蓝光致人视网膜色素上皮细胞凋亡与线粒体膜电位和细胞色素C的关系

目的探讨蓝光光照对体外培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞凋亡及对线粒体膜通透性转运功能的影响。方法用蓝光光照体外培养的人RPE细胞。实验分为三部分。第一部分:不同光照度,分为3组,第1组光照度(500±100)lx,第2组光照度(2000±500)lx,第3组光照度(3000±500)lx;光照RPE细胞时间6h,光照结束后24h终止培养。第二部分:同一光照度、不同光照时间,检测RPE细胞亚型时分为3组,第1组光照时间6h,第2组光照时间12h,第3组光照时间24h,光照度均为(2000±500)lx;检测线粒体膜电位时也分为3组,第1组光照时间3h,第2组光照时间6h,第3组光照时间12h,光照度均为(2000±500)lx。第三部分:同一光照度和光照时间,光照度(2000±500)lx,光照RPE细胞时间6h;不同细胞培养终止时间分为4组,第1组终止细胞培养时间为光照后6h,第2组为光照后12h,第3组为光照后24h,第4组为光照后36h。利用末端脱氧核糖核酸转移酶介导的原位缺口末端标记(TUNEL)染色、荧光素标记的AnnexinV-FITC和PI双染流式细胞检测、透射电镜等手段观察RPE细胞凋亡情况。罗丹明123荧光染料孵育人RPE细胞,流式细胞仪检测线粒体膜电位,酶联免疫法测定细胞色素C活性,比色测定法测定Caspase-3的活性。结果第二部分第1组TUNEL染色阳性细胞的体积缩小变圆,胞核浓缩,边聚成新月形或帽状,细胞核碎裂成数个,细胞膜出胞。透射电镜观察发现细胞内线粒体肿胀,线粒体内膜嵴消失,粗面内质网扩张,溶酶体增加。第一部分(500±100)lx光照未引起明显的RPE细胞损伤,但线粒体膜电位明显下降;随着光照度增加,RPE细胞出现凋亡、凋亡继发性坏死及坏死,同时线粒体膜电位逐渐下降。第二部分光照6和12h,凋亡细胞百分比增加,荧光强度明显下降;光照24h凋亡继发性坏死细胞、坏死细胞百分比增加。第三部分光照后6和12h,RPE细胞凋亡百分比逐渐增加;光照后24、36h凋亡继发性坏死细胞和坏死细胞百分比明显增加,光照后各时间点RPE细胞荧光强度明显下降。以光照度(2000±500)lx照射6和12h,可见光照后24和36h两组的细胞色素C浓度明显升高,未检测到Caspase-3活性变化。结论蓝光照射可导致体外培养的人RPE细胞凋亡、凋亡继发性坏死及坏死,其损伤程度与光照度和时间相关;蓝光照射导致培养的人RPE细胞损伤过程与线粒体膜电位降低、细胞色素C释放有关;线粒体膜电位可作为检测蓝光致人RPE细胞凋亡的早期指标。     

光诱导对人视网膜色素上皮细胞自噬和凋亡的影响

研究人视网膜色素上皮（RPE）细胞光损伤中自噬与凋亡之间的关系,并探讨自噬抑制剂3甲 基腺嘌呤（3MA）对光诱导下RPE细胞自噬和凋亡的影响。方法：实验研究。将体外培养的人RPE细 胞（ARPE-19）随机分为12 h对照组、12 h模型组、12 h 3MA组以及24 h对照组、24 h模型组、24 h 3MA组。对照组采用锡纸包裹避光培养;模型组接受光照刺激;3MA组中加入3 mmol/ml 3MA后接 受光照刺激,以自制三基色LED（发光二极管）冷光灯作为光源,在（16 500±500）lx光照强度下照 射细胞12 h和24 h。透射电子显微镜观察每组细胞超微结构,流式细胞仪测定细胞存活率,激光共 聚焦结合倒置荧光显微镜定性、定量分析自噬-溶酶体形态及荧光强度,Western blot法检测Beclin 1、 LC3和P62自噬相关蛋白表达量。数据采用单因素方差分析。结果：在光照12 h后,ARPE-19细胞自 噬水平可以抵抗光损伤,降低细胞凋亡率（F=931.53,P<0.001）;光照24 h后细胞自噬水平超过其正 常调节范围,细胞凋亡率升高,差异有统计学意义（F=1156.67,P<0.001）;使用3MA可抑制光诱导 的ARPE-19细胞过度自噬,降低细胞凋亡率（F=2.856,P=0.027）,进而保护细胞以应对光损伤。结论： ARPE-19自噬水平随光照时间而变化;随着光照时间延长,细胞凋亡率升高。抑制细胞的过度自噬 可以保护ARPE-19细胞应对光损伤。     

