金纳米微粒DNA芯片检测EGFR基因突变

目的:研制以金纳米微粒标记和银染色信号放大技术为基础的DNA芯片,用于快速检测表皮生长因子受体(EGFR)基因突变。方法:氨基修饰的寡核苷酸探针固定于醛基化玻璃片基制备DNA芯片,5′-生物素标记引物用于PCR扩增EGFR基因第18、19、20、21外显子片段,杂交后含互补序列的PCR产物结合于芯片,金纳米微粒借助表面包被的链亲和素识别标记于PCR产物5′-端的生物素而与之结合,再经银染色法放大杂交信号,依据芯片杂交结果判读EGFR基因突变,并用DNA直接测序法进行验证。结果:所制备的DNA芯片可快速检测肿瘤组织标本中EGFR基因突变,检测敏感性达到10-9 mol/L,可检出标本中5%的基因突变。结论:所制备的DNA芯片具有高特异性和敏感性,且操作简便,适用于临床肿瘤组织标本基因突变的快速检测。     

荧光定量聚合酶链式反应联合检测性病病原微生物

目的：探讨荧光定量PCR联合检测性病病原体的,临床价值。方法：用荧光定理PCR（FQ—PCR）方法,对淋球菌（NGH）、沙眼衣原体（CT）、解脲支原体（UU）、梅毒螺旋体（TP）4种性病病原微生物进行定量测定,并与定性PCR比较。结果：两种PCR方法对NGH、CT、UU、和TP四种病原体检测的总符合率分别为94．83％、89．02％、95．79％、和95．65％,阳性率差异分别为1．72％、1．22％、2．11％和0,两种方法阳性率差异均无显著性意义（P〉0．05）。阳性标本定量平均拷贝数对数分别为6．71±3．36、5．56±2．48、6．83±3．17和4．89±3．52。结论：FQ—PCR操作简便、快速,并能准确定量。对于性传播疾病的诊断、病情的发展和预后监测、疗效评价、指导用药均具有很高临床应用价值。     

基于悬浮芯片技术的56种病原微生物的高通量检测

目的:建立高通量、快速、可靠、经济的病原微生物诊断技术平台。方法:设计和合成针对56种常见病原微生物的探针和阳性对照,采用悬浮芯片技术,对56种病原微生物的阳性标准品进行检测。结果:56种标准品的检测值显著高于阴性对照,各病原微生物的阳性标准品和各探针之间无交叉反应。结论:建立了高通量、快速、可靠、经济的病原微生物诊断技术平台,为突发传染病的病原体诊断提供技术储备。     

电化学DNA芯片快速检测临床病原微生物的研究进展

电化学DNA芯片技术是集合聚合酶链反应、传感技术及生物芯片三大技术优点来检测目标核酸序列的新方法。目前,因电化学DNA芯片操作简单快速、特异性好、敏感性高、检测费用低、可同时检测多个样本、易于微型化和自动化等优点被用于多个领域,如传染病快速检验、疾病基因诊断、环境监测、食品安全、流行病学研究、法医鉴定及临床病源微生物的检测诊断等。该文对电化学DNA芯片工作原理及其在临床病源微生物检测诊断中的应用研究进展进行综述。     

病原微生物盲样鉴定结果分析

目的通过盲样考核活动,评价本实验室检测微生物的技术水平和能力,确保日常检测结果的准确、可靠。方法按照GB/T4789-4、5-94和2003进行检测。结果盲样检出:1#沙门氏菌属O4群;2#志贺氏菌;3#肠炎沙门氏菌;4#福氏志贺氏菌2a;5#宋内氏1相;6#鼠伤寒沙门氏菌;7#福氏志贺氏菌1a;8#鲍氏志贺氏菌1-5型;9#嗜水气单胞菌。结论参加盲样考核可提升该实验室检测微生物能力,促进实验室管理体系进一步完善。     

慢性咽炎咽分泌物培养和病原微生物检测分析

目的探讨慢性咽炎的病原学感染情况。方法取56例不同类型的慢性咽炎的咽后壁分泌物进行细菌培养及药敏试验。结果56例患者中，27例（48．21％）出现细菌学异常，治疗2周后10例显效，15例有效，2例无效。结论病原微生物感染不是慢性咽炎的主要病因，但慢性咽炎的患者可出现细菌学异常，应采用针对性的抗生素配合治疗。     

