5种疟原虫红内期可溶性蛋白质图谱比较

目的　比较 5种疟原虫 (间日疟原虫、恶性疟原虫、食蟹猴疟原虫、约氏疟原虫、伯氏疟原虫 )红内期可溶性蛋白电泳图谱。方法　用 1%NP - 40提取 5种疟原虫红内期可溶性蛋白组分。各种蛋白提取物经十二烷基硫酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS -PAGE)后氨银染色 ,所得蛋白图谱经光密度扫描进行分析。结果　 5种疟原虫蛋白区带波峰位置和大小各不相同 ,显示较大差异。但有两个区带为 5种疟原虫共有区带 ,其分子量分别为 72KD和6 4KD。在 5种疟原虫中 ,以伯氏疟原虫与约氏疟原虫蛋白区带相似性最高。结论　 5种疟原虫红内期蛋白组分差异较大 ,伯氏疟原虫与约氏疟原虫种间进化关系较接近     

用双夹心斑点免疫金银染色法检测病人血中疟疾循环抗原

应用抗间日疟原虫和抗恶性疟原虫红内期抗原单克隆抗体建立了双夹心斑点免疫金银染色法和双夹心免疫酶斑点法并用于检测间日疟和恶性疟患者血清中循环抗原。共检测20份间日疟血清和15份恶性疟血清,双夹心斑点免疫金银染色法阳性率分别为90％和93％,可检出最低原虫密度为0.0009％;双夹心免疫酶斑点法阳性率分别为85％和87％,可检出最低原虫密度为0。0075％。与包虫病。弓形虫病和乙肝表面抗原阳性血清无交叉反应,检测60份健康献血员血清,两法分别有5％和8％假阳性。初步结果提示双夹心斑点免疫金银染色法检测疟疾循环抗原敏感度较高,若经过适当改进,有可能用于疟疾现场诊断和流行病学调查。     

疟原虫实验课教学的体会

寄生人体的疟原虫共有4种,即间日疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原原虫,均属细胞内寄生(或寄生于人体肝细胞和红细胞内),体积小.     

间日疟原虫MSP1 C重组蛋白的制备及其在血清学诊断中的应用

目的在大肠埃希菌（E，coli）中表达、纯化间日疟原虫裂殖子表面蛋1C端重组蛋白（rGST—PvMSP1C）作为诊断抗原，评价其在间日疟血清学诊断中的应用价值。方法将含有重组质粒pGEX-4T-2／PvMSP1C的工程菌E．coil BL21（DE3）以IPTG进行诱导表达，表达产物以SDS—PAGE与Western—blot免疫印迹进行鉴定；采用GST融合蛋白层析柱进行分离纯化；以纯化重组蛋白包被酶标板，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测间日疟患者血清中的特异性IgG抗体。结果含有重组质粒pGEX-4T-2／PvMSP1C工程菌经IPTG诱导表达的rGST—PvMSP1C重组蛋白大小约63ku，能够被间日疟患者的血清所识别。纯化的重组蛋白SDS—PAGE电泳显示一条预期大小的蛋白条带；以重组蛋白作诊断抗原，67份镜检阳性的间日患者血清标本ELISA均为阳性。55份健康人血清ELISA均为阴性．5份恶性疟患者血清及7份血吸虫患者血清检测结果亦为阴性。结论在大肠埃希菌中表达纯化的间日疟原虫rGST—PvMSP1C蛋白具有免疫反应性，以其作为诊断抗原建立的血清中特异性IgG抗体ELISA检测方法具有良好敏感性和特异性，在间日疟的免疫学诊断中具有一定的推广使用价值。     

疟原虫核酸检测技术建立及在献血员筛查应用的研究

目的建立血液中疟原虫检测的核酸技术，探讨应用于献血员筛查的效果。方法根据红细胞内期疟原虫ssurRNA编码基因序列，设计合成三条扩增引物。将5份待检血样混合，采用蛋白酶K消化裂解法制备模板，在同一反应体系中扩增恶性疟原虫和间日疟原虫DNA，诊断鉴别恶性疟和间日疟。与厚血膜镜检法比较评价其灵敏度及特异性。结果将3份恶性疟原虫及10份间日疟原虫感染者的血样随机混入5000份无偿献血者血样中，每5份为一个检测单元，采用PCR方法从感染血样中扩增出分别为436bp和341bp的恶性疟原虫及间日疟原虫特异性的DNA片段，并经序列测定证实扩增片段的正确性；10份间日疟患者血样以及3份恶性疟患者血样均被检出，献血者血样PCR检测结果均为阴性，结果与厚血膜方法完全一致。结论所建立的疟原虫核酸检测技术灵敏度高、特异性好，且可以批量处理，提高了检测的效率，能有效降低疟原虫的输血传播，具有很好的推广使用价值。     

