNA表达的siRNA质粒;液压打击法建立大鼠TBI模型,分TBI对照组、AQP-4 siRNA治疗组、亚低温治疗组、AQP-4 siRNA及亚低温联合治疗组;提取第1、3、5、7天脑组织总RNA和总蛋白,RT-PCR和Western blot方法 检测AQP-4的mRNA和蛋白表达水平;干/湿比重法和Evans蓝测定法观察大鼠TBI后不同时相脑组织含水量和血脑屏障通透性改变;实验动物予以神经功能缺陷综合评分.结果 亚低温在减轻TBI后脑水肿程度方面优于AQP-4 siRNA,但siRNA技术在沉默AQP-4表达方面强于亚低温,联合应用AQP-4 siRNA和亚低温在TBI后降低脑水肿程度方面获得最佳治疗效果.结论 靶向AQP-4的Si RNA干扰技术可优化亚低温在TBI后降低脑水肿方面的治疗效果.     

阿尔茨海默病患者外周血APP mRNA水平的变化

目的建立荧光定量PCR方法检测Alzheimer病(AD)患者外周血中淀粉样蛋白前体 (APP)的 mRNA水平,并探讨该基因在AD患者外周血中的表达及意义。方法根据APP的基因序列,设计并合成引物和荧光标记探针。将PCR扩增目的片段用AT克隆的方法克隆入T载体,重组质粒经筛选、鉴定后,作为阳性模板,用于标准曲线的制定和样品检测。用该方法检测30例AD患者和 23例正常老年人对照组外周血中APP基因的mRNA水平。结果应用重组质粒制作的定量曲线循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系。AD组APP基因平均表达水平为(2．54×105±1．53×105) copies/μgRNA,高于对照组(6．03×104±7．58×105)copies／μgRNA(P<0．001)。结论荧光定量PCR检测AD患者APP mRNA水平的方法较常规PCR技术更为简便、快速、准确。用该法测得APP在AD患者外周血中的mRNA水平有所增加。     

Livin基因短发卡RNA表达质粒的构建及其对胶质瘤Livin基因表达的影响

目的构建凋亡抑制基因livin基因的特异性短发卡RNA（siRNA）真核表达载体,并观察其在人脑胶质瘤细胞中对livin基因表达的抑制。方法设计有小发夹结构的2条livinβ siRNA对应的DNA序列,将其克隆入pSliencer 3.1质粒,构建重组质粒pSliencer-livinβ,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定。以脂质体法将pSliencer-livinβ转染人胶质瘤细胞。采用RT-PCR和Western-blot检测Livinβ蛋白的表达,筛选最有效的一组pSliencer-livinβ质粒。结果酶切及测序证实质粒pSliencer-livinβ构建成功。转染后胶质瘤细胞livinβmRNA和蛋白表达均受到明显抑制。结论成功构建livinβ基因的特异性短发卡RNA（siRNA）真核表达载体能够显著抑制人胶质瘤细胞livinβ基因的表达。     

重组大鼠质粒pEGFP-GDNF的构建和在脊髓内表达的实验研究

采用RT PCR方法从大鼠胎脑组织总RNA中扩增出该基因的全序列cDNA ,并以融合蛋白方式克隆到增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)报告基因的真核表达载体中 ,成功构建了重组质粒 pEGFP GDNF在体表达载体。采用基因注射法将阳离子脂质体DC Chol和pEGFP GDNF基因混合后转染至大鼠胸段脊髓组织中 ,观察GDNF在大鼠脊髓中的表达。RT PCR结果表明注射局部GDNFmRNA表达增加。荧光显微镜下观察发现 ,注射局部灰质和白质神经细胞内均有较多绿色荧光蛋白表达。本研究结果提示 ,阳离子脂质体介导GDNF体内转基因的方法是可行的 ,EGFP可作为报告基因观察GDNF在体内的表达。     

RNA干扰PDGF-B基因对胶质瘤U251细胞凋亡和增殖的影响

目的利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术特定沉默胶质瘤U251细胞株的血小板源生长因子-B(PDGF-B)基因,观察其对U251细胞株细胞凋亡和增殖的影响。方法利用脂质体将针对PDGF-B基因的siRNA转染进入U251细胞,利用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(RTPCR)检测PDGF-B基因表达;Western blot检测显示siRNA转染组PDGF-B蛋白表达,采用MTT法检测胶质瘤U251细胞的增殖,应用流式细胞计数观察抑制PDGF-B基因后胶质瘤U251细胞的凋亡情况。结果 RT-PCR检测PDGF-B基因表达明显下降;Western blot检测显示siRNA转染组PDGF-B蛋白表达明显抑制(抑制率60%),MTT结果显示siRNA转染组U251细胞增殖较对照组明显降低;流式细胞学检测提示降低PDGF-B在胶质瘤细胞的表达能抑制胶质瘤细胞的有丝分裂,促进细胞的凋亡。结论构建针对胶质瘤细胞PDGF-B的RNA干扰质粒并转染人胶质瘤U251细胞株后,可明显抑制U251细胞株PDGF的表达,对人胶质瘤U251细胞株有明显的生长抑制和促进凋亡作用。     