大肠杆菌表达耐热DNA聚合酶的纯化和鉴定

探讨工程菌表达的耐热ＤＮＡ聚合酶的纯化方法。（２）方法收集ＩＰＴＧ诱导带有耐热ＤＮＡ聚合酶（ＴＤ聚合酶）基因表达质粒的工程菌株ＤＮ－ＴＤ４，用溶菌酶裂解，６０℃处理后，上清液用硫酸铵沉淀，根据溶解度差异进行粗分级，然后进行离子交欣慰以析细分级，并经聚合酶链式反应鉴定其活性。     

老年女性尿道感染病原微生物的检测分析

目的:对老年女性尿道感染病原微生物进行检测分析。方法:收集2011年1月至2012年1月收治的老年女性尿道感染患者1 267例,对其病原微生物进行培养鉴定和分析。结果:在收集的1 267份标本中,有821例呈单项阳性,感染率为64.8%,其中,有234例(28.5%)为非细菌性感染;单项感染中,解脲支原体(ureaplasma urealyticum,UU)的感染率最高,其次为淋球菌和沙眼衣原体(chlamydia trachomatis,CT)。结论:根据老年女性尿道感染病原微生物的检测和分析指导临床用药,可有效降低细菌的抗药性,有利于提高临床治疗效果,值得广泛推广。     

基因芯片技术在病原微生物耐药性检测中的应用

耐药性又称抗药性,一般是指病原体对药物反应性降低的一种状态。细菌耐药性的问题已日益严重,从临床分离的志贺氏菌约98%是耐药的,而且常常是对多种抗生素有抗性[1] 。细菌对三种以上不同类抗菌药物耐药者即可称为多重耐药菌(Multi -drugresistantbacteria ,MDR)。1992年美国疾     

聚合酶链反应法检测宫颈分泌物中病原微生物样本采集方法研究

聚合酶链反应（PCR）技术以其基因扩增的灵敏性、分子杂交的特异性和光谱技术的精确定量等优点,在血液和体液病毒、病原微生物定量检测中发挥了重要作用。但是长期以来,由于人们对宫颈分泌物定量检测重视程度较差,文献【1,2】曾研究过用接种环和棉拭子取样进行阴道菌群的定量,但由于分泌物的黏度、密度不同,用接种环定量体积的方法本身不合理,     

重组葡激酶及其在大肠杆菌中高效表达与纯化

目的：研究高效表达葡激酶载体的构建及其体外表达与产物的纯化。方法：用PCR方法扩增葡激酶cDNA,插入质粒pET-22b中构建成表达载体,转化入大肠杆菌BL21（DE3),经IPTG诱导表达,表达产物用Q-Poros和S-Sepharose纯化。结果：经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证明所构建质粒为葡激酶重组质粒,体外表达产物经离子交换纯化后HPLC纯度达98%以上,SDS-PAGE和Western Blot实验证实该产物为葡激酶。结论：成功构建了重组葡激酶表达载体,并经表达纯化获得高纯度葡激酶,为产业化和临床应用奠定了良好基础。     

分离病鸡3株大肠埃希菌的鉴定及毒力和细胞毒测定

目的分离病鸡中3株大肠埃希菌和鉴定其对小鼠的致病力及对Vero细胞毒性作用.方法将按常规细菌的分离并鉴定的3株大肠埃希菌,接种至昆明系小鼠体内做毒力试验,计算死亡率和LD50(50%致死量).采用微量单层细胞培养法测定细菌上清液的细胞毒性作用.结果分离的3株细菌生物学性状均符合大肠埃希菌.分离的3株细菌对小鼠致病率为100%;菌量达6×1011CFU/L时死亡率为100%;LD50为1.5×1010 CFU/L.分离的3株细菌对2株细胞均无细胞毒性作用.结论分离的3株致病性大肠埃希菌与O157∶H7 株对小鼠致病力相似,可能是潜在的人类的传染源.     

非特异性下腰痛患者晨尿HCMV病毒分离培养及鉴定

目的探讨非特异性下腰痛（NLBP）与人巨细胞病毒（HCMV）感染的关系。方法50例NLBP患者为病例组,与之年龄、性别相仿的36例健康人为健康对照组。各研究对象取2ml空腹中段晨尿接种至人胚肺成纤维细胞中培养,观察HCMV特异性细胞病变效应（CPE）;培养物均经PCR检测HCMV UL83 DNA。结果NLBP组中HCMV CPE阳性9例,健康对照组均阴性。培养物中,CPE阳、阴性的PCR分别为阳、阴性。组间比较差异有显著性（χ^2=5．44,P=0．02）。结论HCMV感染可能是NLBP的病因之一。     