间接血凝试验在疟疾患者中的试用及间日疟患者血清IgG、IgM含量测定

本文报导用诺氏疟原虫制备的可溶性抗原以间接血凝试验检测111例恶性疟患者,阳性率为62.2％。正常人对照阳性率为9.2％。用间日疟原虫制备的抗原检测间日疟病人阳性率为50％。对间日疟患者进行IgM(106例)、IgG(73例)含量测定,结果均较正常人为高。     

彝良县重点疟区乡镇十年发热病人疟原虫血检调查

1996年一2005年在彝良县间日疟流行的牛街、洛旺、柳溪等重点疟区乡镇,进行发热病人疟原虫血检监测十年,监测结果血检当地无外出史发热病人12579例,检出间日疟疟原虫阳性77例,阳性率为0.61％;血检当地居民外出打工回归的发热病人610例,检出疟原虫阳性病例66例(间日疟63例,恶性疟3例),阳性率为10.82％。提示,当地居民外出感染回归发病的疟疾病例已占当地疟疾疫情总数的46.15％,流动人群疟疾管理问题不可忽视。     

自制免疫层析试剂盒检测恶性疟原虫HRP-Ⅱ抗原的评价

目的对自制免疫层析试剂盒检测恶性疟原虫富组氨酸蛋白Ⅱ（HRP—Ⅱ）的敏感性、特异性、稳定性等技术参数进行评价，为试剂盒的临床应用提供科学依据。方法对试剂盒的敏感性、特异性、灵敏度、精密度、稳定性等性能指标进行测定，并与国外的同类试剂盒进行比较研究。结果自制试剂盒操作简便．反应快速；以血涂片显微镜检查为金标准，对49例恶性疟血样、30例间日疟血样、43例正常人血样检测的敏感性为98％，特异性为100％；对恶性疟原虫血样的最小检出量为原虫密度0．01％，对重组HRP—Ⅱ蛋白的最小检出量为10ng／ml；试剂盒精密度和稳定性均较好；各项性能指标相当或优于国外同类试剂盒。结论自行研制的恶性疟原虫免疫层析检测试剂盒测定结果较为准确、稳定和可靠，适用于恶性疟的快速诊断、流行病学筛查、疟区献血员筛查及过境边民筛查。     

应用双重PCR检测海南疟区发热病人的效果

目的 评价双重PCR检测疟区发热病人的效果。方法 对疟区求诊发热病人，手指取血分别制作厚薄血膜片和滤纸血斑作为检测血样。参照献用恶性疟原虫PF1－2和间日疟原虫PV3－5为特异性引物，同在一个反应体系常规进行PCR，扩增片段分别为206bp和431bp。同时镜检厚血膜作对照。结果 该反应体系最低可检出原虫血症为1个恶性疟原虫／μl血和10个间日疟原虫／μl血的感染；检测132例疟区发热病人血样的阳性率为65．1％，而镜检法为64．4％，且有1例漏诊和3例误诊，两法符合率为97％。结论 双重PCR用于疟区发热病人检测，较镜检敏感、特异，适合我国恶性疟与间日疟混合流行区的疟疾诊断，还可用于血检质量的监控。     

间日疟原虫醛缩酶的克隆、表达与初步鉴定

目的:克隆间日疟原虫醛缩酶(Plasmodium vivax aldolase,PvALD)基因,体外表达和鉴定重组PvALD蛋白。方法:PCR法从间日疟患者血液DNA样品中扩增PvALD基因,构建pET32c-PvALD重组表达质粒,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3+),诱导表达带有His标签的重组蛋白,并对PvALD在E.coli中表达进行优化,观察诱导时间、诱导剂浓度、培养基种类对该蛋白原核表达的影响。采用镍柱亲和层析纯化重组蛋白,相应表达物分别采用SDS-PAGE电泳和Western blot进行分析鉴定。结果:PvALD的PCR产物分子量为1.1 kb,重组质粒pET32c-PvALD经测序验证,其插入片段序列与GenBank参考序列相似性为100%,转化E.coli所表达的重组蛋白分子量约为60 kD。PvALD在LB中1 mmol/L IPTG诱导6 h条件下获得最佳的表达效果。亲和层析纯化后的PvALD经SDS-PAGE电泳检测,呈现单一条带,Western blot分析结果显示,该重组蛋白只能被间日疟患者血清特异性识别,而不能被恶性疟患者血清识别。结论:成功克隆了PvALD基因,表达了重组PvALD蛋白,为以PvALD作为靶标的间日疟快速诊断方法提供了基础。     

