乙型肝炎病毒基因疫苗诱导抗体的产生

乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）基因疫苗可打破人群对ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）疫苗免疫无应答或低应答而产生保护性抗体,并有可能成为治疗ＨＢＶ持续性感染的特异性基因治疗剂。我们用构建的ＭＳ２－ｐｒｅＳ表达质粒ｐＭＩＰ、ＩＬ－２－ｐｒｅＳ原核表达质粒ｐＩＩＰ、ＩＬ－２－ｐｒｉＳ真核表达质粒ｐＣＷＩＩＰ产生抗体量高于ｐＭＩＰ（ＳＡＳ统计分析,Ｐ〈０．０１）,这说明ＩＬ－２－ｐｒｅＳ基因疫苗在体内可能有多种生物学     

Cos—7细胞表达IL—2—HBVpreS融合蛋白的免疫原性

为了协同白细胞介素－２和乙型肝炎病毒前Ｓ抗原的多种生物学功能,用基因重组方法将表达ＩＬ－２ｐｒｅＳ质粒ｐＣＷＩＩＰＬＦＮＹＩＶＳ ＯＳ－７细胞。该细胞分泌表达的ＩＬ－２ｐｒｅＳ融合蛋白保留了ＩＬ－２和ｐｒｅＳ抗原天然分子的生物学活性,具有能增强ｐｒｅＳ抗原的免疫原性,产生协同作用,促进机体免疫应答。这可能为ＨＢＶ持续性感染者寻找新的治疗方法提供理论基础与实验依据。     

人白细胞介素2基因转移表达及抗乙型肝炎病毒和诱导LAK细胞活性的研究

为了探讨白细胞介素（ＩＬ）－２转基因表达抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的作用，应用逆转录病毒载体ｐＺＩＰＳｖ（Ｘ）－包装细胞系ＰＡ３１７基因转移系统，研究了人ＩＬ－２ｃＤＮＡ转移和表达，以及抗ＨＢＶ和诱导淋巴因子激活的杀伤细胞（ＬＡＫ细胞）的作用。所构建的人ＩＬ－２重组表达载体ｐＺＩＰｈｕＩＬ－２，以ＤＮＡ－磷酸钙共沉淀技术转染ＰＡ３１７细胞，筛选到Ｇ４１８抗性克隆，分泌假病毒颗粒达１０６ＣＦＵ／ｍｌ。以假病毒颗粒感染２．２．１５细胞系及正常人外周血单个核细胞，分泌ＩＬ－２水平可达６ＩＵ／ｍｌ，明显抑制２．２．１５细胞ＨＢｓＡｇ的分泌表达，与１００ＩＵ／ｍｌ重组的ＩＬ－２一样可诱导出相似的ＬＡＫ细胞活性。而不含ＩＬ－２ｃＤＮＡ的ｐＺＩＰＳＶ（Ｘ）的假病毒颗粒则无此作用。提示逆转录病毒载体。包装细胞系可以成功地实现人ＩＬ－２ｃＤＮＡ的转移和低水平的分泌和表达，并可明显抑制２．２．１５细胞分泌ＨＢｓＡｇ及诱导ＬＡＫ细胞活性。     

反义基因转移表达及抗乙型肝炎病毒的作用

目的观察重组逆转录病毒载体－包装细胞系统介导反义基因转移表达和抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的作用。方法将ＨＢＶａｙｗ１４０２－２９０６片段和２８３９－１９８６片段反向插入重组逆转录病毒载体质粒，分别转染ＰＡ３１７包装细胞，分别感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞和２．２．１５细胞。结果转导的ＮＩＨ３Ｔ３细胞内有ＨＢＶ反义ＲＮＡ转录表达。ＨＢＶ反义基因重组逆转录病毒感染２．２．１５细胞后第３天，表面抗原（ＨＢｓＡｇ）和ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）表达量减少，感染后第５天，ＨＢＶ抗原表达抑制率达高峰。ｐｒｅＳ／Ｓ片段反义基因转移后，ＨＢｓＡｇ表达抑制率为７１％，ＨＢｅＡｇ抑制率为２３％；ｐｒｅＣ／Ｃ片段反义基因转移后，ＨＢ－ｓＡｇ表达抑制率为２３％，ＨＢｅＡｇ抑制率为５９％。结论逆转录病毒载体－包装细胞系统能够介导ＨＢＶ反义基因在真核细胞内转移和表达，并对ＨＢＶ复制和表达均有抑制作用。     

