抗人DR5单抗对人肝癌细胞系的凋亡作用

目的:探讨抗人DR5单克隆抗体(mDRA-6)对人肝癌细胞系的凋亡诱导活性。方法:常规培养人肝细胞HL7702,单克隆抗体对细胞的杀伤活性用MTT法检测、对细胞的凋亡作用采用Hoechst33258染色荧光显微镜下观察细胞形态变化及Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术定量分析技术。结果:MTT的结果显示抗体的量和细胞杀伤率之间有明显的线性关系,随着抗体浓度的增加,细胞的杀伤率就增加;荧光显微镜下mDRA-6诱导导致细胞呈现典型的细胞凋亡的形态性特特征;流式细胞术检测显示,2 mg/L的mDRA-6作用人肝肝癌癌细胞系SMMC-7721细胞6 h,细胞凋亡率为35%。结论:mDRA-6能够诱导人肝癌细胞系凋亡,mDRA-6具有诱导细胞凋亡的活性。     

非竞争ELISA法测定抗DR5单克隆抗体功能性亲和常数

目的:测定抗DR5单克隆抗体功能性亲和常数。方法:采用非竞争性ELISA固相法,经确定最佳抗原包板浓度、最佳抗原包板时间及最佳抗原与抗体结合反应时间后,得到DR5与抗DR5的两株单克隆抗体的抗原抗体结合反应曲线,计算抗DR5两株单抗的亲和常数。结果:抗DR5(366EC)的功能性亲和常数在2.63×109M-1水平,抗DR5(mDRA-6)的功能性亲和常数在1.004×109。结论:抗DR5与DR5结合能力较强,为今后进行免疫学检测和开发进行肿瘤靶向治疗提供了理论基础。     

抗DR5单链抗体的构建与表达

目的:构建抗DR5单链抗体的真核表达载体,以实现真核表达。方法:RT-PCR法从分泌抗DR5抗体的杂交瘤细胞中合成第一链cDNA,用通用引物钓取单克隆抗体的轻、重链可变区基因。经测序和BLAST比对,证实为一株新的鼠源性抗体基因。利用overlapping PCR方法构建单链抗体真核表达载体pCMV-express-scFv,Lipofectamine2000法转染宿主细胞293T,72 h后ELISA法检测细胞培养上清,检测抗体表达。结果:经序列鉴定和BLAST比对证实克隆的抗体轻、重链可变区基因为新鼠源抗体基因。ELISA实验结果显示抗体有效表达在细胞培养上清中。结论:成功得到抗体轻、重链可变区基因,实现了抗DR5单链抗体的真核表达,为进一步的研究和开发奠定了基础。     

5-氮杂胞苷对胃癌裸鼠移植瘤死亡受体DR4和DR5表达的影响

[目的]研究5-氮杂胞苷(5-Aza-CdR)对胃癌裸鼠移植瘤中死亡受体4(DR4)和死亡受体5(DR5)表达的影响.[方法]利用RT-PCR方法检测5-Aza-CdR处理后的胃癌裸鼠移植瘤内DR4和DR5的RNA表达水平、用MS-PCR检测5-Aza-CdR处理后的胃癌裸鼠抑制瘤内DR4和DR5启动子区甲基化水平.[结果]5-Aza-CdR能够抑制胃癌裸鼠移植瘤的生长.5-Aza-CdR能够逆转胃癌裸鼠移植瘤中DR4和DR5的启动子甲基化水平,并上调DR4和DR5的表达水平.[结论]去甲基化药物5-Aza-CdR能够抑制裸鼠胃癌移植瘤生长,提示该药物有治疗作用且能够诱导DR4和DR5的启动子区去甲基化从而使DR4和DR5的表达水平升高.     

死亡受体5诱导Jurkat细胞凋亡的作用

目的:探讨DR5在TRAIL诱导Jurkat细胞凋亡中的作用. 方法:用含人全长DR5细胞外全长结构域重组DR5免疫BALB/c小鼠,制备抗DR5 mAb. 将96孔U型细胞培养板加1×105/孔Jurkat细胞和5 mg/L抗DR5 mAb,采用TRAIL试剂盒检测细胞凋亡率. 结果:抗DR5 mAb与Jurkat细胞表面的DR5作用后,TRAIL对Jurkat细胞的杀伤功能几乎被抗DR5 mAb完全阻断,阻断率高达90.49%. 结论:DR5在TRAL诱导的Jurkat细胞凋亡中起关键作用.     

