脐血间充质干细胞的培养及诱导分化的研究进展

骨髓是间充质干细胞的丰富来源,但是关于脐血及循环血中是否存在MSC,在研究初期一直存在争议。2000年,Erices等首次报导了从脐带血中分离培养出低密度类似骨髓MSCs的贴壁细胞,其表达SH1,SH2等间充质细胞标志抗原,并可分化成为成骨细胞和脂肪细胞,其免疫表形和功能特点与骨髓来源的MSC极为相似,同时发现早产儿脐血中间充质干细胞的含量要较足月儿丰富。有研究者证明,脐带血中含有间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）,并且具有多向分化潜能和很高的可塑性。     

高原红细胞增多症患者骨髓间充质干细胞的培养

目的：对高原红细胞增多症（HAPC）患者骨髓间充质干细胞（MSCs）进行分离培养,为进一步探讨其生物学特性奠定基础。方法：采用密度梯度离心和贴壁筛选法对10例HAPC和10例正常人骨髓MSCs进行分离培养,倒置显微镜下观察MSCs形态,流式细胞仪行细胞表面抗原检测,检测MSCs生长情况,判断其增殖能力。结果：骨髓密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞（BMMNC）后培养,骨髓MSC均分离培养成功,贴壁细胞呈梭形;两组骨髓MSCs均表达CD29、CD105和CD13,不表达CD45、CD4、CD8、CD14、CD3、CD34和HLA-DR（P〉0.05）。HAPC骨髓MSCs增殖能力高于正常骨髓（P〈0.01）。结论：HAPC患者骨髓MSCs体外可有效分离培养,所培养的细胞成分单一,可供进一步实验应用。     

人骨髓间充质干细胞表型转化为汗腺细胞的体外研究

目的 研究体外人骨髓间充质干细胞（MSCs）和汗腺细胞（SGCs）直接和间接共培养条件下骨髓间充质干细胞的表型转化及其机制。方法 体外分别分离培养、扩增并鉴定MSCs和汗腺细胞。将培养的MSCs和经47℃高温处理造成热休克的SGCs直接和间接共培养，1周后，采用免疫细胞化学染色法和流式细胞仪法检测共培养体系中MSCs的表型改变，Western blot测定细胞外信号调节激酶（ERK）和磷酸化细胞外信号调节激酶（pERK）表达。结果 MSCs和SGCs均呈克隆样生长，MSCs表达CD44、CD105和CD29，不表达CD34、CEA、CK19和CK7；SGCs表达CEA、CK19、CK8和CK7。MSCs与经高温损伤后的SGCs共培养1周后，部分MSCs呈汗腺细胞表型，间接共培养结果示各组MSCs均表达水平相当的ERK，但pERK水平表达不同。结论 成人MSCs和热休克的SGCs直接和间接共培养均可诱导MSCs向SGCs表型转化，pERK途径参与这一过程。     

人骨髓间充质干细胞的培养及向软骨细胞分化

为建立分离纯化、大鼠扩增人骨髓间充质MSC，改进其冰冻保存的方法，并初步探索其体内向软骨细胞分化的最佳方法，以Percoll(1.073g/ml）密度梯度离心法分离人骨髓中单个核细胞，用含经筛选的10％的胎牛血清的低糖DMEM体外培养扩增骨髓干细胞（MSC），FCM鉴定细胞纯度，传代2次以后的细胞吸附于明胶海绵内，以TGF－β为主要刺激因子体外诱导1周，植入裸鼠皮下。在不同的时间取出组织块，甲苯胺蓝染色显示细胞外基质。结果发现，体外培养扩增的人间充质MSC表达CD166、CD29、CD44等表面抗原，不表达CD34、CD45、HLA－DR等抗原；MSC可以不经消化，直接在原培养瓶内冻存在－70℃低温冰箱，3个月后复苏的细胞生物学特性没有明显改变；体外诱导的细胞植入裸鼠皮下4周后即出现软骨细胞特有的结构。说明骨髓MSC具有独特的生物学特征，体外培养的MSC具有体内成软骨能力，应用MSC构建软骨组织具有一定的可行性。     