Antigenic variation and cytoadherence of PfEMP1 of Plasmodium falciparum-infected erythrocyte from malaria patients

Objective To approve a theoretical basis for the molecular pathogenesis of human cerebral malaria and treatment with prevention.Methods The blood samples were collected from 24 patients with cerebral malaria, 143 wit h falciparum malaria, 34 with vivax malaria and 20 healthy controls from the end emic areas of Yunnan Province, China. Using the sodium dodecyl sulfate-polya crylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) technique, we determined the molecular mass (Mr) of these Plasmodium falciparum (P. falciparum) erythrocyte membr ane protein 1 (PfEMP1) molecules. Results Our findings indicate that higher molecular mass (260 kDa-320 kDa) forms of Pf E MP1 were expressed on parasitized erythrocyte (PE) from human cerebral malaria p a tients. Compared with PfEMP1 expressed on PE from human cerebral malaria patien ts, the expression of PfEMP1 and Plasmodium vivax (P. vivax) erythrocyte me mbrane protein 1 (PvEMP1) on PE from falciparum malaria patients and vivax malar ia patients did not have multiple bands of PfEMP1 of ≥260 kDa, but had a PfEMP 1 with molecular mass of 240 kDa and a PvEMP1 with molecular mass of 180 kDa b and separately. Healthy controls expressed an EMP of molecular mass of 140 k Da.Conclusion Results confirm the antigenic variation of higher molecular mass of PfEMP1 whos e molecular mass is equal to or exceeds 260 kDa-320 kDa on PE of patients with cerebral malaria. Our results show that the binding of large antigenic variabi lity PfEMP1 molecular mass of 260 kDa-320 kDa on PE from human cerebral malari a patients with diverse receptor molecules on the endothelial cell (EC) of the c erebral microvessels may be involved in the molecular pathogenesis of cerebral m alaria.     

恶性疟原虫青蒿素抗性相关k13基因及其C-末端功能域的克隆及表达

目的探索在大肠埃希菌中表达恶性疟原虫青蒿素抗性相关基因k13及其C-末端propeller结构域,为后续蛋白结构分析及青蒿素抗性机制等功能研究奠定基础。方法以恶性疟原虫基因组DNA为模板、PCR扩增k13及其C-末端基因片段并分别克隆至pET-28a载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-dthiogalactoside,IPTG)诱导,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和Western blot检测重组蛋白的表达。再分别用恶性疟和间日疟患者血清进行重组蛋白rK13和rK13-propeller的Western blot检测。结果 PCR扩增得到全长k13基因和k13-propeller片段,并构建了重组质粒pET-28a-k13和pET-28a-k13-propeller。SDS-PAGE电泳和Western blot检测表明,两重组蛋白均表达,且重组蛋白rK13可与恶性疟患者血清反应,rK13-propeller既可与恶性疟又可与间日疟患者血清反应。结论利用原核表达系统成功表达重组蛋白rK13和rK13-propeller,两重组蛋白能够与疟疾患者血清反应,且与不同种疟疾的患者血清反应的特异性有所不同。     

Serological cross-reactivities between the retroviruses HIV and HTLV-1 and the malaria parasite Plasmodium falciparum

Serum samples from three populations of Papua New Guinea, where Plasmodium falciparum malaria and human T-lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) are coendemic at high prevalence rates, showed statistically significant ELISA co-seropositivity and co-seronegativity. Cross-reactivity was further indicated by the presence of 10 bands ranging from 134 kDa to 18 kDa on immunoblots of electrophoresed whole lysate P. falciparum antigen against serum of HTLV-1 seropositive patients from an area where malaria is not present. Similarly, sera from patients positive for human immunodeficiency virus (HIV) from a non-malarious region produced immunoblot bands ranging from 134 kDa to 33 kDa to the P. falciparum antigen. The HTLV-1 and HIV serum samples yielded a number of immunoblot bands when reacted to an electrophoresed human O type red cell membrane antigen, but those bands had no identity to the cross-reactive bands on the P. falciparum antigen immunoblots. Malaria-positive sera from Papua New Guinean subjects presumed to be uninfected with HIV produced a variety of bands, some of intense prominence, to HIV antigen on diagnostic Western blots.     