抗CLCN5单克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备抗氯离子通道蛋白5（CLCN5）单克隆抗体（mAb）并对其进行鉴定。方法：用人CLCN5为抗原免疫BLAB／c小鼠，用常规方法进行细胞融合，经筛选及克隆化建立可稳定分泌抗CLCN5 mAb的杂交瘤细胞株；用ELISA及Western blot进行抗体的鉴定。结果：筛选到4株可稳定分泌抗CLCN5 mAb的细胞株；Western blot显示，在4株抗体中有1株在相对分子量为83kDa处出现1条特异性条带．说明该单克隆抗体可与HSG胞浆蛋白中的CLCN5蛋白特异性地结合。结论：本实验成功获得1株可特异性识别CLCN5的单克隆抗体细胞株，可用于肾结石、X-连锁综合征的进一步研究、临床诊断及相关试剂盒等的开发研制。     

顺铂通过活性氧协同抗hDR5抗体诱导食管癌细胞凋亡

目的：探讨顺铂与抗死亡受体5（DR5）激动性抗体mDRA-6联合应用对食管癌细胞系EC9706细胞凋亡的影响及作用机制.方法：顺铂、抗体mDRA-6单独或联合作用于食管癌细胞,用流式细胞术检测药物的细胞毒作用、食管癌细胞表面DR5表达、细胞凋亡、细胞内活性氧水平、以及线粒体膜电位的变化;在荧光显微镜下观察细胞凋亡的形态学变化及DR5表达.结果：顺铂和抗体mDRA-6对食管癌细胞均具有细胞毒作用,并具有剂量依赖性,而且顺铂明显提高食管癌细胞对抗体mDRA-6细胞毒的敏感性.顺铂、抗体mDRA-6单独或联合应用均导致食管癌细胞呈现典型细胞凋亡特征.流式细胞术分析结果显示,mDRA-6和顺铂均诱导食管癌细胞凋亡,而且顺铂明显提高细胞对mDRA-6诱导细胞凋亡的敏感性;顺铂增强食管癌细胞表面及胞内的DR5表达,提高细胞内活性氧水平,降低线粒体膜电位.结论：顺铂主要通过活性氧激活细胞内线粒体细胞凋亡信号传导途径以及增强DR5表达,与抗体mDRA-6联合协同诱导食管癌细胞凋亡.研究结果对进一步探讨抗DR5激动性抗体及TRAIL的抗肿瘤临床应用有一定的指导意义.     

顺铂增强抗人DR5单克隆抗体对白血病U937细胞的凋亡作用

通过探讨鼠抗人DR5单克隆抗体(mDRA-6)与顺铂(DDP)联合应用对白血病细胞U937凋亡作用的影响,得出结论:抗人DR5单克隆抗体mDRA-6与DDP对U937细胞具有显著的协同杀伤作用.     

死亡受体DR5与肿瘤细胞凋亡的研究进展（上）

死亡受体DR5与肿瘤凋亡的研究近年来十分热门,波及到肝癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、白血病、妇科肿瘤等,本文就相关问题进行综述。     

颈椎间盘髓核组织中TRAIL及DR5的表达与髓核细胞凋亡的相关性研究

目的检测颈椎间盘内髓核组织细胞密度、细胞凋亡率以及肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）及死亡受体5（DR5）的表达。方法实验组30个标本来自脊髓型颈椎病患者前路手术所切取的椎间盘组织（C3-C7）,对照组30个标本为颈椎创伤患者前路手术所取得的椎间盘组织。采用HE染色观察髓核组织中凋亡小体和细胞密度,原位DNA片段末端标记法（TUNEL）检测凋亡细胞率,用免疫组织化学法检测TRAIL、DR5的表达。结果实验组髓核组织中的细胞密度均低于对照组,TUNEL阳性细胞率均高于对照组（P〈0.01）;实验组TRAIL、DR5染色阳性细胞率均高于对照组（P〈0.05）。将两组全部60例颈椎间盘标本合并后进行Pearson相关分析,颈椎间盘TUNEL阳性细胞率与细胞密度之间呈负相关（r=-0.969,P〈0.01）;两组髓核内TRAIL、DR5染色阳性细胞率与TUNEL阳性细胞率之间呈正相关r=0.921和0.755,P〈0.01）。结论细胞密度下降参与了颈椎间盘的退变过程,细胞凋亡是椎间盘髓核细胞减少的原因之一,颈椎间盘组织中存在DR5/TRAIL诱导的凋亡途径。     