全光谱光照对体外培养的人视网膜色素上皮细胞分泌多巴胺功能的影响

目的 探索不同光谱组成的光照射对体外培养的视网膜色素上皮（RPE）细胞分泌多巴胺功能的影响.方法 实验研究.在细胞培养箱内建立光照系统后,将体外培养的RPE细胞分别放置于无光照（对照组）、全光谱低强度光照、红绿蓝（RGB）光谱低强度光照、全光谱高强度光照、RGB光谱高强度光照环境中进行培养,连续光照24、48 h后进行检测.利用WST-1法检测各处理组之间RPE 细胞增殖率的改变,用高效液相色谱法（HPLC）检测多巴胺分泌水平.用one-way ANOVA对实验数据进行统计学分析.结果 WST-1检测结果显示：连续光照24h后,低强度光照下的全光谱光照与RGB 光谱光照对RPE细胞增殖率的影响差异无统计学意义：而在高强度光照下,全光谱光照组的RPE细胞增殖率低于RGB光谱光照组（P＜0.05）.连续光照48 h后,无论在哪种光照强度下,全光谱光照比RGB光谱光照更能抑制RPE细胞的增殖（P均＜0.01）.HPLC检测结果显示：连续光照24 h后,低强度光照下的全光谱光照与RGB光谱光照相比,对RPE细胞分泌多巴胺功能的影响差异无统计学意义;而在高强度光照下,全光谱光照组的RPE细胞分泌多巴胺的水平高于RGB光谱光照组（P＜0.01）.连续光照48 h后,同一光照强度下,全光谱光照组RPE细胞分泌多巴胺的水平高于RGB光谱光照组（P均＜0.05）.结论 光的光谱组成也是调控RPE细胞分泌多巴胺的重要因素之一,这种调控作用与光照强度和光照时间密切相关.在评估光延缓近视发生发展的作用时应该考虑光的光谱组成.     

黄芪甲苷对蓝光诱导损伤的视网膜色素上皮细胞的保护作用及其机制

目的　探讨黄芪甲苷（AS-IV）对蓝光诱导损伤的视网膜色素上皮细胞的保护作用及其机制。方法　将传代后的ARPE-19细胞分为5组。空白组:在暗环境中培养细胞,不采用蓝光照射;光照组:采用辐射强度为(4.0±0.5) mW·cm^-2的蓝光照射细胞4 h;光照+AS-IV组:采用相同辐射强度的蓝光照射4 h +50 mg·L^-1 AS-IV培养细胞24 h;光照+AS-IV+siNC组:将细胞转染对照siRNA后,采用相同辐射强度蓝光照射4 h +50 mg·L^-1 AS-IV培养细胞24 h;光照+AS-IV+siPINK1组:将细胞转染siPINK1后,采用相同辐射强度蓝光照射4 h +50 mg·L^-1 AS-IV培养细胞24 h。采用CCK-8法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,JC-1荧光探针检测细胞线粒体膜电位,DHE荧光探针法检测细胞内活性氧（ROS）含量,Western blot检测蛋白表达。结果　当连续蓝光照射4 h以上,ARPE-19细胞存活率均低于80%,故选择照射时间为4 h进行后续实验。光照+AS-IV组细胞存活率明显高于光照组［（93.85±1.79）%、（79.24±3.25）%,t=11.141、P<0.001］。光照+AS-IV组细胞凋亡率明显低于光照组［（11.03±1.65）%、（27.85±3.44）%,t=12.472、P<0.001］。光照组细胞线粒体膜电位高于空白组（绿/红色荧光强度比值分别为1.72±0.25、0.58±0.07,t=12.418、P<0.001）,但是光照+AS-IV组细胞线粒体膜电位（绿/红色荧光强度比值为0.81±0.10)则低于光照组（t=9.559、P<0.001）。光照+AS-IV组细胞ROS含量少于光照组（t=6.341、P<0.001）。蓝光照射4 h后,光照+AS-IV组ARPE-19细胞PINK1蛋白（1.18±0.14,t=9.035、P<0.001）和Parkin蛋白（0.77±0.09,t=8.106、P<0.001）相对表达量则明显高于光照组。与光照组相比,光照+AS-IV组ARPE-19细胞的细胞质细胞色素C（Cyt C）蛋白相对表达量降低至0.67±0.08（t=17.059、P<0.001）,线粒体Cyt C蛋白相对表达量升高至0.16±0.03（t=5.491、P<0.001）,总蛋白中LC3B-II/I蛋白表达比值升高至3.44±0.27（t=34.047、P<0.001）。与光照+AS-IV组相比,光照+AS-IV+siNC组ARPE-19细胞的细胞质和线粒体Cyt C蛋白相对表达量（0.70±0.09、0.15±0.03）、总蛋白中LC3B-II/I蛋白表达比值（3.26±0.33）差异均无统计学意义（均为P>0.05）,而光照+AS-IV+siPINK1组ARPE-19细胞的细胞质Cyt C蛋白相对表达量（1.20±0.15）较光照+AS-IV+siNC组升高（t=8.085、P<0.001）,线粒体Cyt C蛋白相对表达量降低至0.02±0.01（t=11.628、P<0.001）,总蛋白中LC3B-II/I蛋白表达比值则降低至0.85±0.13（t=19.224、P<0.001）。结论　AS-IV对蓝光诱导损伤的视网膜色素上皮细胞具有一定的保护作用,可抑制细胞产生大量ROS,缓解细胞线粒体损伤和细胞凋亡,维持细胞活力和自噬过程,其机制可能与AS-IV上调细胞PINK1/Parkin信号通路有关。     

