外源性α晶状体蛋白作用于视网膜神经节细胞的定位研究

背景视神经损伤后无法有效再生,而近年研究发现,α晶状体蛋白能显著促进视网膜神经节细胞（RGCs）的存活及轴突有效再生,但其分子机制尚不清楚。目的研究外源性α晶状体蛋白与RGCs的结合部位。方法从2只2d龄LongEvans大鼠视网膜中分离并原代培养RGCs,应用thyl．1和cy3抗体荧光染色技术对培养的RGCs进行鉴别并在荧光显微镜下计数RGCs阳性率。对外源性的α晶状体蛋白生物素化后用直接显色法进行鉴定,并用胰岛素实验对其分子伴侣活性进行测定,明确α晶状体蛋白生物素化成功并具有分子伴侣活性后与原代培养的RGCs共孵育,再与荧光标记的亲和素进行反应,在激光共焦显微镜下观察外源性仪晶状体与RGCs的结合部位。结果原代培养的RGCs阳性率为94％;生物素化α晶状体蛋白直接显色法鉴定整体显色强,其A450值随生物素化的α晶状体蛋白的浓度下降而下降,提示α晶状体蛋白生物素化成功;生物素化α晶状体蛋白的分子伴侣活性明显,且生物素化前后活性无明显改变;生物素化α晶状体蛋白与RGCs共孵育及荧光染色后,激光共焦显微镜下与生物素化α晶状体蛋白共孵育的RGCs细胞膜和轴突均可见红色荧光,细胞质和细胞核未见荧光染色。对照组RGCs未见荧光染色。结论外源性的α晶状体蛋白特异性地结合在RGCs细胞膜上,提示外源性的α晶状体蛋白通过与RGCs细胞膜特异性结合而发挥相应的生物学功能,但其结合方式及作用机制需进一步研究。     

紫外线辐射对α-晶状体蛋白分子伴侣活性的作用

目的 研究在老化和白内障形成过程中紫外线（UV）辐射对α-晶状体蛋白分子伴侣活性的作用。方法 新生Sprague-Dawley大鼠皮下注射亚硒酸钠诱导硒性白内障（SC），采用SephacrylS-300HR分离幼年和老年兔晶状体皮质和核以及SC大鼠α-晶状体蛋白。以α-晶状体蛋白对过氧化氢酶热凝聚的抑制作为分子伴侣活性指标，观察UV-B（300nm)辐射α-晶状体蛋白蛋白后，其伴侣活性的变化。结果 UV辐射新生和老年兔晶状体核αL-晶状体蛋白后30h，与辐射前比较伴侣活性降低约18%和14%，而皮质的变化不显著；至100h时，老年兔皮质，核和新生兔核αL-晶状体蛋白比αL-晶状体蛋白敏感，UV辐射可进一步降低硒性白内障α-晶状体蛋白的分子伴侣活性。     

α-晶状体蛋白对维持晶状体透明性的功能研究进展

α-晶状体蛋白是眼晶状体细胞质的主要成分,由小热休克蛋白家族中的αA-晶状体蛋白和αB-晶状体蛋白组成.α-晶状体蛋白具有分子伴侣活性,还有调控细胞周期、增强基因组稳定性、防止压力诱导性细胞凋亡的作用.α-晶状体蛋白相关基因突变常引起遗传性白内障,是目前儿童盲的主要原因,而α-晶状体蛋白的多种改变可导致年龄相关性白内障.了解α-晶状体蛋白的功能有助于理解晶状体的发育及其正常功能的维持,为预防及治疗α-晶状体蛋白相关性白内障提供理论依据.就白内障发生机制、遗传定位及晶状体蛋白的功能进行综述.     