IL—12提高DNA疫苗诱导小鼠抗HBV皮下移植瘤的免疫研究

目的 观察ＩＬ－２真核表达载体（ｐＷＲＧ３１６９）对ＨＢＶ－ＳＤＮＡ疫苗（ｐＣＲ３．１－Ｓ）诱导Ｂａｌｂ／ｃ小鼠（Ｈ－２＾ｄ）的特异性细胞免疫应答及其对稳定表达ＨＢｓＡｇ的小鼠肥大细胞瘤Ｐ８１５细胞（Ｐ８１５－ＨＢＶ－Ｓ）成瘤性的影响。方法肌肉注射ＤＮＡ疫苗,背部皮下接种Ｐ８１５－ＨＢＶ－Ｓ细胞,观察成瘤情况,４ｈ＾５１Ｃｒ释放法检测小鼠脾细胞ＣＴＬ活性。结果 对照组、ｐＣＲ３．１－Ｓ及共同免疫     

白细胞介素-2基因对丙型肝炎病毒E2基因免疫效果的调节作用

目的 研究白细胞介素２（ＩＬ－２）基因对丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）Ｅ２基因免疫小鼠后效果的调节作用。方法 构建Ⅱ型ＨＣＶ Ｅ２基因的真核表达载体ｐ３Ｅ２，免疫组化法检测其在哺乳动物细胞中的表达情况。用ｐ３Ｅ２单独或连同ＩＬ－２真核表达质粒一起对ＢＡＬＢ／ｓ小鼠进行尾部皮下注射，酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）法检测Ｅ２抗体的产生情况。结果 Ｅ２蛋白在哺乳动物细胞中得到瞬时表达。应用ｐ３Ｅ２单独或连同ＩＬ     

体外检测近交系小鼠HBsAg特异性细胞毒T淋巴细胞方法的建立

通过磷酸钙法用含ＨＢＶＳ基因的质粒ｐＲｃ／ＣＭＶＳ与含筛选标记基因－ｎｅｏ基因的质粒ｐＳＶ２－ｎｅｏ对ＢＡＬＢ／Ｃ近交系小鼠肥大细胞瘤细胞株Ｐ８１５细胞进行了质粒共转染，并经Ｇ４１８筛选得到了Ｇ４１８抗性细胞，即Ｐ８１５－Ｓ细胞，斑点杂交和免疫组化实验分别证实Ｐ８１５－Ｓ细胞内有ＨＢＶＳ基因的存在；Ｐ８１５－Ｓ细胞浆内和膜上有ＨＢｓＡｇ的表达。表明了Ｐ８１５－Ｓ细胞要作为体外检测ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠Ｈ     

细胞因子对HCV基因疫苗诱生免疫反应的增强作用

目的 探讨细胞因子对丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心（Ｃ）基因疫苗诱生免疫应答强度的增强作用。方法 将包含ＨＣＶ－Ｃ蛋白的基因片段插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３中,构建重组质料ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ,将此重组质粒单独或与包含鼠ＩＬ－２或ＩＬ－１２基因的表达质粒共免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,ＥＬＩＳＡ法检测ＨＣＶ Ｃ特异性抗体产生情况,以ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ转梁小鼠ＳＰ２／０细胞,表达ＨＣＶ Ｃ抗原为靶细胞,进行     

HCV E2和HBV preS融合蛋白真核表达载体的构建及在哺乳动物细胞 …

目的 构建丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）Ｅ２和乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）ｐｒｅＳ融合蛋白的真核表达载体。方法 用ＰＣＲ方法扩增ＨＢＶｐｒｅＳ和ＨＣＶＥ２蛋白基因,并将二者克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３中,用脂质体转染试剂将其转入ＣＯＳ７细胞,通过免疫荧光检测细胞瞬时表达的融合蛋白,结果Ｅ２－ｐｒｅＳ融合蛋白基因包括了全长的ＨＢＶｐｒｅＳ和ＨＣＶＥ２蛋白基因,嵌合基因长度约１．６ｋｂ表达载体在ＣＯＳ７细胞表达出     