姜黄素在抑制紫外线B诱导的人视网膜色素上皮细胞DNA氧化损伤和凋亡中的作用

目的 探讨姜黄素在紫外线B(UVB)诱导的人视网膜色素上皮(RPE)细胞DNA氧化损伤和凋亡中的作用机制。方法 将人视网膜色素上皮细胞株(ARPE-19)随机分为空白对照组、二甲基亚砜(DMSO)组、姜黄素组、UVB照射组、UVB+DMSO组和UVB+姜黄素组。CCK-8实验检测姜黄素对UVB照射前后ARPE-19细胞活力的影响；免疫荧光检测DNA氧化损伤标志蛋白磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)的定位；Western blot检测γH2AX、凋亡相关蛋白[B淋巴细胞瘤-2基因(BCL-2)和BCL-2相关X蛋白(BAX)]的表达变化；使用X-rosamine衍生物(Mito-Tracker Red CMXRos)和异硫氰酸荧光素(FITC)标记的钙离子依赖的磷脂结核蛋白Annexin V(Annexin V-FITC)来检测UVB诱导的ARPE-19细胞线粒体膜电位变化和细胞凋亡情况。结果 与空白对照组相比，DMSO组DMSO处理24 h后的ARPE-19细胞活力无明显改变(P>0.05)。与DMSO组相比，姜黄素组采用15μmol·L^-1姜黄素处理24 ...     

α-硫辛酸对蓝光诱导损伤的ARPE-19细胞的保护作用

目的 研究α-硫辛酸(ALA)对蓝光诱导损伤的ARPE-19细胞的保护作用。方法 体外培养ARPE-19细胞，随机分为正常组(N组)、药物组(D组)、光照组(L组)、药物+光照组(D+L组)。倒置显微镜下观察ARPE-19细胞形态结构。CCK-8法检测各组ARPE-19细胞活性；流式细胞仪(Annexin V/PI双染色法)检测ARPE-19细胞凋亡率；倒置荧光显微镜检测ARPE-19细胞ROS水平；实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测ARPE-19细胞核因子E2相关因子2(Nrf2)、谷胱甘肽巯基转移酶(GST)、NAD(P)H醌氧化还原酶1(NQO1)、血红素氧合酶-1(HO-1) mRNA表达水平；Western blot检测ARPE-19细胞天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、Nrf2、NQO1蛋白表达水平。结果 N组及D组细胞均呈贴壁生长，分布均匀，形态清晰，细胞存活率差异无统计学意义(P>0.05)。与N组相比，L组细胞皱缩、变小、变圆，失去正常形态，部分细胞不能贴壁生长，细胞存活率降低，细胞凋亡率升高，ROS水平升高(均为P<0.05)...     

CCK-8法检测蓝光和白光对ARPE-19细胞增殖的影响

目的：探讨蓝光和白光分别光照不同时间对人视网膜色素上皮(ARPE-19)细胞增殖的影响,为进一步检测光照损伤过程中相关因子的变化情况,研究光照损伤过程中的信号转导机制奠定基础。

方法：收集生长状态良好的ARPE-19 细胞进行实验,制作CCK-8标准曲线,确定实验合适的ARPE-19细胞密度及CCK-8试剂的反应时间。将细胞分为避光组、蓝光组、白光组,分别光照 3、6、9h,再避光培养12h后采用CCK-8 法检测不同光源光照不同时间对ARPE-19细胞增殖率的影响。