糖基化对α-晶状体蛋白的修饰和分子伴侣活性的降低

目的　研究糖基化对 α-晶状体蛋白分子伴侣活性的作用。方法　分离牛晶状体α-晶状体蛋白 ,分别与 0 .5 mol· L- 1 果糖和 0 .5 m ol· L- 1 葡萄糖在 37℃温育 ,在第 0、2 4、32天测定 380 nm的光吸收值和 40 0 nm非色氨酸荧光值 ,高压液相色谱 ( high performanceliquid chrom atography,HPL C)和 SDS- PAGE评价蛋白质交联程度 ,采用过氧化氢酶( catalase,CAT)和βL-晶状体蛋白的热凝聚光散射值 ,作为α-晶状体蛋白的分子伴侣活性指标。结果　果糖和葡萄糖可导致时间依赖性 α-晶状体蛋白在 380 nm吸收值的增加 ,非色氨酸荧光值升高 ;HPL C和 SDS- PAGE提示糖与α-晶状体蛋白形成交联复合物。果糖较葡萄糖作用明显。糖基化导致 α-晶状体蛋白抑制 CAT和 βL-晶状体蛋白热凝聚作用降低 ,孵育第 2 4天 ,葡萄糖组α-晶状体蛋白分子伴侣活性分别降低约 12 %和 19% ,果糖组约7%和 9% .结论　糖基化导致 α-晶状体蛋白形成高分子聚合物、凝聚、交联 ,分子伴侣活性丧失 ,这在老化和糖尿病性白内障形成过程中起重要作用。     

α-晶状体蛋白的结构和功能及基因学研究进展

α-晶状体蛋白包括αA-,αB-晶状体蛋白,是哺乳动物晶状体的主要蛋白,属于小热休克蛋白家族成员,具有分子伴侣功能,可以抑制变性蛋白质的凝聚和酶的失活。α-晶状体蛋白基因突变可导致白内障和肌病。本文对α-晶状体蛋白的分布、结构、功能以及基因学等方面综述。     

糖皮质激素对α-晶状体蛋白分子伴侣功能的影响

目的　研究糖皮质激素对α 晶状体蛋白分子伴侣功能的影响。 方法　凝胶过滤层析分离αL和βL 晶状体蛋白,αL 晶状体蛋白与 25mmol/L泼尼松龙 21 半琥珀酸(P 21 H)孵育 20d(37℃),分别于 0、2、4、10和 20d应用βL 晶状体蛋白热聚集法测定分子伴侣活性,采用PerkinElmerLB50B荧光光度仪观察色氨酸和非色氨酸荧光值,SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳监测蛋白质交联程度。 结果　被P 21 H修饰后的αL 晶状体蛋白分子伴侣功能显著降低。P 21 H可导致αL 晶状体蛋白色氨酸荧光强度明显降低,非色氨酸荧光强度向较长波长移位和增强,提示形成新的荧光色素物。孵育第 10d,伴侣活性已降低至约 3 3%,色氨酸荧光强度殆尽,约在激发波长 412nm出现新的非色氨酸荧光强度。SDS PAGE显示糖皮质激素导致αL 晶状体蛋白明显凝聚。 结论　糖皮质激素对α 晶状体蛋白的修饰和伴侣活性的降低可能参与糖皮质激素诱导白内障的形成。     

肌肽对激素诱导晶状体α-晶状体蛋白修饰的作用

目的：研究肌肽对糖皮质激素诱导的α-晶状体蛋白修饰和分子伴侣功能降低的保护作用，以及肌肽与糖皮质激素的直接反应。 方法：采用SephacryIS-300HR凝胶柱分离牛αL-晶状体蛋白。αL-晶状体蛋白分别与不同浓度的泼尼松龙-21-半琥珀酸（P-21-H）及肌肽孵育不同时间。以α1-晶状体蛋白对热凝聚的抑制作为分子伴侣活性指标。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和荧光光度仪来监测被修饰的αL-晶状体蛋白，并观察肌肽和泼尼松龙-21-半琥珀酸作用后的光谱变化。 结果：泼尼松龙-21-半琥珀酸可导致浓度和时间依赖性αL-晶状体蛋白分子伴侣活性的降低，但是肌肽加剧了这种效应。被泼尼松龙-21-半琥珀酸修饰后的较未被修饰的αL-晶状体蛋白色氨酸荧光强度显著降低，但是其非色氨酸荧光强度向较长波长移位，并呈现时间一剂量依赖的增强，提示有新的荧光色素物的形成。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示肌肽能与泼尼松龙-21-半琥珀酸迅速反应，从而抑制激素诱导的蛋白质修饰。时间依赖性的光吸收强度增加提示肌肽与泼尼松龙-21-半琥珀酸反应可能形成了新的加合物。 结论：肌肽能够与泼尼松龙-21-半琥珀酸直接反应，肌肽具有潜在的抗糖皮质激素作用。     