抗hMIF单克隆抗体的活性鉴定及其对脓毒症小鼠的保护作用

目的 对制备的人巨噬细胞移动抑制因子(anti-human macrophage migration inhibitory factor,hMIF)单克隆抗体进行生物学活性鉴定,并研究其对脓毒症小鼠的保护作用.方法 通过ELISA、Western blot、免疫组织化学等方法鉴定抗MIF单克隆抗体F11的亚类、抗体亲和力及特异性;通过一氧化氮(nitric oxide,NO)释放抑制试验和异构酶活性抑制试验,鉴定F11抗体的生物学活性;选用C57 BL/6J小鼠构建CLP、LPS诱导脓毒症模型,研究F11抗体对脓毒症小鼠生存率的保护作用及对血清细胞因子TNF-α、IL-6的影响.结果 F11抗体亚类为IgG1型,亲和力为2.5×1010,Western blot 及免疫组织化学显示强阳性;F11抗体显著抑制MIF刺激RAW264.7细胞释放NO(P ＜0.01)及MIF异构酶活性(P＜ 0.01);明显提高脓毒症小鼠生存率(CLP模型:P＜0.01,LPS模型:P ＜0.05)且具有剂量依赖关系,并对CLP术后血清TNF-α和IL-6的升高具有明显抑制作用(P＜0.05).结论 成功制备了高特异性、高亲和力、具有异构酶活性抑制作用的抗MIF单克隆抗体,显著提高致脓毒症模型小鼠生存率并降低小鼠血清TNF-α、IL-6水平.     

5—羟色胺抗独特型单克隆抗体的功能鉴定

对5-羟色胺（5-HT）抗独特型单克隆抗体的功能进行鉴定．方法：细胞培养法，免疫组织化学ABC法和形态计量法．结果：培养平滑肌细胞显示5-HT受体免疫反应阳性，在正常培养基培养的平滑肌细胞的平均长度为（18．8±35．4）μm．培养基中含不同浓度的5-HT抗独特型单克隆抗体（分别为0．01％，0．03％，0．10％，0．30％，1％抗体原液），平滑肌细胞的平均长度分别缩短为（175．6±43．3）μm，（16．2±46．2）μm，（116．9±25．8）μm，（89．5±22．8）μm，（79．9±21．6）μm，除含0．01％抗体原液组外均比正常组有非常显著的差别（P＜0．01）．结论：该抗独特型单克隆抗体具有与5-HT相类似的诱导平滑肌收缩的功能，5-HT受体可能介导了这种功能．     

抗猪囊尾蚴KD26抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株建立和特性鉴定

目的: 建立针对猪囊尾蚴KD26抗原的单克隆杂交瘤细胞株,生产相应的单克隆抗体,用于囊虫病免疫保护机制的基础研究和囊虫病临床免疫诊断的应用。方法: 用SDS-PAG E电泳,分离纯化制备猪囊尾蚴KD26抗原免疫6周龄BALB/C小鼠3次,无菌取出脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/O(比率10:1),在50% PEG (4 000MW)作用下进行细胞融合,随后在HT培养液中进行选择性培养、筛选和克隆;常规的中期染色体法分析染色体,单克隆抗体鉴定采用免疫双扩散法测定其免疫球蛋白亚类,采用ELISA法测定单抗效价并作特异性鉴定。结果: 用常规的有限稀释法对杂交瘤细胞进行了3次筛选和克隆化后,获得了1株杂交瘤XH,染色体数为96,能稳定分泌抗猪囊尾蚴KD26单抗,单抗类型为IgG1,抗体滴度为1:1 000,其与血吸虫、弓形虫、细粒棘球绦虫抗原均不发生交叉反应。结论: 应用杂交瘤技术获得了1株能稳定分泌高滴度抗猪囊尾蚴KD26抗原的单克隆抗体细胞株。     

抗人血红蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的 运用杂交瘤技术制备抗血红蛋白(hemoglobin, Hb)单克隆抗体,为进一步探讨Hb在帕金森病中的发病机制及早期诊断中的意义奠定基础。方法 用重组人Hb作为抗原免疫Balb/c小鼠,并将其脾细胞与同系骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤,经3次有限稀释法及酶联免疫吸附试验法筛选获得抗人Hb单克隆抗体杂交瘤株5B1。腹腔注射于免疫抑制Balb/c小鼠产生腹水,并利用Dot blotting、酶联免疫吸附实验,免疫共沉淀、Western blotting法及免疫组织化学染色法进一步测定抗体效价,获得一特异性抗Hb单克隆抗体。结果 成功制备出1株高亲和力、特异性好的抗Hb单克隆抗体。结论 制备的单克隆抗体对Hb具有特异性(包括人血、猴及小鼠),为进一步研究Hb在帕金森病(Parkinson's disease,PD)中的作用提供了有力的特异性工具。     