结果：通过CCK-8标准曲线选择每孔细胞数量为20 000个,CCK-8溶液作用4h后测量相应吸光度值。CCK-8检测结果示,避光组、蓝光组、白光组三组细胞光照不同时间细胞增殖率比较,差异有统计学意义(P<0.01)。蓝光组细胞光照3、6、9h,各时间点细胞增殖率比较,差异有统计学意义(P<0.001),且随着光照时间的延长,细胞增殖率逐渐降低。白光组细胞光照3、6、9h,各时间点细胞增殖率比较,差异有统计学意义(P<0.05),其中光照3h和6h细胞增殖率比较,差异有统计学意义(P<0.05),而光照9h分别与光照3、6h细胞增殖率比较,差异均无统计学意义(P=0.253、0.120)。白光光照3～6h细胞增殖率呈下降趋势,而光照6～9h细胞增殖率呈现上升趋势。相同光照时间,蓝光组和白光组细胞增殖率均低于避光组,且蓝光组细胞增殖率均低于白光组,差异均有统计学意义(P<0.05)。

结论：光照能抑制ARPE-19细胞的增殖,其中蓝光光照细胞增殖率明显低于白光,且随光照时间的增长,细胞增殖率进一步降低。     

可见光照对培养的人视网膜色素上皮细胞凋亡的影响

目的 研究可见光照对培养的人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞凋亡的影响。 方法 以白色荧光灯为光源，用500 lx、(2000±500) lx及(3400±200) lx不同光照强度,按不同的光照时间(无光照、6、12、24 h)照射培养的人RPE细胞。利用终末脱氧核糖核苷酸转移酶介导的原位缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labelling, TUNEL)、荧光素标记的连接素V/碘化丙锭(Annexin V-fluorescein isothiocyanate/Propidium iodium，Annexin V-FITC/PI)双染色流式细胞测定、相差倒置显微镜等手段观察RPE细胞凋亡(分为光照后6、12、24、36 h组)。 结果 可观察到RPE细胞出现两种死亡形式，凋亡与坏死。(1)低于一定阈值(500 lx)的光照对细胞损伤较轻，细胞凋亡及坏死随光照强度的增加而增加。(2)在较短的光照时间(6 h和12 h)内，细胞死亡的增加以凋亡为主；随着光照时间的延长，细胞坏死逐渐明显。(3)随着光照后培养时间的延长，细胞凋亡明显增加(P＜0.05)。光照后6、12、24 h的损伤改变以凋亡为主，但随时间的延长，凋亡继发性坏死的增加显著。光照后36 h，细胞的坏死数显著增高(P＜0.01)。 结论 可见光超过一定照度(500 lx)可导致培养的人RPE细胞凋亡及坏死的显著增加，其损伤程度为光照强度及时间依赖性。较低光照强度及较短光照时间主要诱导细胞凋亡，反之则导致细胞坏死。 (中华眼底病杂志, 2002, 18: 227-230)     

蓝光所致人视网膜色素上皮细胞损伤与细胞内钙离子含量变化的关系

背景 对蓝光照射所致视网膜色素上皮(RPE)细胞损伤与细胞内钙离子含量变化关系的深入研究可能对探讨视网膜变性类疾病的发生机制及防治具有重要意义. 目的 建立人RPE细胞蓝光损伤模型,探讨RPE细胞损伤与细胞内钙离子含量变化的关系.方法 将人RPE细胞系培养传代,锥虫蓝染色评估细胞活力.第4代人RPE细胞分别用(2000±500) lx蓝光照射3、6、9、12h,终止细胞培养24 h后,采用TUNEL法检测不同时间点细胞的凋亡情况,确定最适宜的光照度.然后将RPE细胞分为无光照组、光照组、硝苯地平组、光照+硝苯地平组、(-)BayK8644组、光照+(-)BayK8644组.除无光照组外,其他各组细胞均用蓝光照射6h,终止细胞培养24h,采用激光扫描共焦显微镜检测细胞内游离钙离子含量,激发光波长为488 nm,发射光波长为505 nm,每组随机选取30个细胞,扫描细胞图像,采用分析软件分析各组细胞内游离钙离子的荧光强度.结果 锥虫蓝染色证实RPE细胞的活力均在90％以上,TUNEL染色和免疫组织化学染色证实光照3h组未见细胞凋亡,而光照后6、9、12h发现不同数量的凋亡细胞.硝苯地平组RPE细胞内游离钙离子荧光强度比无光照组和光照+硝苯地平组低,差异均有统计学意义(均P=0.000);光照组、(-)BayK8644组、光照+(-)BayK8644组RPE细胞内钙离子荧光强度高于无光照组,差异均有统计学意义(均P=0.000);光照+硝苯地平组与无光照组相比较,(-)BayK8644组与光照+(-)BayK8644组比较,差异均无统计学意义(P=0.339、0.410). 结论 光照度(2000±500)1x、光照6h、终止培养24 h为建立蓝光照射致人RPE细胞损伤模型的最适合条件.蓝光照射所致的人RPE细胞损伤与细胞内游离钙离子含量增加有关.     