ATP对α-晶状体蛋白分子伴侣功能及构象的影响

目的 探讨α-晶状体蛋白分子伴侣功能的作用机制.方法将柠檬酸合酶(CS)、盐酸胍和不同浓度的α-晶状体蛋白及3 mmol/L的ATP温育,分光光度计测定CS的活性.α-晶状体蛋白与ATP温育后用荧光分光光度计检测其荧光发射光谱. 结果α-晶状体蛋白不能使变性的CS复性,但能抑制盐酸胍诱导的CS凝聚,保护CS的失活且呈浓度依赖性.ATP可使这些作用增强.ATP浓度增高可导致α-晶状体蛋白色氨酸荧光强度降低. 结论 ATP可增强α-晶状体蛋白的分子伴侣功能且能改变α-晶状体蛋白的分子构象.     

大鼠视网膜神经节细胞中内源性α晶状体蛋白的表达及其变化规律

目的 观察大鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)中内源性d晶状体蛋白的表达情况.方法 原代培养大鼠RGCs,取胰酶消化后即刻的细胞以及原代培养1～7 d的细胞行免疫荧光染色和激光共聚焦显微镜观察,并通过RT-PCR方法检测原代培养1～7 d、9 d、12 d的RGCs中内源性α晶状体蛋白mRNA的表达情况.结果 免疫荧光染色结果显示在原代培养后2 d的RGCs中,内源性α晶状体蛋白在少许RGCs膜上表达阳性;原代培养3～5 d,内源性α晶状体蛋白表达明显增强并达到高峰,呈"戒环状"分布,然后逐渐降低.mRNA检测结果表明,在RGCs原代培养过程中均有内源性α晶状体蛋白的表达,且在培养第3-5天其表达达到高峰,后逐渐降低.结论 大鼠RGCs可表达内源性α晶状体蛋白,在离体培养的RGCs中呈一过性高表达,其表达可能与细胞增殖及细胞活力有关.     

晶状体蛋白与年龄相关性白内障研究进展

晶状体蛋白是晶状体内重要的结构蛋白,多种蛋白质的翻译后修饰(post translational modification, PTM)可引起晶状体蛋白结构、溶解度的改变并最终导致白内障形成,而另一些翻译后修饰则可能与晶状体蛋白的保护作用相关。特别是α晶状体蛋白分子伴侣活性的下降可导致其他晶状体蛋白的凝聚和酶的失活,与年龄相关性白内障(age-related cataract,ARC)的发生密切相关。年龄相关性白内障为多因素疾病,目前确切病因不明,手术仍是治疗年龄相关性白内障的主要手段,尚无有效可以延缓或预防该疾病的药物。本文就目前主要的晶状体蛋白与年龄相关性白内障的关系及研究进展进行综述。     

首先被果糖糖基化攻击的晶状体蛋白质的分离和鉴定

目的鉴定早期糖基化晶状体蛋白质。方法新鲜牛晶状体匀浆与[^14C]-果糖孵育24h，凝胶过滤层析（Sephacryl S-300HR）分离水溶性蛋白质，并进一步分离脱氢酶；采用亲合层析（Affi-gel601）ff离糖基化蛋白质；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和鉴定富含放射活性组份的性质。结果α、β-晶状体蛋白和某些脱氢酶为早期糖基化蛋白质。再次分离表明αA2和βA3-晶状体蛋白为首攻糖基化蛋白质；亲合层析结果显示分子质量约为20kin的可能为α和γ-晶状体蛋白，36kin的多肽可能为苹果酸盐脱氢酶或乳酸脱氢酶，这些均为早期糖基化蛋白质。结论αA2、βA3、γ-晶状体蛋白和某些脱氢酶是最容易被糖基化的晶状体蛋白质。糖基化导致晶状体蛋白质的结构发生改变和蛋白质凝聚。早期糖基化诱导酶（如脱氢酶）的失活，可能参与白内障的形成。[眼科新进展21105；25（5）：404—407]     