Cos - 7 细胞表达 I L- 2 - H B Vpre S 融合蛋白的免疫原性

为了协同白细胞介素－ ２（ Ｉ Ｌ－ ２） 和乙型肝炎病毒（ Ｈ Ｂ Ｖ） 前 Ｓ 抗原（ｐｒｅ Ｓ） 的多种生物学功能,用基因重组方法将表达 Ｉ Ｌ－ ２ｐｒｅ Ｓ 的质粒ｐ Ｃ Ｗ Ｉ Ｉ Ｐ 转染 Ｃｏｓ － ７ 细胞。该细胞分泌表达的 Ｉ Ｌ－ ２ｐｒｅ Ｓ 融合蛋白保留了 Ｉ Ｌ－ ２ 和ｐｒｅ Ｓ 抗原天然分子的生物学活性,且能增强ｐｒｅ Ｓ 抗原的免疫原性,产生协同作用,促进机体免疫应答。这可能为 Ｈ Ｂ Ｖ 持续性感染者寻找新的治疗方法提供理论基础与实验依据。     

表达HBV的SMMC-7721人肝癌细胞系模型的建立

目的：建立表达ＨＢＶ的体外培养的细胞克隆，为研究ＨＢＶ的生物学性状提供良好的细胞模型。方法：将３．２ｋｂＨＢＶ ＤＮＡ插入携带新霉素抗药基因的真核细胞表达载体ｐＣＮＣＸ，应用磷酸钙沉淀技术将其导入体外培养的ＳＭＭＣ－７７２１人肝癌细胞系。结果：成功地获得表达ＨＢｓＡｇ和ＨＢｅＡｇ的细胞克隆。结论：应用磷酸钙沉淀技术将ＨＢＶ ＤＮＡ导入体外培养的细胞克隆，获得能表达ＨＢＶ的细胞克隆，为研究ＨＢＶ表达     

体外检测近交系小鼠HBsAg特异性细胞毒T淋巴细胞方法的建立

通过磷酸钙法用含ＨＢＶＳ基因的质粒ｐＲｃ／ＣＭＶＳ与含筛选标记基因—ｎｅｏｒ基因的质粒ｐＳＶ２ｎｅｏ对ＢＡＬＢ／Ｃ近交系小鼠肥大细胞瘤细胞株—Ｐ８１５细胞进行了质粒共转染，并经Ｇ４１８筛选得到了Ｇ４１８抗性细胞，即Ｐ８１５Ｓ细胞。斑点杂交和免疫组化实验分别证实Ｐ８１５Ｓ细胞内有ＨＢＶＳ基因的存在；Ｐ８１５Ｓ细胞浆内和膜上有ＨＢｓＡｇ的表达。表明了Ｐ８１５Ｓ细胞可作为体外检测ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠ＨＢｓＡｇ特异性ＣＴＬ的靶细胞。进一步对Ｐ８１５Ｓ细胞成功地进行５１Ｃｒ标记，以及标记靶细胞５１Ｃｒ最大释放值和自然释放值的测定表明：利用５１Ｃｒ释放法体外检测近交系小鼠（ＢＡＬＢ／Ｃ）ＨＢｓＡｇ特异性ＣＴＬ功能的方法被建立。     

HBV中片段表面抗原及E抗原真核表达质粒的构建与体外表达

目的 构建乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）中片段表面抗原真核表达质粒和Ｅ抗原真核表达闰。方法 将编码ＨＢＶ中片段表面抗原（ｐｒｅＳ２＋Ｓ）的基因片段和Ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ＿的基因片段分别插入真核细胞表达载体（ｐＪＷ４３０３）中,构建成的重组体经筛选鉴定后,再转染哺乳动物细胞,检测表达产物。结果 电泳鉴定显示目的基因片段正确插入了表达载体。经筛选、纯化的阳性克隆转染哺乳动物细胞后可表达ｐｒｅＳ２＋Ｓ和ＨＢｅＡｇ     

