新鲜肿瘤组织单细胞悬液的制备方法

新鲜肿瘤组织单细胞悬液的制备方法董敬朋，陈艺华，张素娟单细胞悬液在肿瘤病理、肿瘤分子生物学行为等研究方面均有广泛用途，如乳腺癌的癌细胞倍体测定应先制备单细胞悬液，ＰＣＲ技术用于某些肿瘤的诊断或其他疾病诊断也可先制备单细胞悬液，然后再提取ＤＮＡ，以最大...     

机械法与机械-酶消化法制备大鼠膈肌组织单细胞悬液的比较

文题释义： 流式细胞分析技术：简称流式细胞术,是20世纪70年代初发展起来的一种在功能水平上可以对单个细胞或其他生物离子进行快速定量的一项新型分析技术和分选技术。它能够在短时间内高速分析上万个细胞,可以同时测量如细胞或粒子的体积、内部结构以及膜电位变化等生物或化学性质,进行多信息分析,具有快速、高灵敏、准确、多参数等特点。 单细胞悬液：是进行细胞体外培养和流式细胞分析的基础,即将组织分散成单个游离细胞,使其悬浮在液体培养基中,当然如外周血及骨髓标本等本身即为天然的单细胞悬液,这些细胞经过简单处理,就可以应用于流式分析、细胞分选、细胞培养等实验。如果2个或多个细胞粘连在一起或细胞碎片过多都将影响流式分析结果,进而导致实验失败。 背景：流式细胞术作为目前先进的细胞分析技术,其研究基础是单细胞悬液,但目前尚无有关膈肌组织单细胞悬液制备方法的相关报道。 目的：探索应用机械法与机械-酶消化法分别制备大鼠膈肌单细胞悬液的可行性并比较2种方法获得单细胞的数量和活性。 方法：以SD大鼠的新鲜膈肌组织为标本,在机械法的基础上,选用胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ及其不同组合进行消化制备膈肌单细胞悬液,观察细胞形态并经锥虫蓝染色后测定细胞活性,对活细胞、失活细胞和细胞团块进行计数并计算出细胞存活率和单细胞悬液浓度,结果进行统计学比较分析。 结果与结论：①机械-酶消化法所制得的单细胞悬液较机械研磨法细胞分散度好、形态完整、边界清楚、杂质及细胞碎片较少、背景较干净;②单纯机械研磨法制备的单细胞悬液活细胞数较低,失活细胞数较高,细胞存活率最低,团块较多;③在机械法的基础上,加入胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ3种等体积混合酶所得单细胞悬液的活细胞数及悬液浓度最高,每0.1 g膈肌组织可获得(1.0-2.0)×10⁶个细胞,细胞存活率较高,与单纯机械法获得单细胞悬液比较,在活细胞、失活细胞、细胞团块、细胞存活率及悬液浓度方面差异均有显著性意义(P < 0.05);其次是加入胰蛋白酶和胶原酶Ⅳ这2种等体积混合酶消化法,所得单细胞悬液浓度、细胞成活率及细胞团块方面也均较为理想;④结果表明,机械法和机械-酶消化法均能成功制备出大鼠膈肌单细胞悬液,机械-酶消化法优于单纯机械法,其中加入胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ3种等体积混合酶的机械-酶消化法所得单细胞悬液效果最佳,是较优选的膈肌单细胞悬液制作方法。 ORCID: 0000-0002-4486-5917(张远圆) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程     

石蜡包埋乳腺癌组织单细胞悬液的制备

石蜡包埋乳腺癌组织单细胞悬液的制备董敬朋，陈艺华，张素娟乳腺癌是妇女常见的恶性肿瘤之一，而癌基因扩增、癌细胞ＤＮＡ倍体测定是判断乳腺癌患者预后的新指标。因此，我们建立了简便易行的用于ＤＮＡ倍体测定和癌基因检测技术的单细胞悬液制备方法。１材料和方法１．...     