离体氨甲酰化诱导α-晶体蛋白分子伴侣活性的丧失

目的:研究氨甲酰化作为晶状体蛋白质重要的翻译后修饰,对α-晶体蛋白分子伴侣活性的作用。方法:分离牛晶状体αL和βL-晶状体蛋白。αL-晶状体蛋白分别与不同浓度的[14C]氰酸钾温育1至7 d,采用三氯醋酸沉淀法测定αL-晶状体蛋白与[14C]氰酸基团的结合率。αL-晶状体蛋白分别与50和100 mmol.L-1氰酸钾37℃温育3至7 d,测定αL-晶体蛋白抑制βL-晶状体蛋白热凝聚的分子伴侣活性,高效液相色谱法(HPLC)分析αL-晶状体蛋白的氨甲酰化作用。结果:αL-晶状体蛋白与[14C]氰酸基团的结合率和离体氨甲酰化诱导的α-晶状体蛋白伴侣活性的降低呈剂量和时间依赖性。伴侣活性的降低与较高氰酸基团的结合相一致。与对照相比,100mmol.L-1氰酸钾温育7 d导致αL-晶体蛋白伴侣活性几乎殆尽。.HPLC结果提示与氰酸钾温育3 d后可发生剂量依赖性αL-晶体蛋白的凝聚。结论:离体氨甲酰化通过高分子量凝聚物的形成修饰α-晶体蛋白,氨甲酰化诱导α-晶体蛋白的凝聚可能导致其伴侣活性的丧失。     

α-晶状体蛋白在视网膜病变中的作用

α-晶状体蛋白被归类为小分子休克蛋白家族,发挥分子伴侣的功能,在应激时维护各功能蛋白质的稳定性,防止细胞凋亡,增强细胞的适应能力.α-晶状体蛋白曾被认为仅存在于晶状体中,近年来发现其不仅存在于视网膜中,而且参与到多种视网膜病变过程中,如视神经损伤、黄斑变性、糖尿病视网膜病变等.本文回顾了近年来有关α-晶状体蛋白在正常视网膜中的表达及其在各种视网膜疾病中的表达变化,分析其在维护视网膜正常功能及病理过程中起到的作用及机制,为视网膜疾病开拓新的研究方向和寻找新的治疗思路奠定基础.     