重组质粒DNA—抗原—抗体复合物诱生乙型肝炎表面抗体的研究

本文研究了高编码乙型肝炎病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）基因的重组质粒ＤＮＡ（ｐＣＭＶ－ＨＢｓ）对ＨＢｓＡｇ，抗．ＨＢｓ免疫复合物（ＩＣ）诱生抗－ＨＢｓ的影响，在Ｂａｌｂ／ｃ小鼠中，ＩＣ加ｐＣＭＶ－ＨＢｓ（１００μｇ）免疫组比单独使用ＩＣ或ｐＣＭＶ－ＨＢｓＤＮＡ缚诱生的抗－ＨＢｓ效价高，虽然略低于ＩＣ加氢氧化铝组，但无明显差异，在ＩＣ中加２０μｇｐＣＭＶ－ＨＢｓＤＮＡ，经再次免疫亦可有效地诱生高效价的抗     

原发性肝癌中 HBV X、S、Pre-S、C 基因片段整合与 ras、myc 癌基因表达的关系

用地高辛标记的ＨＢＶ基因组探针检测了６６例肝细胞性肝癌（ＨＣＣ）中ＨＢＶ的存在状态，从中筛选出３２例仅有ＨＢＶＤＮＡ整合的ＨＣＣ作为研究对象，进一步检测了ＨＢＶＸ基因、Ｓ基因、Ｐｒｅ－Ｓ、Ｃ基因ＤＮＡ片段的整合情况，并探讨了ＨＢＶ４种基因亚片段整合与ｒａｓ、ｍｙｃ癌基因表达的关系。结果显示，ＨＢＶＸ、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ和Ｃ基因片段的整合率分别为８７．５％（２８／３２）、６２．５％（２０／３２）、６２．５％（２０／３２）和２５．０％（８／３２）。ｐ２１ｒａｓ、ｐ６２ｍｙｃ在ＨＣＣ中的表达率分别为５０．０％（２０／４０）、８１．２％（２６／３２）。通过对ＨＣＣ中４种ＨＢＶ基因片段整合与ｐ２１ｒａｓ、ｐ６２ｍｙｃ表达之间关系的研究，显示ｐ６２ｍｙｃ的表达与ＨＢＶＸ、Ｐｒｅ－Ｓ基因整合关系密切，ｐ２１ｒａｓ的表达则主要与ＨＢＶＸ基因整合有关（Ｐ＜０．０５）。提示ＨＢＶＸ、Ｐｒｅ－ＳＤＮＡ片段在宿主细胞染色体上的整合可能直接或通过其蛋白启动ｍｙｃ和（或）ｒａｓ癌基因的表达。     

胎儿LAK／IL—2治疗长期HBV无症状携带者的临床研究

应用儿脾ＬＡＫ细胞，配合ｒＩＬ－２和ｒＩＦＮ－γ治疗８例长期ＨＢＶ无症状携带者，结果表明：有７５％（６／８）的患者ＨＢｅＡｇ转阴，其中有２５％（２／８）的患者ＨＢｅＡｇ和ＨＢｓＡｇ均转阴，治疗后ＣＤ＾＋８Ｔ细胞稍有增高，Ｔａｃ抗原比治疗前和对照组均显著增高，血ｓＩＬ－２Ｒ，ＩＬ－８和ＮＴＦ－α治疗后均显著增高。     