网状分枝扩增技术快速检测大肠埃希菌O157∶H7及其他产志贺样毒素大肠埃希菌

目的：建立一种简便、快速、灵敏和特异的检测食品和临床标本中大肠埃希菌O157∶H7及其他产志贺样毒大肠埃希菌(STEC)的方法。方法：设计并合成了检测志贺毒素2(stx2)基因特异的环形探针和捕获探针，确定网状分枝扩增方法（RAM）的灵敏度；含有stx2基因的不同血清型的菌株包括O46∶H38、O22∶H8 、O111∶NM，用于RAM特异度的测定。用RAM检测所有分离的菌株，并进一步对瞬时RAM进行研究。结果：RAM最低能检测10个拷贝的stx2合成靶基因和临床分离的菌株，表明RAM与PCR具有一样的灵敏度。特异度的测定结果表明不同血清型的大肠埃希菌均为stx2阳性，而非致病性大肠埃希菌ATCC23716则为阴性。在32株菌株中，28株细菌含有stx2基因，其余则为阴性， 与PCR检测结果100%一致。瞬时RAM结果也表明最低能检测10个细菌，检测信号的出现依赖于样品的浓度。 结论：RAM的简便和等温扩增特点可替代PCR检测各种标本中大肠埃希菌O157∶H7和STEC。     

检测肠出血性大肠埃希菌O157:H7的环介导等温扩增和PCR法比较

目的建立基于环介导等温扩增(LAMP)技术的肠出血性大肠埃希菌(EHEC)O157:H7快速简便检测方法,并与PCR进行比较。方法针对EHEC O157:H7保守的rfbE基因序列,设计特异性引物,建立LAMP和PCR检测技术并优化其反应条件,比较这两种检测方法的灵敏度、特异性和对实际样品的检测结果。结果成功建立了LAMP和PCR检测体系,灵敏度检测结果显示,LAMP检测限低至10 cfu/ml,PCR检测限为102cfu/ml,LAMP检测灵敏度高于PCR;对39株近源菌进行检测,结果显示,LAMP法仅7株EHEC O157:H7得到阳性结果,非EHEC O157:H7菌株均为阴性,PCR产物则出现非特异性条带,LAMP法特异性比PCR法高。对于32份猪肉样品的检测,LAMP和PCR与常规检测结果一致,3份样品检测阳性。结论 LAMP检测技术的特异性和灵敏度较PCR高,并且操作简便、检测成本低,耗时短,更有望发展成为快速准确检测EHEC O157:H7的有效手段。     

几种常见肠道致病菌多重PCR检测的效果评价

目的：建立一种应用多重PCR技术,能够同时快速准确检测大肠杆菌O157、副溶血性弧菌、普通变形杆菌和单核细胞增生李斯特菌4种常见肠道致病菌的方法。方法：根据大肠杆菌O157、副溶血性弧菌、普通变形杆菌、单核细胞增生李斯特菌的特异基因作为目的基因,设计相应的引物,并进行实验优化以确立对4种肠道致病菌的检测体系。并对市售经果汁样品人工随机染菌后进行模拟样品验证。结果：该多重PCR方法能够有效地扩增出相应致病菌的目的基因片段,其中单核细胞增生李斯特菌扩增片段为155 bp,大肠杆菌O157扩增片段为366 bp,变形杆菌扩增片段为522 bp,副溶血弧菌扩增片段为199 bp,且特异性较强。对4种目标菌的检测灵敏度可达到103CFU/mＬ。能够检测出模拟样品中随机接种的任意3种细菌。结论：利用建立的多重PCR可以快速、准确地筛查大肠杆菌O157、副溶血弧菌、普通变形杆菌和单核细胞增生李斯特菌。     

提高石蜡包埋组织中提取DNA质量的实验研究

目的 :确定从石蜡包埋组织中提取 DNA的最佳条件。方法 :改变石蜡切片厚度、组织脱蜡时间、消化液蛋白酶 K浓度、组织消化时间等参数 ,组合出 96种不同提取 DNA的条件 ,比较各种条件下所提取 DNA的数量和质量。结果 :各种条件均可以提取出一定数量的 DNA,但有些条件所提取的 DNA不适合于做 PCR及 DNA序列测定。结论 :从石蜡包埋组织中提取 DNA的最佳条件为 ,1 0 .0 μm组织切片 ;切片脱蜡 2次 ,脱蜡时间分别为 2 h和 1 2 h;消化液中蛋白酶 K浓度5 0 0 mg· L-1;组织消化 1 2 h     