胎儿骨髓间充质干细胞的体外培养及其生物学特性的研究

目的：确定人胎儿骨髓间充质干细胞(Fetal mesenchymal stem cells，FMSCs)体外分离和培养的方法，观察其生物学特性，建立稳定的MSCs体外培养扩增体系。方法：通过密度梯度离心、贴壁筛选法分离培养人FMSCs，观察细胞的形态与超微结构，并研究其增殖及生长特征，应用流式细胞术测定细胞周期和CD14、CD29、CD34、CD44、CD45的表达。结果：在体外培养条件下人FMSCs贴壁生长，为成纤维细胞样，CD14／CD34／CD45阴性，CD29／CD44阳性，核浆比大，细胞周期检测C0／C1期约占95％，具有原始细胞的特征。结论：体外培养可获得较均一的FMSCs，形态单一、生长稳定、增殖性较强，可以用于细胞治疗的进一步研究。     

Survivin在骨髓间充质干细胞中的表达研究

目的：培养鉴定骨髓间充质干细胞（MSCs）,检测survivin的表达。方法：应用Ficoll法分离培养MSCs,流式细胞仪检测其特异性表面标志物,RT—PCR检测survivin mRNA表达。结果：培养MSCs的超微结构显示了干细胞特性,流式细胞仪检测证实为MSCs,survivin mRNA表达阳性。结论：Survivin在正常人骨髓间充质干细胞中有表达,提示它可能参与了其生物学行为并影响间充质干细胞存活。     

人骨髓间充质干细胞体外不同分离与培养方法的比较

目的探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)理想的分离、培养方法。方法采用密度梯度离心法和全骨髓贴壁法分离培养人骨髓干细胞,并将其分别置于普通培养瓶6、0Co培养瓶中培养,应用倒置显微镜和免疫组化法观察和鉴定骨髓间充质干细胞;流式细胞术检测细胞表面标志。结果人骨髓干细胞呈均一梭形、成纤维细胞样,形成集落样生长。60Co培养瓶细胞贴壁情况明显好于普通培养瓶,且费用低;免疫组化及流式细胞术显示CD34、CD45表达为阴性,CD29、CD44表达为阳性。60Co照射处理的培养瓶结合采用全骨髓贴壁法分离培养法获得的骨髓干细胞活性高,增殖力强,克隆形成早,传代时间短。结论全骨髓贴壁法和密度梯度离心法均可获得高纯度贴壁生长的骨髓干细胞,其中60Co照射处理的培养瓶结合采用全骨髓贴壁法分离培养简单易行,骨髓干细胞增殖快,活性好,传代力持久。可以收获大量、高纯度的MSCs;本实验为MSCs进一步的研究与临床应用提供了实验方法及依据。     

人骨髓间充质干细胞分离与培养方法的建立

目的：建立并优化骨髓间充质干细胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ,ＭＳＣｓ）分离纯化及培养扩增的方法。方法：利用Ｐｅｒｃｏｌｌ（１．０７３ｇ／ｍｌ）及Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ（１．０７７ｇ／ｍｌ）两种分离介质分离骨髓单个核细胞,筛选体外培养ＭＳＣｓ适宜的血清及浓度,通过流式细胞术分析鉴定ＭＳＣｓ的纯度。结果：经Ｐｅｒｃｏｌｌ分离,应用１０％筛选出的血清培养与扩增的ＭＳＣｓ,细胞纯度可达９５％左右;相反,应用常规Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ分离骨髓单个核细胞或增加血清浓度,ＭＳＣｓ纯度显著下降。结论：建立了一种稳定而实用的体外分离与培养ＭＳＣｓ的方法。     