红内期间日疟原虫浓集纯化及免疫反应性研究

目的：建立白细胞滤器（Plasmodipur）联合Percoll密度梯度离心浓集纯化红内期间日疟原虫（P.v）的方法。分析和比较皂素与冻融两种处理方法制备的P.v抗原与P.v感染者混合血清免疫反应性的差别。方法：P.v感染者血样,用Plasmodipur滤器分离去除白细胞,经60%Percoll浓集其中的感染红细胞（iRBC）。采用皂素法和冻融法从iRBC中释放疟原虫,经超声粉碎,所获P.v可溶性抗原和同样处理的正常红细胞（nRBC）成分经SDS-PAGE电泳分析其组分差别,并应用P.v感染者、正常对照混合血清与相应的抗原进行免疫印迹分析,确定具有免疫原性的抗原组分。结果：115例P.v感染者血样,用Plasmodipur滤器分离去除白细胞,每10个油镜视野中WBC残留≤5个99例（86.1%）,经60%Percoll浓集的35例样本中,共有30例（85.7%）能提高iRBC比例至60%以上。SDS-PAGE电泳分析,皂素处理与冻融处理的P.v抗原分别显示出6条和2条P.v特异性蛋白条带。免疫印迹分析表明,P.v感染者混合血清能特异性地识别22、24.5、29、35、36 kDa皂素处理的P.v抗原,26、49、59、63、115、120 kDa冻融处理的P.v抗原。结论：血样中疟原虫皂素与冻融两种处理方法制备的P.v抗原与P.v感染者混合血清免疫反应性存在明显差异,其中皂素处理的22 kDa抗原组分具有较强的免疫原性,其作为P.v特异性诊断抗原的价值有待进一步研究。     

疟疾双重PCR检测方法的建立和初步应用研究

目的 建立一种适合于我国恶性疟、间日疟和两混合感染地区,一次性检测人体内或蚊体内的恶性疟原虫(P.f.)和间日疟原虫(P.v,)的双重聚合酶链反应(PCR)法。方法 根据疟原虫红内期SSUrRNA基因特定片段,设计合成3条寡核苷酸特异引物,在一个反应体系中,同时检测P.f．与P．v.的双重PCR技术,操作方法按PCR常规。结果 从P.f.和P．v．感染血样中,分别扩增出274bp和412bp的特异片段,检出水平达1-5个虫／μl血,而人基因组DNA、约氏疟原虫、伯氏疟原虫均未见扩增条带;但食蟹猴疟原虫(P．c,)与P.v．相似,在412bp可见扩增条带。经对采自不同疟区发热待查病人的滤纸干血滴和确诊疟疾病人的静脉血检测,344例血样中,检出阴性112例、P.f．109例、P.v.l114例、P．f. P.v.9例,阳性率67．4％;比常规镜检的阳性率66．3％稍高,尤以检出P．f． P．v．感染病例高。分别检测人工感染P.f．与P.v.各10只大劣按蚊的阳性唾腺,均被检出同种的阳性结果。结论一次性检测P．f.DNA与P.v.DNA的双重PCR法,敏感性高,特异性强,稳定性好,具有简化操作、提高工效、降低耗费的优点。对发热待查病人诊断和蚊媒感染疟原虫调查,以及疟疾病原学的检测质控方面,均有实用价值。     

抗恶性疟McAb的筛选与恶性疟免疫诊断研究

用单克隆抗体(McAb)夹心斑点免疫金银染色法(Dot-IGSSA)对11株抗恶性疟McAbs和4株抗食蟹猴疟原虫McAbs进行了筛选,其中McAbs11G5、13A2、13A1可包被到硝酸纤维素膜(NcF)上作为捕获抗体,McAb14D9可用于胶体金探针的标记。此外,为增加胶体金的标记效果和胶体金标记McAb14D9探针的敏感性,还对McAb14D9的等电点(pI)进行了测定,其pI为6.35。同时用筛选出的最佳McAbs对10份恶性疟病人感染血和10份健康人血样品进行了检测,并对这几株McAbs的交叉反应性进行了测定,结果表明McAbs11G5、13A1与14D9夹心时,对云南株和安微株恶性疟原虫红内期抗原呈现交叉反应,而且McAb13A1与14D9夹心时还可以用于检测间日疟抗原。     

紫外线照射日本血吸虫尾蚴疫苗保护性抗原的筛选

目的：分析经紫外线照射处理后日本血吸虫尾蚴蛋白的差异性表达，并从中筛选出有效的保护性抗原组分。方法：收集尾蚴，制备抗原，进行SDS-PAGE电泳后，转印至硝酸纤维素膜上，与照射尾蚴免疫血清和正常感染血清分别进行免疫印渍(Western blot)试验，比较两反应条带的差异性，筛选出惟有免疫血清所能识别的特有的抗原组分，并测定其分子量。结果：在童虫抗原中发现一条能被免疫血清所识别的特异性抗原条带，并测得其分子量为75kDa。结论：紫外线照射致弱尾蚴可诱导宿主产生特异性抗体，被该抗体所识别的抗原分子量为75kDa。