SH-SY5Y神经细胞APP高表达对胆碱酯酶活性影响

目的研究类阿尔茨海默病(AD)神经细胞模型中APP异常代谢下胆碱酯酶活性变化,探讨AD的发病机制。方法采用脂质体转染法将含有瑞典家族性AD双突变的淀粉样蛋白前体蛋白APP670/671基因(APPSWE)转染至神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)中;利用实时荧光定量PCR方法和Western blotting的方法测定APPmRNA、可溶性APP(αAPPs)和总APP蛋白表达水平;采用改进的Ellman比色法测定细胞培养基中乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)及丁酰胆碱酯酶(Butyrylcholinesterase,BuChE)活性。结果转染APPSWE质粒的SH-SY5Y细胞APP总mRNA和蛋白表达水平显著升高,αAPPs分泌量下降。转染组SH-SY5Y细胞与对照组相比,AChE和BuChE活性都升高。结论体外神经细胞实验证明APP蛋白过度表达能升高AChE和BuChE的活性,其机制可能与APP蛋白代谢紊乱使Aβ升高及下调αAPPs分泌有关。     

Lentivirus-mediated APP695-RNAi reduces apoptosis in APP transgenic mouse neurons

Amyloid-β peptide (Aβ) is a cleavage product of the amyloid precursor protein (APP), which is thought to be important in the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). Recent evidence suggests that Aβ induces neuronal apoptosis in the brain and in primary neuronal cultures. If decreased Aβ whether could reduce the neuronal apoptosis? In this study, APP695-siRNA was delivered to hippocampal and cortical neurons of APP695 transgenic mice (AD model) in vitro using a recombinant lentivirus vector. The results show that lentivirus-mediated RNA interference of the APP695 gene could reduce neuronal apoptosis, possibly through the reduction of caspase-3 activity and the neuronal apoptosis pathway. These results suggest that lentivirus-mediated RNA interference may be a potential therapeutic for AD.     

干扰长单一序列区83基因对人巨细胞病毒感染后人脑血管平滑肌促血管生成素及血管内皮生长因子表达的影响

目的 长单一序列区（unique l ong r egion 8 3,UL83）基因是人巨细胞病毒（human c ytomegalovirus, HCMV）感染再激活标志。本研究拟探索UL83对HCMV感染后人脑血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMC）中不稳定斑块破裂相关因子,如促血管生成素（angiopoietin,Ang）以及血管内皮生 长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的影响。 方法 ①采用流式细胞仪确定amidite荧光素（fluorescein amidite,FAM）标记的小干扰核糖核酸（small interfering ribonucleic acid,siRNA）通过脂质体转入人脑VSMC的转染效率;②将3条化学合成siRNA通 过脂质体转染入已感染HCMV AD169株（MOI＝10）的人脑VSMC当中,结合空白组、接毒组及接毒无效 干扰组筛选抑制UL83基因最强siRNA;③分别检测HCMV AD169株（MOI＝10）感染人脑VSMC后0 h、6 h、 12 h、24 h、48 h以及72 h Ang-1、Ang-2及VEGF-A信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid,mRNA）及蛋 白表达变化;④分别检测空白组、接毒高效干扰组、接毒无效干扰组及接毒组在感染48 h后Ang-1、 Ang-2及VEGF-A的mRNA及感染72 h后上述蛋白表达情况。 结果 转染6 h后,95.59%人脑VSMC转染了FAM标记siRNA。感染HCMV AD169株（MOI＝10）的人脑 VSMC在转染siRNA 48 h后,siRNA转染组与接毒组相比,UL83 mRNA相对表达量最多下降78.7%;转染 si RNA72 h后,UL83编码的pp65蛋白相对表达量最多下降81.3%。人脑VSMC感染HCMV AD169株（MOI＝ 10）0 h、6 h、12 h、24 h、48 h以及72 h时后,Ang-1 mRNA及蛋白相对表达量逐渐下降（P <0.01）,Ang-2 及VEGF-A mRNA及蛋白相对表达量则逐渐增加（P <0.01）。而通过转染高效siRNA抑制HCMV AD169株 UL83基因,使得Ang-1表达下降,Ang-2和VEGF-A表达增加均被抑制。 结论 H CMV AD169株具有同时促进人脑VSMC中Ang-1表达降低,Ang-2及VEGF-A表达增加功能。而通 过siRNA抑制HCMV AD169株UL83基因表达能够阻止上述变化。提示HCMV可能通过UL83基因造成靶细 胞产生促血管新生微环境。     