HMGB1促进人骨髓间充质干细胞迁移的实验研究

目的：构建人高迁移率族蛋白（HMGB1）全长编码基因的原核表达载体，诱导和纯化重组蛋白，分析其对人骨髓间充质干细胞的迁移作用。方法：RT—PCR方法从人的单个核细胞中扩增出HMGB1全长编码基因，克隆于原核表达载体pET-24a—d（＋），经IPTG诱导表达，通过亲和层析方法纯化得到携带（His）。标签的HMGB1融合蛋白；RT—PCR方法检测间充质干细胞HMGB1受体的表达；观察HMGB1对人骨髓来源间充质干细胞的迁移作用。结果：构建了融合蛋白HMGB1的原核表达载体，获得了高度纯化的HMGB1融合蛋白。RT-PCR方法检测到间充质干细胞表达HMGB1的某些受体如RAGE和TLR-4。HMGB1在体外能够诱导人骨髓来源的间充质干细胞的迁移。结论：重组HMGB1蛋白能够诱导骨髓间充质干细胞的迁移，此作用有可能通过RAGE和（或）TLR-4介导。     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养及示踪优化

目的探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)的标记和示踪方法,优化示踪技术。方法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,通过流式细胞仪鉴定细胞表面抗原(CD29、CD34、CD45、CD90),分别用BrdU、DAPI以及GFP 3种方法标记干细胞,DAPI和GFP标记率直接通过荧光显微镜进行鉴定,BrdU标记率通过细胞免疫化学法鉴定,比较3种示踪技术的优缺点。结果流式细胞仪鉴定结果显示MSCs CD29、CD90表达阳性,CD34、CD45表达阴性。3种标记方法对细胞均未显示明显毒性。终浓度10μmol/L BrdU标记48h、终浓度1μg/ml DAPI标记12h分别为其最佳标记浓度及时间。感染复数MOI=8时,GFP慢病毒感染MSCs 12h,感染率可达90%以上。结论 GFP基因转染是一种稳定、可靠、安全的标记方法,对成体干细胞的示踪有重要价值。     

脐带全层源间充质干细胞分离培养及向成软骨细胞分化的实验研究

目的从人脐带全层中分离培养间充质干细胞(MSCs),并进行成软骨诱导分化,为组织工程软骨和软骨损伤后修复提供种子细胞。方法采用胶原酶消化法从脐带全层中分离培养间充质干细胞,显微镜下观察细胞形态,细胞计数法绘制细胞生长曲线,采用流式细胞仪检测细胞周期及细胞表型,采用微团细胞培养在软骨诱导液中向软骨细胞分化,阿尔辛蓝及甲苯胺蓝染色检测细胞分化情况,RT-PCR法检测诱导后细胞表达聚集蛋白聚糖(ACAN)基因情况。结果人脐带全层来源的MSCs呈成纤维样形态漩涡状贴壁生长,细胞高表达HLA-I类分子、CD73、CD90、CD166及CD105,不表达CD34、CD45、CD14、CD31、CD80、CD86及HLA-DR。细胞诱导分化21d后,阿尔辛兰及甲苯胺蓝染色阳性;RT-PCR检测诱导后的细胞表达ACAN,而对照组无表达。结论人脐带全层为成体MSCs提供一种新而方便的来源,人脐带间充质干细胞(hucMSCs)体外培养能够向软骨细胞分化。     

人脐带间充质干细胞来源的外泌体免疫调节功能异质性研究

目的 研究不同供者来源的人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)分泌的外泌体免疫调节能力的异质性.方法 培养5株不同供者来源的hUC-MSC,收集无血清培养上清提取外泌体,流式细胞术检测其表面特异性标志CD9、CD63、CD81、CD44的表达,BCA法测定总蛋白含量.将外泌体和脐带血单个核细胞(UBMC)共培养72 h,MTT实验检测细胞增殖活性, ELISA测定共培养上清中干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量.离心重悬UBMC和K562细胞按5∶1的比例共培养4 h,MTT实验检测细胞活性,计算UBMC的杀伤能力.结果 提取的外泌体表达CD9,CD63,CD81及CD44.不同供者来源hUC-MSC分泌的外泌体对UBMC的增殖、分泌细胞因子及K562细胞杀伤能力的作用不同.结论 不同供者hUC-MSC的外泌体免疫调节能力具有异质性.     