蓝光照射致人视网膜色素上皮细胞线粒体凋亡的途径及机制

背景 研究已证实蓝光照射可导致视网膜色素上皮细胞(RPE)凋亡,但其机制目前尚不完全清楚. 目的 探讨线粒体凋亡通路是否参与蓝光照射诱导体外培养的人RPE细胞凋亡过程.方法 分离新鲜的供体视网膜,对人RPE细胞进行原代培养和传代,用角蛋白单克隆抗体行细胞鉴定.将体外培养的人RPE细胞分为无光照组、单纯光照组、光照+硝苯地平组、光照+钙磷酸结合蛋白C(calphostin C)组、光照+佛波酯(PMA)组.光照组细胞用(2 000±500) lx的蓝光照射人RPE细胞6h,然后继续培养24 h后终止.采用Western blot法比较两个组间RPE细胞中凋亡相关调控因子bax、bcl-2、bcl-xl的相对表达,以评价蓝光照射对RPE细胞凋亡的影响.光照+硝苯地平组、光照+calphostin C组、光照+PMA组细胞在蓝光照射前1h分别在培养基中加入相应药物,然后以(2 000±500) lx的蓝光照射人RPE细胞6h,并继续培养24 h,采用Westernblot法检测5个组细胞中caspase-9蛋白表达量的变化,观察钙通道和蛋白激酶C(PKC)通路对RPE细胞线粒体的影响.结果 培养的细胞生长良好,细胞质内充满色素颗粒,呈铺路石样排列,对角蛋白呈阳性反应.无光照组和单纯光照组均可见bax、bcl-2及bcl-xl蛋白条带,相对分子质量分别为23 000、26 000和30 000.与无光照组比较,单纯光照组bax、bcl-2和bcl-xl蛋白表达相对值(A)下降,差异均有统计学意义(t=-4.409,P=0.012;t=7.575,P=0.002;t=6.068,P=0.004).与无光照组比较,单纯光照组、光照+calphostin C组、光照+PMA组细胞中caspase-9蛋白表达均升高,差异均有统计学意义(P=0.005、0.002、0.000),而光照+硝苯地平组与无光照组比较差异无统计学意义(P=0.191).与单纯光照组比较,光照+PMA组caspase-9蛋白表达升高,差异有统计学意义(P=0.005);而光照+硝苯地平组及光照+calphostin C组caspase-9蛋白表达差异均无统计学意义(P=0.057、0.643). 结论 蓝光致体外培养的人RPE细胞凋亡,同时细胞中caspase-9表达增强,凋亡抑制基因bcl-2及bcl-xl表达下降,凋亡促进基因bax蛋白表达增强.线粒体凋亡通路参与蓝光照射致RPE细胞凋亡的过程;PKC通路可能参与了蓝光导致的人RPE细胞凋亡.     

纳豆激酶对高糖缺氧诱导的视网膜色素上皮细胞损伤的保护作用

目的 探讨纳豆激酶(NK)对高糖缺氧导致的人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)损伤的保护作用。方法 不同浓度的葡萄糖和氯化钴(CoCl₂)诱导培养ARPE-19细胞24 h后,观察细胞形态变化,采用CCK-8法检测ARPE-19细胞活性。Western blot和RT-qPCR检测紧密连接蛋白-1(ZO-1)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、白细胞介素(IL)-1β、IL-18的表达情况,筛选最佳葡萄糖和CoCl₂浓度构建体外高糖缺氧的细胞模型。CCK-8法筛选合适的NK浓度,将ARPE-19细胞分为正常糖组(5.5 mmol·L^-1葡萄糖,NC组)、高糖+CoCl₂组(25.0 mmol·L^-1葡萄糖+200μmol·L^-1 CoCl₂,HG+CoCl₂组)和NK处理组(1.0μmol·L^-1 NK+25.0 mmol·L^-1葡...     