金属螯合四肽的化学合成及单克隆抗体的制备

为了合成金属螯合四肽并制备其单克隆抗体。从初始原料起，采用液相接肽等方法。合成三乙撑四胺钴（Ⅲ）Ｎ－（α－羧基－苯乙基）－β－Ａｌａ－ＧｌｙＯＨ半抗原，并将其偶联到载体蛋白ＢＳＡ上制成抗原，免疫小鼠，采用杂交瘤方法制备单克隆抗体。成功地合成了该金属螯合四肽，获得了８株单克隆抗休杂交瘤细胞系，并对这８株ＭｃＡｂ类与亚类等特性了。可根据需要化学合成一些分子量很小的肽，并制备其单克隆抗体。     

斑点酶联免疫吸附试验检测抗独特型单克隆抗体

用斑点酶联免疫吸附试验检测抗独特型单克隆抗体,方法简便、快速,敏感性高,特异性强,所需样品量少,点样后至少可保存一个月;用戊二醛处理硝酸纤维素膜可以增强蛋白吸附。     

单抗偶联靶向超抗原SEA对人膀胱癌细胞株BIU-87的抑制作用及其机制

目的 研究单抗偶联靶向超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)对人膀胱癌细胞株BIU-87的抑癌作用.方法 实验分对照组、SEA组及单抗靶向SEA组;以外周血单个核细胞为效应细胞,BIU-87为靶细胞,以不同效靶比接种细胞;对照组予全培养液,后2组分别予不同稀释浓度的SEA及单抗靶向SEA,以细胞计数kit-8(CCK-8)测定各组BIU-87细胞的增殖抑制率;荧光染色法观察凋亡形态学变化;流式细胞术检测凋亡率,Western印迹检测Bax、Bcl-2蛋白的表达;酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定共培养上清白细胞介素(IL)2、肿瘤坏死因子(TNF)α、γ干扰素(IFN-γ)含量.结果 单抗靶向SEA组细胞增殖抑制率为[(31.2±2.6)%～(88.7±3.0)%],显著高于对照组[(5.8±3.0)%～(16.5±4.0)%]及SEA组[(20.7±2.1)%～(68.6±4.0)%](P＜0.05).实验组细胞均发生典型的凋亡形态学改变,其中单抗靶向SEA组凋亡率为[(14.6±0.7)%～(66.5±3.3)%],显著高于SEA组[(9.1±0.6)%～(29.9±1.3)%]及对照组[(4.6±0.7)%～(6.5±0.3)%](P＜0.05).实验组较对照组均有上调Bax/Bcl-2比值作用,其中单抗靶向SEA组为(3.29±0.34),显著高于SEA组(1.21±0.05)及对照组(0.45±0.15)(P＜0.05).单抗靶向SEA组12、24 h共培养上清中的IL-2、TNF-α、IFN-γ浓度与SEA组比较差异均无统计学意义(均P＞0.05).结论 单抗靶向SEA对膀胱肿瘤细胞显示出更强大的增殖抑制作用,这可能与其进一步上凋肿瘤细胞Bax/Bcl-2比值促进其凋亡有关.     

抗氯霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备及筛选

目的获得稳定、高效分泌抗氯霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。方法以CAP-HS-BSA免疫BALB/c小鼠,用细胞融合技术筛选抗氯霉素单克隆抗体杂交瘤细胞,体内诱生腹水法大量制备单抗。捕获ELISA法测定小鼠免疫球蛋白亚型,间接ELISA法测定腹水效价;用两步硫酸铵法和G蛋白亲和层析法来纯化腹水。结果成功建立了一株分泌抗CAP单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞4D10。经检测,其分泌的抗体亚类为IgG1,杂交瘤染色体数目90-110条,间接ELISA检测诱生小鼠腹水的抗体效价达1∶2.56×105,纯度达95%,该细胞连续培养生物学性状稳定。结论成功制备的抗氯霉素单克隆抗体4D10效价高、纯度高,为利用该单抗研制检测氯霉素残留试剂盒提供原材料。