LacZ基因在体内外骨骼肌中的表达

采用ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导基因转移技术，将含有大肠杆菌β－半乳糖苷酶的结构基因（ＬａｃＺ基因）及Ｒｏｕｓ肉瘤病毒启动子的质粒（ｐＲＳＶ－ＬａｃＺ）导入体外培养的大鼠原代骨骼肌内；另外，分别将具有ＲＳＶ启动子和巨细胞病毒ＣＭＶ启动子的ＬａｃＺ基因直接注射到活体小鼠肌肉组织内。经转染的体外培养骨胳肌细胞和取自活体的肌肉组织切片行Ｘ－ｇａｌ组织化学检测以判断ＬａｃＺ基因的表达情况。实验结果证明，用ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导的骨胳肌基因转染率约为１０％～２０％。直接肌肉注射含有不同启动子的ＬａｃＺ基因后，肌细胞内均有该基因表达。结果表明，无论在体内或体外，骨骼肌细胞均能被外源性基因所转染并能表达该报告基因。因此，有望使用经遗传工程改造的骨胳肌细胞作为体细胞基因治疗的有效运载细胞。     

腺病毒载体基因转移系统的建立及其在脑肿瘤中的高效表达

构建了含有ＣＭＶ启动子调控的ＨＳＶ－ｔｋ基因的重组质粒ｐＡｄＣＭＶｔｋ将其与缺陷型腺病毒Ａｄ５大框架ｐＪＭ１７－一起共转染病毒包装细胞２９３细胞，获得有感染能力但复制缺陷在得组腺病毒ＡｄＣＭＶｔｋ，以其感染大鼠Ｃ６脑胶质瘤细胞后用ＰＣＲ方法证实ＨＳＶ－ｔｋ基因能被腺病毒有效转入靶细胞，用带报告基因ＬａｃＺ的腺病毒感染大鼠Ｃ５脑胶质瘤细胞，经ｘ－ｇａｌ染色，证明腺病毒载体的基因转移效率可达１００％。     

重组人β—防御素基因在COS—7细胞的转染表达

为探索建立持续稳定表达ｈＢＤ－２的哺乳类动物工程细胞的可能性,作者研究构建真核重组表达载体ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ／ｈＢＣ－２以进行ＣＯＳ－７细胞转染表达实验。将本室克隆获得的ｈＢＤ－２全长ｃＤＮＡ片段插入带有报告基因的真核表达质粒ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ构建出ｈＢＤ－２的重组表达载体ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ／ｈＢＤ－２,并经ＤＮＡ测序证明ｈＢＤ－２ｃＤＮＡ片段的插入方向和其全长ｃＤＮＡ的碱基组成顺序均准确无误。通过脂质体转染法将ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ／ｈＢＤ－２导入ＣＯＳ－７细胞。ＲＴ－ＰＣＲ法和免疫印迹法分别从ｍＲＮＡ水平和蛋白质水平检测到被转染的ＣＯＳ－７细胞系能有效表达ｈＢＤ－２。     

BQ＿（123）－多聚赖氨酸携载β－半乳糖苷酶基因向血管平滑肌细胞的靶向导入

本研究连接合成了ＢＱ１２３－多聚赖氨酸（ＢＰ）利用ＢＱ１２３对血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）膜表面内皮素Ａ型受体（ＥＴＡ）的高度选择性和多聚赖氨酸对ＤＮＡ的强吸附作用，以ＢＰ携载含有β－半乳糖苷酶（β－ＬａｃＺ）基因的表达质粒ｐＳＶ－β－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（ｐＳＶ－β－ＬａｃＺ）对培养的ＶＳＭＣ和内皮细胞（ＥＣ）转移基因。结果表明，ＢＰ具有向ＶＳＭＣ转基因性能，且依赖与靶细胞表面ＥＴＡ的结合。     

TNF,IFN,MHCⅠ类分子基因“正反馈”式放大表达的重组腺病毒载体

目的：为使外源性 Ｔ Ｎ Ｆ, Ｉ Ｆ Ｎ 基因和内源性主要组织相容性复合物Ⅰ类（ Ｍ Ｈ ＣⅠ）分子基因表达呈现“正反馈”式放大效 应,构建在 Ｈ Ｌ Ａ Ｂ７ 启动子调控、 Ｉ Ｒ Ｅ Ｓ连接下协同表达 Ｔ Ｎ Ｆα和 Ｉ Ｆ Ｎβ基因的重组腺病毒载体。方法和结果：从ｐ Ｇ Ｌ３ Ｂ７ Ｔ Ｎ Ｆ及ｐ Ｉ Ｒ Ｉ Ｆ中切下 Ｂ７ｐｒｏ Ｔ Ｎ Ｆ和 Ｉ Ｒ Ｅ Ｓ Ｉ Ｆ Ｎβ基因片段,先后插入ｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｓｋ （＋ ）, 构建成ｐ Ｂ Ｌ Ｂ７ Ｔ Ｎ Ｉ Ｒ Ｉ Ｆ。回收 Ｔ Ｎ Ｆα Ｉ Ｒ Ｅ Ｓ Ｉ Ｆ Ｎβ基因片段,连入 Ａｄ Ｃ Ｍ Ｖ Ｌｉｎｋ１ 中,构建成 Ｃ Ｍ Ｖ 启动子驱动表达的 Ａｄ Ｃ Ｍ Ｖ Ｔ Ｎ Ｉ Ｒ Ｉ Ｆ（＋ ）。回收 Ｂ７ｐｒｏ Ｔ Ｎ Ｆ Ｉ Ｒ Ｅ Ｓ Ｉ Ｆ Ｎβ基因片段,连入缺失 Ｅ１ 和 Ｅ３ 区及启动子的 Ａｄ ＢｇｌⅡ中, 构建成 Ｈ Ｌ Ａ Ｂ７ 启动子驱动表达的 Ａｄ Ｂ７ Ｔ Ｎ Ｉ Ｒ Ｉ Ｆ（－ ）。结论：此两种载体为“正反馈”式放大肿瘤免疫原性提供一条新途径。     