原发性肝细胞癌p53基因突变检测

为了解在黄曲霉毒素Ｂ１（ＡＦＢ１）低含量区以ＨＢＶ为主要危险因素的ＨＣＣｐ５３基因突变情况，并分析它与ＨＢＶ及其它因素的关系，作者筛检了成都地区３２例原发性肝癌（ＨＣＣ），分别应用ＰＣＲ－ＲＦＬＰＳｏｕｔｈｅｒｎ吸印杂交及免疫组化染色法检测了３２例ＨＣＣ及２７份癌旁肝组织中ｐ５３基因突变、ＨＢＶＤＮＡ整合及ＨＢｓＡｇ表达。结果：所有ＨＣＣ病例均感染过ＨＢＶ，肝癌细胞中ＨＢＶＤＮＡ整合率７１．９％，癌旁组织均有肝硬化或／和慢活肝病变，且ＨＢｓＡｇ表达率９６．３％。３２例ＨＣＣ中检出８例Ｐ５３蛋白阳性（２５％），这种改变与ＨＢＶＤＮＡ整合及ＨＢｓＡｇ表达无明显关系，而与ＨＣＣ发生年龄有关；３２例ＨＣＣ组织中有２例ｐ５３基因第２４９号编码子突变（６．２５％），明显低于ＡＦＢ１高含量区ＨＣＣ，而与台湾、日本等ＡＦＢ１低含量区报道一致，提示：成都地区ＨＣＣ与ＨＢＶ感染确有密切关系；ｐ５３改变在ＨＣＣ发生上有一定作用，但是多数ＨＣＣ并无ｐ５３基因突变又提示ＨＣＣ发生尚涉及其它复杂机制；ＨＢＶ在ＨＣＣｐ５３基因改变中的作用机制值得进一步探索。     

乙型肝炎病毒前S1抗原（1—42）与核心抗原（1—144）在大肠？…

目的 希望通过融合表达乙型肝炎病毒前Ｓ１抗原（ｐｒｅＳ１Ａｇ）（１－４２）及核心抗原（ＨＢｅＡｇ）（１－１４４）提高预防性疫苗的细胞免疫活性,为开发ＨＢ治疗性疫苗探索一条有效途径。方法 采用ＰＣＲ法获得在ＨＢｅＡｇ（１－１４４）基因后连接ＰｒｅＳ１Ａｇ（１－４２）基因的融合基因,然后将其插入表达载体ｐＥＴ－１１ｄ中,在大肠杆菌中进行表达。结果 获得了ＨＢｅＡｇ（１－１４４）、ｐｒｅＳ１Ａｇ（１－４     

重组人单链白细胞介素12融合基因（rhscIL—12）的构建和真？…

目的 克隆人ＩＬ－１２（ｈＩＬ－１２）ｐ４０和ｐ３５亚单位ｃＤＮＡ，构建人单链ＩＬ－２（ｒｈｓｃＩＬ－２）融合基因，并在哺乳动物细胞中进行表达。方法从经ＰＤＢｕ刺激的ＥＢＶ转化的人Ｂ淋巴细胞株ＮＣ３７中提取ｍＲＮＡ，经ＲＴ－ＰＣＲ分别获得ｈＩＬ－１２ｐ４０和ｐ３５亚单位编码序列的ｃＤＮＡ，运用重组ＰＣＲ技术将两段基因通过一疏水性多肽接头（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ＤＮＡ序列进行体外基因重组，构建ｒｈｓｃＩ     

乙型和丙型肝炎重叠感染患者肝组织免疫组织化学双标记研究

探讨丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）和乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）重叠感染患者肝组织中病毒的复制状况和相互关系。方法采用免疫组织化学双标记技术，以抗－ＨＣＶＮＳ３、抗－ＨＣＶＮＳ５单克隆抗体和抗－ＨＢｓ、抗－ＨＢｃ多克隆抗体，检测２５例尸检肝组织中ＨＣＶＡｇ和ＨＢＶＡｇ的分布和表达。结果ＨＢ－ｓＡｇ和ＨＣＶＮＳ３Ａｇ同时阳性１１例，ＨＢｓＡｇ和ＮＳ５Ａｇ阳性１２例，ＨＢｃＡｇ和ＨＣＶＮＳ３Ａｇ及ＨＣＶＮＳ５Ａｇ阳性各１０例。几乎所有单标记染色阳性切片，其双标记染色也阳性。感染ＨＣＶ或ＨＢＶ的肝细胞各呈灶性、散在或弥散混杂分布，在重叠感染肝组织中，与ＨＢＶ复制有关的表达类型，如ＨＢｓＡｇ膜、浆型和ＨＢｃＡｇ浆型以及ＨＣＶＮＳ３Ａｇ和ＨＣＶＮＳ５Ａｇ的检出例数，同单纯感染组相比差异无显著意义（χ２＝０．１５４及０．１９８，Ｐ＞０．０５）。结论乙型和丙型肝炎病毒在重叠感染时，两种病毒在肝组织内可能不存在互相干扰和抑制。