流式细胞术实体瘤组织标本制备的研究

近年来,流式细胞术越来越多地应用于临床和科研,文献报道较多。但是,在实体瘤组织标本制备方面研究报道较少。因此,我们重点进行了实体瘤标本单细胞悬液制备的研究。现将我们制备实体瘤组织单细胞悬液的具体方法论述如下。 资料与方法 1.标本采集:住院病人手术取下的活体实体瘤组织新鲜标本,迅速在无菌条件下放入到RPMI1640培养液中,立即     

大鼠肺组织单细胞悬液制备方法的研究

流式细胞术(flow cytometry,FCM)中细胞的分析检测均以单个细胞为基础,而各种单细胞悬液的制备是其中的关键环节,若细胞数量不足、细胞粘连成块、样品中杂质碎片过多均可造成分析失败。本实验采用胰酶消化法和研磨法制备新鲜大鼠肺实体组织单细胞悬液,通过细胞活力测定、FCM检测分析比较两种方法优劣。     

抗乳癌细胞人单克隆抗体的制备及免疫组织学鉴定

肿瘤相关抗原的存在可诱导宿主产生免疫应答,继而产生自身抗体.为揭示恶性乳腺肿瘤患者中这类免疫识别的范围及探讨肿瘤相关抗原的分子特性,著者用杂交瘤技术进行人-鼠种间杂交,成功地制备出乳癌人单抗,并用免疫组化方法进行了组织切片的细胞抗原检测.实验是取转移乳癌患者腋下淋巴结手术标本,无菌条件下制备成单细胞悬液.而后用常规PEG法与小鼠骨髓瘤细胞系M5进行融合.24小时后加入HAT培液,15～18天     

计算机在流式细胞计上的应用

流式细胞计是一种新型的单细胞定量分析仪器。它不同于传统细胞涂片的方法,而是将被分析的细胞染色,制备成悬液,通过流动室,以单细胞流高速流过激光照射的分析区。如图一所示,细胞内不同成份被激发     

不同组织处理方法对流式检测结果的影响

正流式细胞检测技术,结合了单克隆抗体技术、定量细胞化学技术和定量荧光细胞化学,可对特定细胞及颗粒进行定性及定量分析,因操作简便、重复性好、结果可靠,已在生物学、临床医学、药学等学科中得到广泛的应用~([1])。流式细胞进行检测和分析的前提,是必须以单细胞为基础,因此制备出合格的单细胞悬液对流式分析的成败至关重要。本实验利用流式检测所用不同抗体,考察单细胞悬液的三组不同处理方法对流式检测结果的影响,探讨三种方法的优缺点~([2])。     

人结直肠癌肝转移瘤中CD11b~+髓系细胞分选方法的建立与鉴定

目的:从结直肠癌肝转移瘤组织中分选出高纯度的CD11b~+髓系细胞,从而建立从一种组织中获得特异单细胞的方法。方法:采用机械联合酶消化法将实体瘤组织制备成单细胞悬液;利用流式细胞术分选出CD11b~+髓系细胞,并回测细胞纯度;采用免疫细胞化学技术对分选出细胞的特异性进行鉴定;采用吉姆萨和台盼蓝染色对获得细胞进行评价。结果:流式细胞术能从机械联合酶消化法制备的单细胞悬液中分选出高纯度、足够数量的CD11b~+细胞;分选前细胞阳性率与分选后纯度的差异有统计学意义(P0.01),分选后纯度达到实验研究的要求(P0.05);免疫细胞化学技术验证了分选细胞的特异性;分选后的细胞形态完整,活性良好。结论:机械联合酶消化法制备的单细胞悬液,经过流式细胞术分选,能够分选出高纯度、活性良好且形态完整的特异性细胞,操作方法稳定可重复,满足进一步研究的要求。     