脐带血造血干细胞的“质”“量”研究

目的 对脐带血造血干细胞移植的“质”“量”作出评估，使其更广泛有效地应用于临床。 方法 利用免疫磁珠分离法、ＦＡＣＳ分析与分选、体外液体培养，铺展贴壁等方法对脐带血ＣＤ３４＾＋造血干、粗细胞及其的数量、体外增殖分化性能、生长因子扩增效应，植入成人骨髓基质效率等进行研究，数据经ｔ检验。结果 脐带血有核细胞、ＣＦＣｓ、ＣＤ３４＾＋细胞及其亚群等的绝对数量明显低于常规骨髓移植所需的细胞数量，但脐带血ＣＤ     

骨髓间充质干细胞对异体淋巴细胞增殖的负调控作用及其机制的探讨

目的：研究成人骨髓间充质干细胞（mesenehymalstemeeHs，MSCs）的免疫调节作用及其作用机制。方法：从成人骨髓中分离、培养问充质干细胞，并通过其形态的均一性及流式细胞术检测其表面标志以鉴定其纯度。将分离培养的间充质干细胞培养上清置于96孔板中，与经分离的异体淋巴细胞共培养3d，以单独培养的异体淋巴细胞为对照组，加入植物凝血素（PHA）刺激72h，用MTT还原法测定细胞增殖，观察成人骨髓MSCs培养上清对异体淋巴细胞增殖转化的影响。结果：成人骨髓MSCs培养上清抑制异体淋巴细胞增殖转化。两者差异有显著性（P〈0．05），其增殖转化抑制率为9．00％。在有PHA刺激淋巴细胞增殖的情况下，细胞增殖活性进一步下降，两者差异显著（P〈0．01），其增殖转化抑制率达20．91％。结论：成人骨髓MSCs抑制异体淋巴细胞增殖转化，其作用机制部分为非细胞接触作用所致。推测可能是MSCs通过分泌某些可溶性细胞因子而发生作用。     

改良直接贴壁法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞及其鉴定

目的 观察并鉴定兔骨髓间充质干细胞生物特性,建立一套简单、高效的培养方法.方法 采用直接贴壁法分离培养兔骨髓间充质干细胞,倒置显微镜下观察其形态.MTT法测定其增殖水平并绘制其生长曲线.流式细胞仪测定第三代骨髓间充质干细胞表型.结果 细胞培养第5d,镜下见细胞呈小集落生长,形态呈多边形;7～8 d小集落融合成大集落,10d左右可传代.第二代细胞镜下呈梭形成纤维样细胞,即间充质干细胞;细胞生长曲线成S形;流式细胞仪检测细胞表达CD 73、CD 90、CD 105、不表达CD 34、CD 45.结论 改良直接贴壁法可获得大量、纯化、稳定的间充质干细胞.     

人脐带组织间充质干细胞研究进展及应用前景

近年来对间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）的研究越来越多,MSCs可以从骨髓、脂肪组织、肾和各种胎儿组织中提取,并能横向分化成成骨细胞、脂肪细胞和神经细胞等不同胚层的细胞。人脐带组织间充质干细胞是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞,与其他来源的MSCs相比,具有来源广泛,易于采集、保存和运输,无异体排斥,避免伦理争议等诸多优点。本文就其生物学特征、优势以及临床应用前景等予以综述。     