LRIG3特异性RNA干扰真核表达载体的构建及稳定株筛选

目的构建LRIG3（leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 3,LRIG3）基因特异的RNA干扰质粒,为探讨抑制LRIG3基因表达对脑胶质瘤细胞生物学行为调控的研究奠定基础。方法根据GenBank数据库提供的LRIG3基因核苷酸序列,选择设计2条能转录短发卡RNA（shRNA）的DNA序列,命名为LRIG3-shRNA1、LRIG3-shRNA2,同时设计1条非特异性序列作为阴性对照,命名为negative-shRNA。并与pGenesil2质粒载体连接,转化感受态大肠杆菌,挑选阳性克隆,抽取重组质粒,使用限制性内切酶SalⅠ酶切电泳,DNA测序鉴定。3种重组表达载体转染胶质瘤细胞系GL15细胞,用G418筛选后挑选单克隆并扩增获得稳定株。逆转录酶-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot分别在mRNA和蛋白水平上检测LRIG3的表达。结果重组质粒成功转化感受态大肠杆菌,经SalⅠ酶切琼脂糖凝胶电泳分析,结果表明寡核苷酸成功插入到预计位点,经测序鉴定,序列完全正确。G418筛选出稳定转染三种质粒的GL15细胞,转染pGenesil2-LRIG3-shRNA组细胞LRIG3 mRNA和蛋白表达明显低于转染pGenesil2-negative-shRNA组。结论成功构建针对LRIG3基因的特异性shRNA真核表达载体,转染细胞后可抑制LRIG3基因表达,为进一步研究其基因功能奠定了基础。     

甲胎蛋白特异性小干扰RNA重组腺病毒载体的构建

背景：RNA干扰技术的应用，关键在于能够采用1个有效的基因转移系统将小干扰RNA转入至靶细胞，目前广泛应用的是构建小干扰RNA表达载体。 目的：利用AdMax腺病毒载体系统构建表达人甲胎蛋白-小干扰RNA的腺病毒载体。 设计、时间及地点：开放性实验，于2007-03/10在山东大学附属济南市中心医院中心实验室完成。 材料：穿梭质粒pDC316-EGFP-U6为本元正阳基因技术公司产品；AdMax KitD试剂盒与低代数HEK293细胞为Microbix Biosystems Inc.（Canada）公司产品。 方法：选择针对甲胎蛋白 mRNA的特异性小干扰RNA靶序列，设计合成为相应的双链DNA，并将其与酶切线性化的pDC316-EGFP-U6载体片段连接，构建好的穿梭质粒pDC316-EGFP-U6-AFP-siRNA和腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染HEK293细胞，同源重组产生重组腺病毒。 主要观察指标：对重组腺病毒进行聚合酶链反应鉴定及扩增、纯化、滴度测定。 结果：构建的穿梭质粒载体经聚合酶链反应鉴定和测序分析，证实与设计一致。重组腺病毒Ad-AFP-siRNA经聚合酶链反应和绿色荧光蛋白表达检测证实构建成功，测定滴度为1.4×109 nfu/L。 结论：实验成功构建了Ad-EGFP-U6-AFP-siRNA重组腺病毒。     

Altered expression of genes for amyloid and cytoskeletal proteins in Alzheimer cortex

Recent studies have indicated a normal gene dose for the amyloid precursor protein (APP) in Alzheimer's disease (AD). These findings leave open the possibility that elevated levels of messenger RNA (mRNA) for this protein may contribute to the pathogenesis of AD. Using Northern analysis, we compared the levels of mRNA for the APP and 3 cytoskeletal proteins in parietal cortex of 6 brains having marked AD-type degeneration with the levels of these mRNAs in 6 control samples. The cytoskeletal mRNAs studied were those for the human neurofilament 68-kDa subunit (HNFL), for alpha-tubulin, and for glial fibrillary acidic protein (GFAP). A ribonuclease (RNase) protection assay was also used to compare AD and control HNFL mRNA levels. The mRNAs for APP, HNFL, and alpha-tubulin were diminished in AD cortex. The decrement for APP mRNA was less than that for HNFL or alpha-tubulin. The message for GFAP in AD cortex showed no loss. The findings support a general deficit in neuronal mRNAs, including that for APP. They do not exclude the possibility of elevated levels of the message for the APP in small neuronal subsets, in subcortical neurons projecting to cortex, or as a generalized phenomenon in earlier stages of the disease.     