用Medimachine系统制备实体组织的单细胞悬液

流式细胞术（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ＦＣＭ）作为一种可在单细胞水平上对大量细胞进行快速、准确、多参数定量分析和分选的高技术，在细胞生物学、免疫学、肿瘤学等方面的应用日趋广泛和深入。进行ＦＣＭ分析的前提是样品为单细胞悬液，而大多数实体组织都难以制成高质量的单细胞悬液样本，因而大大限制了ＦＣＭ对实体组织特别是实体瘤的分析和研究〔１〕。实体组织单细胞样本制备一般采用手工方法，主要有机械剪切法、酶消化法、去污剂化学处理法、针头抽吸法等〔２〕。但上述方法均存在组织用量多，制样过程繁琐耗时，细胞产率及实…     

小鼠花生凝集素受体阳性淋巴细胞的功能特性及其在移植肿瘤后的变化

肿瘤宿主免疫调节功能的异常与抑制性T 淋巴细胞的关系,已被为数众多的临床和实验肿瘤免疫学研究所证实.虽然当前业已发展了多种新技术(如单克隆抗体标记法,IgFc 受体判别法等),有可能从人或动物的淋巴器官的单细胞悬液中,鉴别和分离     

恶性肿瘤细胞多药耐药基因（MDR1）表达产物P170的流式细胞？…

目的，探讨用流式细胞免疫学检测恶性实体瘤组织及腹水细胞多药耐药基因（ＭＤＲ１）表达的方法和临床意义，方法；采用搓网方法，将１２种９４例不同的恶性肿瘤手术切除标本制成细胞膜完整的单细胞悬液，并从６例癌性腹水中提取富含癌细胞的悬液，再用流式细胞免疫学方法检测悬液中的癌细胞ＭＤＲ１表达产物Ｐ１７０含量，结果：经所用方法制备悬液中癌细胞丰富，杂质细胞少，荧光显微镜下观察细胞膜完整，Ｐ１７０阳性细胞抗体荧光     

恶性肿瘤细胞多药耐药基因(MDR1)表达产物P170的流式细胞学的检测

目的，探讨用流式细胞免疫学检测恶性实体瘤组织及腹水细胞多药耐药基因（ＭＤＲ１）表达的方法和临床意义。方法：采用搓网方法，将１２种９４例不同的恶性肿瘤手术切除标本制成细胞膜完整的单细胞悬液，并从６例癌性腹水中提取富含癌细胞的悬液，再用流式细胞免疫学方法检测悬液中癌细胞ＭＤＲ１表达产物Ｐ１７０含量。结果：经所用方法制备悬液中的癌细胞丰富，杂质细胞少，荧光显微镜下观察细胞膜完整，Ｐ１７０阳性细胞抗体荧光位于细胞膜上。结论：研究恶性实体肿瘤细胞ＭＤＲ１表达是可行的，可明确其原始的药物敏感性，对临床化疗有重要价值     

新鲜组织块标本经乙醇直接固定二年的流式细胞术DNA分析

本文报道了一种实体组织用于DesoxyribonucleicAcid(DNA)分析的Flowcy tometry(FCM) )样品保存新方法 ,即新鲜组织块乙醇直接固定法。所用样品为头颈部肿瘤手术切除的新鲜标本 3 0例 ,每例标本重约 0 5～ 1 g ,均等分为两份 ,1份置 70 %乙醇直接固定 ,室温放置 ,待两年后FCM检测。另一份置生理盐水中立即行流式细胞术DNA分析。两组样品经机械法制成单细胞悬液 ,PI染色后上机检测。结果显示 :从两组样品的DNA直方图分析 ,CV(coefficiencyofvariation)值、GO/G1、S及G2 /M各期比率无显著差异 (P >0 0 5)。我们认为在样品收集短期内难以完成 ,需积累保存 ,或需保存半年以上者 ,且不具备低温冷冻设备的条件下 ,新鲜组织块乙醇直接固定法是优于将组织块先制备成单细胞悬液再行乙醇固定的流式细胞术DNA样品保存方法     