自体骨髓干细胞联合脐血单个核细胞移植治疗胸段慢性脊损伤27例报告

目的观察自体骨髓干细胞联合脐血单个核细胞移植治疗胸段慢性脊髓损伤的效果。方法选择接受自体骨髓干细胞联合脐血单个核细胞移植治疗的胸段慢性脊髓损伤患者27例,每位患者均接受4次干细胞悬液注射治疗,每周1次。收集患者治疗前(基线)及治疗后6周、6个月时的最低正常功能平面,ASIA残损分级,ASIA运动感觉评分,ASIA模拟视觉评分,Ashworth评分等资料并进行比较,评价治疗效果。结果治疗后6个月,6例患者左、右侧感觉最低正常功能平面出现下降(1或2个平面),5例患者两侧运动最低正常功能平面出现下降(下降1个平面2例,2个平面1例,10个平面1例,11个平面1例)。治疗后6周,ASIA残损分级由A级变为B级4例,由A级变为C级1例,由B级变为C级1例,ASIA残损分级变化率为22.2%(6/27);治疗后6个月随访时,ASIA残损分级由A级变为B级1例,ASIA分级总的变化率为25.9%(7/27)。治疗后6周、6个月时ASIA下肢运动评分分别为1.7±2.9、3.1±3.6,明显高于治疗前(0.5±1.5,P<0.05)。治疗后6周、6个月时ASIA感觉(轻触)评分分别为68.8±14.4、70.5±14.4,ASIA感觉(针刺)评分分别为68.4±14.7、70.2±14.4,均明显高于治疗前(分别为66.6±13.7、67.0±13.6,P<0.05)。治疗前改良Ashworth量表评分为1.8±1.5,与治疗后6周(1.6±1.2)比较无明显差异,但明显高于治疗后6个月(1.1±0.8,P<0.05)。结论自体骨髓干细胞联合脐血单个核细胞移植能从一定程度上改善胸段慢性脊髓损伤患者ASIA残损分级和运动感觉功能,并可部分促进慢性脊髓损伤的恢复。     

悬滴培养对人脂肪间充质干细胞成骨分化的影响

目的探讨悬滴培养对人脂肪来源间充质干细胞(hADSCs)成骨诱导分化的影响。方法利用酶消化法分离培养hADSCs,采用流式细胞术检测其表面标志的表达。对hADSCs进行悬滴培养,贴壁后添加诱导剂对其进行成骨诱导分化,以平板培养组为对照,诱导分化7d及21d时,利用RT-PCR检测成骨基因Runx2及Osteopontin的表达。结果分离培养的hADSCs表达干细胞表面标志CD44、CD90、CD105,不表达CD34、CD45;悬滴培养3d的hADSCs可形成大小均一的球状三维结构;RT-PCR结果表明,在成骨诱导分化的不同时间点,hADSCs悬滴培养组的成骨基因Runx2及Osteopontin表达均比平板培养组高,表明悬滴培养可促进hADSCs的成骨诱导分化。结论悬滴培养有利于hADSCs的成骨诱导分化,有助于提高其成骨诱导效率。     

缺氧预处理对脐带间充质干细胞bFGF分泌的影响

目的 探讨氯化钴(CoCl_2)模拟缺氧预处理对人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)碱性成纤维生长因子(bFGF)分泌的影响.方法 分离、培养人UC-MSCs,显微镜观察其形态学特征,并运用流式细胞仪检测其表面标志物的表达;选取P3代健康人UC-MSCs,MTT法检测不同浓度(0、50、100、150、200、250μmol/L)CoCl_2对UC-MSCs活力及增殖的影响,然后将细胞分为4组,分别采用0、50、100、150μmol/L CoCl_2处理,于24、48、72h后检测bFGF蛋白及mRNA的表达并分析各组间的差异.结果 经适当浓度(≤150μmol/L)CoCl_2处理后,UC-MSCs生长加快,平台期提前,而高浓度(>200μmol/L)CoCl_2对细胞活力有负面影响.经50、100、150μmol/L CoCl_2处理后,各组bFGF蛋白分泌水平均明显高于0μmol/L CoCl_2处理组(P<0.05),且48、72h时点均高于24h时点(P<0.05),150μnol/L CoCl_2处理组72h时点bFGF蛋白表达水平明显低于48h(P<0.05),100μmaol/L CoCl_2处理组72h时点bFGF蛋白表达水平明显高于48h(P<0.05),而50μmol/LCoCl_2处理组72h时点与48h时点比较无显著差异.bFGFmRNA表达改变与蛋白基本相一致,但50μmol/L CoCl_2处理组在各时点没有显著差异.结论 适当浓度(≤150μmol/L)的CoCl_2对UC-MSCs增殖能力影响较小,可用于细胞模拟缺氧;缺氧预处理对人UC-MSCs的bFGF分泌有一定促进作用.