紫外线-B激光照射对α晶状体蛋白的影响及3-吲哚甲醇对其分子伴侣活性的保护作用

背景 紫外线照射是年龄相关性白内障形成的诱因之一.研究表明,3-吲哚甲醇(I3C)可抑制氧化作用导致的细胞损害及淀粉样纤维变性的形成,氧化损伤及淀粉样纤维变性的形成均与白内障有关,而I3C与α晶状体蛋白活性的关系尚有待证实. 目的 评估紫外线-B激光照射对α晶状体蛋白结构和分子伴侣功能的影响,探讨I3C对α晶状体蛋白分子伴侣功能的保护作用.方法 取新鲜1岁龄牛眼球的晶状体,采用凝胶层析法提纯牛的α晶状体蛋白,并按照快速蛋白液相色谱( FPLC)吸收谱线收集α晶状体蛋白.然后分别以23.75、118.75、475.00、1187.50、2375.00、4750.00、11 875.00和23 750.00mJ/cm2的紫外线-B激光照射在凸透镜后一固定位置的α晶状体蛋白,然后通过改变α晶状体蛋白在凸透镜后的位置达到改变照射能量的目的,使各组照射能量分别为28 535.00、6730.00、3435.00、1910.00、1040.00 mJ/cm2.使用紫外分光光度仪测量紫外线-B激光照射前后α晶状体蛋白的紫外吸收谱线(色氨酸荧光谱).在照射能量为475.00、1187.50、2375.00、4750.00、11 875.00mJ/cm2照射后的α晶状体蛋白溶液中分别加入50μmol/L和100 μmol/L的I3C,并进行过氧化氢酶(CAT)热凝聚实验,判断α晶状体蛋白分子伴侣活性,未加入50 μmol/L和100 μmol/L I3C的α晶状体蛋白溶液进行相同的实验作为对照,采用分光光度仪测量360 nm波长处各组α晶状体蛋白抑制CAT热凝聚的吸光度(A360)值,计算各干预组与对照组A值的百分数作为评价分子伴侣活性的指标. 结果 α晶状体蛋白紫外吸收谱测定发现,紫外线-B激光照射能量为1187.50 mJ/cm2时,α晶状体蛋白A280值降到10％左右,当照射能量达到23.75 J/cm2时,α晶状体蛋白A280值降到2％以下,二者呈负相关(R2=0.925).色氨酸荧光光谱测定表明,紫外线-B激光照射强度与色氨酸荧光强度呈负相关(R2=0.996),而与色氨酸代谢产物N-甲酰犬尿氨酸(N-FK)的荧光强度呈正相关(R2=0.949).CAT热凝聚实验表明,加入50 μmol/L和100μmol/L的I3C后,各强度的激光照射组α晶状体蛋白的相对A360值均明显高于对照组,差异有统计学意义(P=0.000)；α晶状体蛋白分子伴侣功能下降幅度低于对照组,差异有统计学意义(P=0.000).分子伴侣活性随着激光照射能量的增加与不加入I3C的α晶状体蛋白相比降低变慢.结论 紫外线-B激光照射可以造成α晶状体蛋白分子结构的变化及分子伴侣活性的降低,I3C对于α晶状体蛋白分子伴侣活性具有保护作用.     

晶状体损伤促进视神经再生的研究进展

视神经损伤是眼科重要的致盲原因之一,在眼科的临床治疗中并没有有效的方法.近期发现的晶状体损伤可以促进视网膜神经节细胞(RGCs)存活与再生,为临床医生治疗视神经损伤提供了新的思路.目前,关于晶状体损伤促进RGCs再生效应的机制有很多的说法,主要与基因表达、局部炎症作用、晶状体上皮和蛋白的变化以及神经营养因子作用有关.     

蛋白质组学在白内障研究中的应用

后基因组时代，蛋白质组学作为功能基因组学研究的核心技术之一，已成为生物医学领域强大的技术支撑，并为白内障疾病的研究提供了一个新的平台。白内障和老化被认为是一类构象性疾病。晶状体透明性与具有分子伴侣活性的α-晶体蛋白密切相关。白内障发生时，多种疾病特征性的蛋白质组改变，可导致α-晶体蛋白分子内或分子间的交联，分子伴侣活性下降，加速白内障的形成。就蛋白质组学在白内障发病机制研究中的应用进行综述。     

年龄相关性白内障α-晶状体蛋白的分子伴侣功能

目的:研究年龄相关性白内障α-晶状体蛋白的分子伴侣功能。方法:使用SephacrylS-300HR分离健康人透明的和年龄相关性白内障混浊的晶状体皮质和核的αL-晶状体蛋白。采用分光光度计测定αL-晶状体蛋白对过氧化氢酶(catalase,CAT)热凝聚的抑制作用。应用SDS-PAGE分析CAT与αL-晶状体蛋白在热凝聚实验中形成的复合物。结果:人αL-晶状体蛋白可特异性地抑制CAT热凝聚。透明晶状体皮质较核的抑制作用明显;白内障αL-晶状体蛋白的抑制作用明显下降,65岁以下与65岁以上、65岁以上白内障Ⅱ与Ⅳ级核之间αL-晶状体蛋白的抑制作用比较,差异均有显著性;65岁以下Ⅱ与Ⅳ级核之间比较,差异无显著性,但Ⅳ级核的抑制作用降低。SDS-PAGE显示热凝聚实验透明晶状体皮质αL-晶状体蛋白的20kDa带在加热后0、40min和2h可溶部分无显著减少,62kDa的CAT带含量逐渐减少。结论:人α-晶状体蛋白具有抑制CAT热凝聚的分子伴侣功能,白内障晶状体核的α-晶体蛋白具有年龄和混浊程度依赖性伴侣功能的降低,这在白内障形成过程中起重要作用。     