45例骨巨细胞瘤流式细胞计分析

骨巨细胞瘤(Giant cell tumor of bone,GCT)是一种具有潜在恶性的原发性骨肿瘤。为进一步研究其生物学特性,我们采用先进的流式细胞计(Flow cy-tometry,FCM)技术,对45例GCT的52个标本进行了细胞核DNA定量分析及细胞周期分析,同时测定2例良性骨肿瘤和2例恶性骨肿瘤,以作参考。所有标本是我院手术切除后处理存档的肿瘤组织,采用Hedley方法制备单细胞悬液,以溴化乙啶(EB)一步插入DNA荧光染色法进行染色。用荧光激     

巨核细胞的液体培养法的一些改进

<正> 为了研究某些因子对巨核细胞(MK)倍体的影响,并有利于流式细胞仪检测,我们对MK液体培养法进行了摸索和改进,取得了较为满意的结果.体会如下:1.取成年SD大鼠股骨,用Catch缓冲液将骨髓冲出,吹打、洗涤,制成单细胞悬液.此步骤多数报道是采用肝素抗凝,并用低pH值的PBS或培养液冲洗细胞.但肝素本身对MK生长具有一定的作用,故可能影响研究结果,而单独采用PBS或培养液,无法取得均匀的单细胞悬液.2.上述的细胞悬液中加入以Tris和氯化铵为主要成分的溶液,以达到溶解细胞而便于MK收集的目的.3.将细胞悬液轻轻铺在Percoll液上(密度梯度依此为1.020、1.060、1.080),4℃下400g离心30min.MK在骨髓细胞中所占的比例很少,采用传统的淋巴分离液(密度为1.077)进行分离,会造成MK的丢失.据文献报道,     

一种消化神经干细胞的方法

神经干细胞(NSC)的概念一经提出，引起各国学者的广泛关注，由于神经干细胞具有自我更新和多向分化潜能，使其具有广泛的应用前景。为了更好的研究神经干细胞的特性及其增殖分化潜能，需要制备单细胞悬液，由于神经干细胞呈神经球状悬浮生长，且细胞间排列紧密，故要得到单个的神经干细胞较为困难，     

肿瘤细胞癌胚抗原的细胞粘附活性研究

本实验对肿瘤细胞系的癌胚抗原(CEA)细胞粘附活性进行了研究。CEA 阳性肿瘤细胞系 LoVo及 HeLa 的单细胞悬液在37℃,RPMI1640全培养基中可以相互粘附而各自形成大小不等的细胞凝团。这种细胞间的粘附不仅可以被抗 CEA 多克隆抗体特异性阻断,而且受到外加 CEA 抗原的竞争抑制。细胞粘附试验也获得了同样结果。实验提示,CEA 为一粘附分子。     

新生大鼠皮层神经元分离和培养方法的优化

目的:优化新生大鼠皮层神经元提取、培养的方法,以获得高纯度并且生长状态良好的神经元,为神经系统的体外研究提供实验技术.方法:取新生24 h内的SD大鼠皮层组织,通过单次消化法、分步消化法两种不同的消化方法制备单细胞悬液,并以3种不同接种密度铺板,采用Neurobasal-A培养基+2％B27+0.5 mmol/L L-...     

经抗抗体激活的脾细胞和外周血淋巴细胞在特征上的奇妙差异

由于膜表面免疫球蛋白的种类及分布密度的不同,能够被抗抗体激活的淋巴细胞之间就表现出一定的异质性。作者在纯化B细胞,比较抗抗体和抗原对B细胞的激活的过程中,发现不同组织的B细胞有行为上的异质性。首先用常规方法,制备小鼠的脾单细胞悬液;经离心分离出鼠外周血淋巴细胞(PBL),分别置于含10％胎牛血清的199