RNAi对U251细胞c-Met基因表达水平的影响

目的 探讨RAN干扰作用对人脑胶质瘤U251细胞c-Met基因表达的影响。方法 设计3对以c-Met为靶基因短发夹RNA片段,pGenesil-1质粒为载体,构建pGenesil-1/c-Met-shRNA重组质粒,将其转染人脑胶质瘤U251细胞。采用PCR和免疫印迹法分别检测c-Met基因mRNA和蛋白的表达水平。结果 成功构建pGenesil-1-c-Met shRNA重组质粒,并转染至U251细胞。转染重组质粒的U251细胞c-Met基因mRNA和蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）。结论 RNA干扰能明显降低U251细胞c-Met基因mRNA和蛋白的表达水平。     

抑制人BI-1基因表达shRNA重组慢病毒表达载体的构建

背景: 慢病毒介导的RNAi技术以其专一性、抑制效率高、作用持久等优点已广泛应用于基因功能研究中。该技术病毒包装、转染、以及shRNA序列设计都会对抑制效率产生影响。因此实验以人的Bax抑制子1 (BI-1)为目的基因进行RNA干扰实验来探讨其影响因素。 目的：为了利用慢病毒Lentivirus介导的RNAi技术寻找抑制人BI-1基因表达的siRNA。 设计、时间及地点：单一样本观察,于2007-09/2008-12在北京大学医学部基础医学院医学遗传学系完成。 材料：293T细胞、SH-SY5Y细胞为实验室保存;用Ambion公司(www.ambion.com)提供的网络在线工具设计了4个shRNA。 方法：构建带有绿色荧光蛋白(EGFP)标签的、针对人BI-1基因不同区域设计的shRNA重组表达载体,然后与包装蛋白表达载体共转染293T细胞以包装成4种shRNA病毒粒子。通过流式细胞仪检测GFP的表达情况来摸索最佳包装条件。Real-time PCR以β-肌动蛋白mRNA被用作内参,将4种重组病毒和对照组病毒上清液侵染SH-SY5Y,检测内源性BI-1基因的敲低效率,筛选到最佳RNAi有效序列。 主要观察指标：被不同包装病毒侵染的细胞内GFP的表达率。 结果：pLentiLox3.7、rev、vsvg、rre等4质粒包装系统的最佳包装比例为2∶1：1∶1,包装48 h收获的病毒粒子的感染效率最高,并且在包装后的24 h之后换液会提高包装效率。靶定到人BI-1基因-2-17核苷酸(起始编码区域)的shRNA RNA干扰效率最高。能够抑制40%正常基因表达。 结论：实验摸索出Lentivirus介导的RNAi技术病毒包装的重要影响因素。为建立稳定的人BI-1基因表达敲低的神经细胞模型和研究BI-1异常表达参与的神经元凋亡疾病的病理研究打下基础。     

小分子干扰RNA介导RhoA沉默优化骨髓间充质干细胞的培养

以往骨髓间充质干细胞的培养方法存在衰老和分化率低等问题。 目的：检测是否可以通过沉默RhoA基因的方法优化骨髓间充质干细胞培养。 方法：体外培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,经小分子干扰RNA转染以沉默RhoA基因表达,分为3组培养：干细胞组(未转染小分子干扰RNA)、经随机打乱顺序的小分子干扰RNA 转染干细胞组、经小分子干扰RNA 转染的干细胞组。用RT-PCR,Western blot检测骨髓间充质干细胞在转染前后RhoA基因和蛋白的表达。应用细胞生长曲线、MTT比色法观察细胞生长的优化作用,采用流式细胞术测定细胞周期分布的变化。 结果与结论：与干细胞组、经随机打乱顺序的小分子干扰RNA 转染干细胞组比较,经小分子干扰RNA 转染的干细胞组RhoA基因和蛋白表达量明显降低(P < 0.05),细胞的生长速度明显增快,细胞周期G0/G1期减少,S期细胞数增多(P < 0.05)。说明通过沉默RhoA基因的方法可以促进骨髓间充质干细胞增殖,优化培养方法。