潜伏转化生长因子β结合蛋白2（LTBP2）对氧化型低密度脂蛋白诱导的人视网膜色素上皮细胞氧化损伤的影响

目的　探索潜伏转化生长因子β结合蛋白2（LTBP2）对氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的人视网膜色素上皮（ARPE）细胞氧化损伤的影响。方法　0 mg·L^-1 、50 mg·L^-1 、100 mg·L^-1 和200 mg·L^-1 ox-LDL处理ARPE-19细胞,CCK-8试剂盒和细胞凋亡检测试剂盒检测细胞活力和凋亡水平,Western blot检测不同浓度ox-LDL处理后细胞LTBP2蛋白表达水平。100 mg·L^-1 ox-LDL处理ARPE-19细胞构建氧化损伤模型。将ARPE-19细胞随机分为对照组,ox-LDL组,转染LTBP2过表达载体或阴性对照的ox-LDL+ov-LTBP2组和ox-LDL+ov-NC组,转染LTBP2 siRNA或阴性对照的ox-LDL+si-LTBP2组和ox-LDL+si-NC组,以及ox-LDL+ si-LTBP2 +VEGF组。相应处理各组细胞后,采用CCK-8试剂盒和细胞凋亡检测试剂盒检测细胞活力和凋亡水平,酶联免疫吸附实验检测氧化应激标志物活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）、血管内皮生长因子（VEGF）的表达水平,Western blot检测各组细胞LTBP2、P38和p-P38的蛋白表达水平。结果　与0 mg·L^-1 ox-LDL处理后相比,50 mg·L^-1 、100 mg·L^-1 和200 mg·L^-1 ox-LDL处理后APRE-19细胞活力下降,凋亡率升高,LTBP2蛋白表达水平增加,且变化均具有剂量依赖性（均为P<0.05）。与ox-LDL + ov-NC 组相比,ox-LDL+ ov-LTBP2组细胞LTBP2蛋白表达水平、ROS含量及细胞凋亡率均增加,细胞活力、SOD活性均降低,p-P38/P38比值和VEGF表达量均增加 （均为P<0.05）。与ox-LDL+si-NC组相比,ox-LDL+si-LTBP2组细胞LTBP2蛋白表达水平、ROS含量及细胞凋亡率均降低,细胞活力、SOD活性均增加,p-P38/P38比值和VEGF表达量均减少（均为P<0.05）。而与ox-LDL+ si-LTBP2组比较,ox-LDL+ si-LTBP2+VEGF组细胞凋亡率和ROS含量均增加,细胞活力、SOD活性均降低（均为P<0.05）。结论　LTBP2通过激活P38 MAPK信号通路促进VEGF表达加剧ox-LDL引起的ARPE-19细胞氧化应激损伤。     

miRNA-19对葡萄膜黑色素瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响及其机制研究

目的　探讨miR-19在葡萄膜黑色素瘤（UM）细胞中的表达及其对UM细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响及其作用机制。方法　qRT-PCR检测正常视网膜上皮细胞系ARPE-19和UM细胞系SP6.5、M23 中miR-19 的表达。将M23细胞分为miR-19 inhibitor组（转染miR-19-inhibitor）及miR-19 NC组(转染scramble）,MTT法检测各组细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,细胞划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力,Western blot检测表皮生长因子受体(EGFR)/丝氨酸-苏氨酸激酶（AKT）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路蛋白表达。结果　正常视网膜上皮细胞系ARPE-19中miR-19 相对表达量为1.35±0.13,均显著低于UM细胞系SP6.5与M23中miR-19相对表达量8.35±0.73和9.35±0.43(均为P<0.01) 。 M23 细胞转染后,miR-19 inhibitor组中miR-19表达量低于miR-19 NC组 (1.05±0.33 vs 8.05±0.64,P<0.01)。MTT法检测结果显示,转染24 h,miR-19 inhibitor组与miR-19 NC组光密度值比较,差异无统计学意义（P>0.05);转染48 h、72 h、96 h,miR-19 inhibitor组光密度值均低于miR-19 NC组（均为P<0.05)。miR-19 inhibitor组细胞凋亡率高于miR-19 NC组［(15.34±2.35)% vs (8.23±0.72) %,P<0.05］。miR-19 inhibitor组细胞划痕愈合率低于miR-19 NC组 ［(23.7±2.1） % vs （68.9±5.1）%,P<0.05］。miR-19 inhibitor组侵袭细胞数少于miR-19 NC组［(45.1±3.9）个 vs （115.3±8.9）个,P<0.05］。miR-19 inhibitor组UM细胞系M23 EGFR蛋白表达量低于miR-19 NC组（0.43±0.03 vs 1.02±0.02,P<0.05) 。miR-19 inhibitor组AKT蛋白表达量低于miR-19 NC组（0.52±0.04 vs 1.12±0.05,P<0.05)。miR-19 inhibitor组mTOR蛋白表达量低于miR-19 NC组（0.63±0.05 vs 1.41±0.06,P<0.05）。结论　敲低miR-19 表达可抑制UM细胞增殖、迁移和侵袭能力并促进凋亡,其机制可能与EGFR/AKT/mTOR信号通路被抑制有关。     