一种检测生活饮用水和污水中生物有效性铜离子的微生物报告菌株的构建

目的：构建一种能够检测生活饮用水和污水中生物有效性铜离子的微生物报告菌株。方法： 首先采用交叉PCR将增强型绿色荧光蛋白与铜离子“外排泵”基因 copA 的启动子融合构建响应铜离子的 CopAp::gfpmut2 -pET28a感应元件。然后利用Red重组系统分别敲除野生型大肠杆菌（ E .c o l i ）MC4100体内 负责外排转运铜离子的基因,并将感应元件转化至突变菌中完成菌株的构建。最后优化出最佳检测条件, 并将其初步应用于检测水环境中铜离子。结果：相对野生型菌株, E .c o l iΔ cusA -Δ copA -Δ cueO 突变菌对铜 离子的敏感性提高了64倍,从而使报告菌株的荧光信号显著增强,且荧光信号强度与铜离子浓度呈剂量依 赖关系;报告菌株的线性检测范围为0.05～2.5μmol/L（0.0032～0.16mg/L）Cu2+;与原子吸收光谱法相 比,其对生活饮用水中0.05mg/L和1mg/L铜离子的回收率分别为87.90%和104.37%。结论：本研究构建报 告菌株的灵敏度能够有效覆盖国标中针对生活饮用水和污水中铜离子的限制,从而为报告菌株的应用奠定 了技术基础。     

N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶基因的克隆与表达

目的:为了获得N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶基因表达的两重组菌.方法:以大肠杆菌C600染色体DNA为模板,通过引物设计和PCR扩增,克隆获得编码Neu5Ac醛缩酶基因(nanA)的片段;以pET28b构建的nanA基因重组质粒pRY1转化 E.coli BL21(DE3),然后将nanA基因片段组入到pDR540载体的Ptac启动子下游,所得重组菌 E.coli DH5α/pRY3的nanA基因在tac启动子控制下呈组成型表达.结果:DNA序列测定证明,该基因的开放阅读框(open reading frame,ORF)大小为894 bp, 编码298个氨基酸组成的酶蛋白;SDS-PAGE显示,纯化的目的蛋白为33 kD的单一条带.以pET28b构建的nanA基因重组质粒pRY1转化 E.coli BL21(DE3),在得到的转化子 E.coli BL21(DE3)/pRY1中,nanA基因受lac启动子控制,无需IPTG或乳糖所诱导.在N-乙酰(-D)-神经氨酸醛缩酶固定化酶的催化下合成N-乙酰-D-神经氨酸的合成效率为78.3%,结晶回收率为90.2％,总回收率为70.6%.全波长扫描分析表明:本实验室结晶品与Sigma公司商品的全波长扫描图谱有相同的特征.结论:所构建的诱导型产酶菌株 E.coli BL21(DE3)/pRY1和组成型表达菌株 E.coli DH5α/pRY3都可较多量的产酶.合成的结晶品具有N-乙酰-D-神经氨酸的特征.     

脐带间质干细胞移植治疗对MRL/lpr狼疮鼠单核细胞趋化蛋白-1的影响

目的:探讨脐带间质干细胞(UC-MSCs)治疗MRL/lpr狼疮鼠的作用机制。方法:24只MRL/lpr鼠随机分为UC-MSCs1次移植治疗组(G1)、UC-MSCs3次移植治疗组(G2)、对照组(G3)。酶联免疫吸附法检测血清和尿液单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)水平,蛋白印迹法检测肾脏MCP-1蛋白水平的表达,实时定量PCR检测肾脏MCP-1基因mRNA表达,免疫组化检测MCP-1蛋白在肾脏表达。结果:(1)29周时G2组血液MCP-1水平为827.70±259.36pg/mL,显著低于G3组1 325.45±352.28pg/mL(P<0.05);28周时G2组尿液MCP-1为239.93±31.47pg/mL,显著低于对照483.52±184.37 pg/mL(P<0.01)。(2)G2组(0.30±0.02)和G1组(0.40±0.02)MCP-1蛋白表达与G3(0.67±0.05)组比较差异有统计学意义(P<0.01);G2组也显著低于G1组(P<0.05)。(3)G2组(0.30±0.01)和G1组(0.39±0.02)MCP-1基因mRNA表达显著低于对照组(0.79±0.15)(P<0.05),G2组显著低于G1组(P<0.05)。(4)MRL/lpr鼠MCP-1主要定位于肾小球系膜区和肾间质炎性细胞浸润处及肾小管。G3组肾小球系膜区强表达MCP-1,治疗G1、G2组表达明显减弱。结论:UC-MSCs可能通过抑制MCP-1表达而发挥治疗作用。