αB-晶状体蛋白在半乳糖性白内障大鼠眼晶状体中的表达

目的　检测轻、中、重度混浊的半乳糖性白内障大鼠晶状体中可溶性αB 晶状体蛋白和不溶性αB 晶状体蛋白的表达 ,探讨αB 晶状体蛋白与白内障发生的关系。方法　采用 50 %半乳糖注射液腹腔注射诱发半乳糖性白内障作为实验组 ,依晶状体混浊程度分为轻、中、重度三组 ,对照组则同时腹腔注射生理盐水 ,与实验组大鼠同期分为三组。大鼠处死后 ,取晶状体作匀浆 ,其上清 (可溶性晶状体蛋白质 )和沉淀 (不溶性晶状体蛋白质 )分别用免疫印迹法 (Westernblotanalysis)检测αB 晶状体蛋白的表达。结果　实验组可溶性αB 晶状体蛋白含量较对照组降低 ,有显著性差异 (P <0 0 5) ;实验组含量随晶状体混浊程度加重而逐渐降低 ,其差别有显著性意义 (P <0 0 5)。不溶性αB 晶状体蛋白含量较对照组升高 ,有显著性差异 (P <0 0 5) ;实验组含量随晶状体混浊程度加重而逐渐升高 ,其差别有显著性意义 (P <0 0 1)。结论　αB 晶状体蛋白的分子伴侣功能参与白内障的发病 ,为白内障发病机制的研究提供了新思路     

α晶体蛋白在视神经损伤后再生中的作用研究进展

α晶体蛋白是构成晶状体的重要结构蛋白,属于小分子热休克蛋白（ sHSPs）家族,除了具有热休克蛋白（ HSPs）的共性,还具有抗细胞凋亡等作用。近年来研究还发现,α晶体蛋白可与视网膜神经节细胞（ RGCs）的细胞膜结合来促进RGCs的存活和轴突的再生,进而部分改善视功能,但其相关机制仍无统一的结论。本文就α晶体蛋白的基本结构与功能、α晶体蛋白在视神经损伤后对RGCs的保护作用及其机制展开综述。     

阿司匹林对萘性白内障α-晶状体蛋白分子伴侣活性的保护作用

目的探讨低剂量阿司匹林对萘性白内障α-晶状体蛋白分子伴侣活性的保护作用。方法将45只150～160g雌性sD大鼠随机分为空白对照组（无特殊处理）、萘性白内障组（每日0．5mg／kg萘灌胃3d后改为每日1mg／kg）和阿司匹林组（萘灌胃4h后每日100mg／kg阿司匹林灌胃）。应用定期图像分析和高效液相色谱（HPLC）法分离纯化α-晶状体蛋白,紫外分光光度法测定其抑制热诱导的β—L晶状体蛋白变性的能力。结果3周时萘性白内障组晶状体开始出现混浊,程度逐步加重,阿司匹林组混浊早期进展较萘性白内障慢,6周后进展程度接近于萘性白内障组。实验2周时3组晶状体混浊程度的比较差异无统计学意义（F：0．032,P=0．969）。实验第4、6、8、10周时3组晶状体混浊程度比较差异均有统计学意义（F=5031．130,P=0．000：F=115964．000,P=0．000;F=169846．500,P=0．000;F=195431．200,P=0．000）,且空白对照组与萘性白内障组、空白对照组与阿司匹林组、阿司匹林组与萘性白内障组之间的差异均有统计学意义（P=0．000）。阿司匹林组的α-晶状体蛋白分子伴侣活性高于萘性白内障组。结论低剂量阿司匹林通过保护n一晶状体蛋白分子伴侣活性延缓萘性白内障大鼠晶状体混浊的进展,此作用在白内障早期尤为明显。