紫外线照射对人视网膜色素上皮细胞活性和沉默信息调节因子6（SIRT6)表达的影响

目的　探讨紫外线照射对人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19细胞）活性和沉默信息调节因子6（SIRT6)表达的影响。方法　将对数生长期的ARPE-19细胞按照照射剂量随机分为对照组（0 mJ·cm^-2）及7.5 mJ·cm^-2、15.0 mJ·cm^-2、30.0 mJ·cm^-2、60.0 mJ·cm^-2、120.0 mJ·cm^-2、240.0 mJ·cm^-2照射剂量组进行干预培养。照射后继续常规培养24 h，采用倒置荧光显微镜观察细胞形态并拍照，CCK-8法检测细胞存活率，Western blot检测各组细胞中SIRT6的表达情况，采用免疫荧光染色对对照组、30.0 mJ·cm^-2照射剂量组和240.0 mJ·cm^-2照射剂量组ARPE-19细胞中SIRT6进行定位检测。结果　对照组ARPE-19细胞呈梭形贴壁生长，边界清楚，连接紧密，细胞状态良好；30.0 mJ·cm^-2照射剂量组ARPE-19细胞形态不规整，细胞数量略有减少，细胞间连接疏松。CCK-8法检测结果显示:与对照组相比，ARPE-19细胞在不同剂量紫外线照射后，细胞存活率显著降低且呈剂量依赖性（均为P＜0.05）。与对照组相比，除较低照射剂量组（7.5 mJ·cm^-2、15.0 mJ·cm^-2）外，其余各组SIRT6蛋白相对表达量均降低，且随着照射剂量的增加呈剂量依赖性逐渐降低（均为P＜0.05）。经过30.0 mJ·cm^-2紫外线照射后，ARPE-19细胞随着再培养时间的延长，细胞中SIRT6蛋白的相对表达量逐渐下降（均为P＜0.05）。对照组、30.0 mJ·cm^-2照射剂量组和240.0 mJ·cm^-2照射剂量组SIRT6主要表达于ARPE-19细胞核内；与对照组相比，30.0 mJ·cm^-2照射剂量组和240.0 mJ·cm^-2照射剂量组ARPE-19细胞中SIRT6的荧光强度显著降低，且240.0 mJ·cm^-2照射剂量组降低更明显。结论　紫外线照射能够降低ARPE-19细胞的增殖活性，同时也能下调细胞中SIRT6的表达。     

自噬激活剂雷帕霉素对A2E诱导视网膜色素上皮细胞自噬调节的影响

目的 探讨自噬激活剂雷帕霉素对N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺(A2E)诱导视网膜色素上皮(RPE)细胞自噬调节的影响。方法 取人RPE细胞(ARPE-19细胞系)进行培养。将细胞分为4组,其中,对照组：使用DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞;A2E组：使用含20μmol·L^-1 A2E的DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞;雷帕霉素组：使用含100 nmol·L^-1雷帕霉素的DMEM-F12完全培养基预处理细胞1 h后,再用DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞;雷帕霉素联合A2E组：使用100 nmol·L^-1雷帕霉素预处理细胞1 h后,再用含20μmol·L^-1 A2E的DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞。使用CCK-8法检测各组细胞增殖情况,Procarta细胞因子分析试剂盒检测各组细胞培养上清液中细胞因子表达情况。透射电镜观察各组细胞超微结构,Western blot法检测各组细胞自噬相关蛋白Beclin-1和P62的表达,免疫荧光染色法检测...     

自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对A2E诱导视网膜色素上皮细胞自噬的调节以及相关细胞因子表达的影响

目的 探讨自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺(A2 E)诱导视网膜色素上皮(RPE)细胞自噬的调节以及相关细胞因子表达的影响.方法 取人RPE细胞(ARPE-19细胞系)进行培养.将细胞分为4组.对照组:仅使用正常DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞;A2E组:将ARPE-...     