大鼠脑原生型一氧化氮合酶在NG108—5细胞中的表达

将大鼠脑原生型一氧化氮合酶（ｃＮＯＳ）全长ｃＤＮＡ定向插入ｐＲＣ／ＣＭＶｐｏｌｙｌｉｋｅｒ区，获得真核细胞表达载体ｐＣＭＶｃＮＯＳ。以ｐＣＭＶｃＮＯＳ为模板，ｃＮＯＳ内部基因序列设计的引物进行ＰＣＲ扩增，证明ｃＮＯＳ基因的存在，经酶切检测进一步证实插入方向完全正确，用磷酸钙共沉淀法和Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ＾ＴＭ法将ｐＣＭＶｃＮＯＳ转染ＮＧ１０８－１５细胞，用含６００ｍｇ／ＬＧ４１８培养基筛选和增殖抗     

绿色荧光蛋白GFP在转化细胞和肿瘤细胞中的表达

目的：在肿瘤基因治疗研究中建立一个用绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ,ＧＦＰ）为标记基因的合适条件。方法用带有ＧＦＰ突变体的质粒转染到表达细胞,观察ＧＦＰ瞬时表达的情况：１．直接测定ＧＦＰ在ＣＯＳ－７细胞中的表达并观察表达的稳定性;２比较不同启动子驱动的ｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰ和ｐＳＶＫ３－Ｓ６５Ｔ两种质粒在不同肿瘤细胞中的转染效率;３用ＬａｃＺ基因与ＧＦＰ基因共转染     

pBLacZ真核表达载体的构建及其在体内外的表达

构建了一种编码β－半乳糖苷酶的真核基因表达载体ｐＢＬａｃＺ。用它对体外培养的ＮＩＨ／３Ｔ３、ＣＯＳ－１、ＣＨＯ细胞株、原代培养的小鼠皮肤成纤维细胞，以及小鼠活体皮下和大鼠活体骨骼肌中进行了基因转移。经Ｘ－ｇａｌ组织化学染色后的结果证实：此基因载体可在这些组织细胞中有效地表达产生β－半乳糖苷酶活性。ｐＢＬａｃＺ作为一种新的标志基因载体，可能具有一定的应用价值。     

腺病毒介导神经生长因子对遗传性视网膜变性RCS大鼠？…

目的：探讨先天性视网膜变性病因以及对其进行基因治疗的可行性。方法：ＴＵＮＥＬ法对ＲＣＳ大鼠视细胞的丧失进行研究;构建分泌表达型重组腺病毒穿梭质粒ｐＨｄＥ１ＣＭＶ－ＮＧＦ,经与ｐＪＭ１７在２９３细胞中同源重组,获得复制缺陷型重组腺病毒ＡｄＥ１ＣＭＶ－ＮＧＦ。琼旨糖覆盖法测定滴度。ＡｄＥ１ＣＭＶ－ＮＧＦ和ＡｄＥ１ＣＭＶ－ＬａｃＺ转导培养视网膜色素上皮（ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕ     

腺病毒介导的野生型p53基因表达对入胰腺癌细胞生长的影响

目的探讨恢复野生型ｐ５３（ｗｔｐ５３）基因表达对胰腺癌细胞生长的影响。方法构建一个Ｅ１区缺失但能表达ｗｔｐ５３基因的５型腺病毒载体Ａｄ５ＣＭＶｗｔｐ５３，该载体含有人ＣＭＶ启动子、人野生型ｐ５３基因和ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ信号。载体经腺病毒包装细胞２９３细胞包装、扩增后，转染人胰腺癌ＰＣ－２细胞。ＰＣＲ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹分析证实，转染的细胞有外源ｗｔｐ５３基因的表达。结果与对照组相比，转染有Ａｄ５ＣＭＶｗｔｐ５３的ＰＣ－２细胞生长速度减慢、增殖率降低，软琼脂集落形成能力丧失。结论以腺病毒为载体恢复野生型ｐ５３在胰腺癌细胞的表达，可抑制癌细胞的生长和部分逆转其恶性表型。