枸杞子提取物对光诱导视网膜损伤的保护作用

目的　探索枸杞子提取物对人视网膜色素上皮（ARPE-19）细胞及C57BL/6J小鼠视网膜光诱导损伤的保护作用。方法　ARPE-19细胞分为正常细胞对照组,光诱导细胞损伤组,细胞低、中、高剂量组（0.1 g·L^-1、0.5 g·L^-1、1.0 g·L^-1枸杞子提取物+光诱导细胞损伤）,测定各组细胞活力以及细胞内活性氧（ROS）含量的变化。40只C57BL/6J小鼠随机分为正常动物对照组,光诱导动物损伤组,动物低、中、高剂量组（280 mg·kg^-1、370 mg·kg^-1、460 mg·kg^-1枸杞子提取物+光诱导动物损伤组）,每组8只。各剂量枸杞子提取物干预组小鼠在6周龄开始给予枸杞子提取物灌胃,8周后再给予10 000 lux光照射24 h;光照结束后ERG评估各组小鼠视网膜功能,OCT检测视网膜外核层（ONL）厚度,FFA检测视网膜血管渗漏情况,HE染色后对视网膜ONL细胞进行计数,同时检测血清中丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性。结果　光诱导细胞损伤组ARPE-19细胞活力下降为正常细胞对照组的61.88%,细胞内ROS含量为正常细胞对照组的1.52倍;细胞低、中、高剂量组ARPE-19细胞活力较光诱导细胞损伤组均明显上升,细胞内ROS含量均明显下降,并均呈剂量依赖性（均为P＜0.05）。与动物对照组相比,光诱导动物损伤组小鼠ERG暗适应a波、b波振幅和明适应b波振幅均明显下降,动物低、中、高剂量组各波的振幅均得到不同程度改善。光诱导动物损伤组小鼠视网膜出现萎缩灶、血管渗漏和血管末端成珠样结构,视网膜ONL厚度变薄,为（52.18±4.23) μm,ONL每列细胞数明显减少,为（17.63±1.30）个;动物低、中、高剂量组小鼠视网膜病理改变及视网膜ONL厚度与ONL每列细胞数均得到不同程度改善,尤其动物高剂量组改善最为明显,ONL厚度为（59.72±2.76）μm, ONL每列细胞数为（20.00±1.51）个,与光诱导动物损伤组相比差异均有统计学意义（P=0.007、0.004）。相对于光诱导动物损伤组,动物低、中、高剂量组小鼠血清SOD、GSH-Px活性均明显提高,MDA含量均明显下降,且均呈剂量依赖性（均为P＜0.05）。结论　枸杞子提取物可以一定程度上保护视网膜免受光损伤。     

上调microRNA-27b对血小板衍生因子诱导下的人视网膜色素上皮细胞增殖的抑制作用

目的　观察过表达的microRNA-27b(miR-27b)对血小板衍生因子（platelet-derived growth factor,PDGF）诱导下的人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）增殖的抑制作用，探讨miR-27b在ARPE细胞生物学行为中的作用及其调控机制。方法　将miR-27b过表达质粒或空载体转入ARPE-19细胞36 h后，用终浓度为20 μg·L^-1的PDGF预处理ARPE-19细胞5 h。根据转染物不同，将实验分为空白对照组（control组）、miR-27b阴性对照组（miR-27b NC组）、miR-27b模拟物转染组（PDGF+mimics组）和空载体转染组（PDGF+NC组）。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测转染后各组ARPE-19细胞中miR-27b的表达水平；MTT法测定各组细胞活性；通过流式细胞术评估各组细胞周期的分布变化；Western blot检测各组细胞周期的正向调控因子cyclinD1、CDK4和负向调控因子p21^CIP1和p27^KIP1的表达水平。结果　qRT-PCR检测结果显示:经PDGF处理5 h，与miR-27b NC组相比，PDGF+NC组miR-27b的表达显著降低（P<0.01）；与PDGF+NC组相比，PDGF+mimics组miR-27b的表达增加（P<0.01）。MTT检测结果显示:与miR-27b NC组相比，PDGF+NC组ARPE-19细胞的光密度（D）值增加(P<0.01)；而与PDGF+NC组相比，PDGF+mimics组可明显抑制ARPE-19细胞的D值(P<0.01)。流式细胞术检测结果显示:与空白对照组和miR-27b NC组相比，PDGF+NC组G0/G1期细胞的百分比显著降低，S期细胞的百分比增加（P<0.05）；而与PDGF+NC组相比，PDGF+mimics组miR-27b的过表达显著增加了G0/G1期细胞的百分比，并抑制了细胞增殖（均为P<0.05）。Western blot检测结果显示:与PDGF-NC组相比，PDGF+mimics组miR-27b的过表达可显著降低cyclinD1蛋白和CDK4蛋白的表达，同时增强了p21^CIP1蛋白和p27^KIP1蛋白的表达（均为P<0.05）。结论　上调miR-27b表达可抑制PDGF诱导的ARPE细胞增殖。