氧化苦参碱对大鼠海马神经元细胞钠通道的影响

目的 研究氧化苦参碱(oxymatrine,OMT)对培养的新生大鼠海马神经元细胞膜钠电流作用,探讨OMT在离子通道水平的作用机制.方法 采用原代培养新生大鼠海马神经元细胞,应用全细胞膜片钳技术,观察不同浓度OMT对培养8～12天的大鼠海马神经元细胞膜钠通道的作用.结果 OMT对海马神经元细胞膜钠电流有明显的抑制作用(n=20,P＜0.05),且这种作用具有浓度依赖性,OMT对钠电流作用的半数抑制浓度为(46.1±1.3)μmol/L.在30μmol/L时,OMT可使钠电流Ⅰ～Ⅴ曲线显著上移,并且改变钠电流的翻转电位,但不影响激活电位和峰电位.通道动力学显示OMT可以促进钠电流复活曲线向右移动,减慢通道由失活状态恢复到激活状态的过程,但对激活曲线和失活曲线则没有明显的作用.结论 OMT呈浓度依赖性和电压依赖性抑制大鼠海马神经元细胞膜钠电流,并且抑制钠通道的复活过程.     

白藜芦醇对培养海马神经元的突触功能活动的调控作用

目的探讨白藜芦醇(Res)对原代培养海马神经元细胞间突触传导的影响。方法将C57BL/6品系24 h内的乳鼠海马神经元原代培养2周,海马神经元形成突触联系,应用全细胞膜片钳方法记录微小兴奋性突触后电流(mEP-SC)、微小抑制性突触后电流(mIPSC)和诱发兴奋性突触后电流(eEPSC)。结果对海马神经元分别用含0.67%酒精(对照组)或0.67%酒精和100μmol/L Res(给药组)的正常外液灌流或孵育,两组间海马神经元的mEPSC、mIPSC和eEPSC差异均无显著性。结论 100μmol/L Res对正常海马神经元的突触功能活动无调控作用。     

缺氧及谷氨酸对大鼠海马神经元NMDA通道的影响

目的 观察大鼠海马神经元模拟缺血缺氧时谷氨酸诱发电流的改变,研究缺氧和谷氨酸对大鼠海马神经元N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)通道开放动力学的影响,为中枢神经损伤的康复提供理论依据.方法 实验分为6组;①对照组通氧 20μmol/LL-Glu 1.0μmol/L Gly;②组1通氧 50μmol/LL-Glu 1.0 μmol/L Gly;③组2通氧 100 μmol/L L-Glu 1.0 μmol/L Gly;④组3通氧 200μmol/L L-Glu 1.0μmol/L Gly;⑤组4缺氧 20 μmol/L L-Glu 1.0μmol/L Gly;⑥组5缺氧 20 μmol/L L-Glu 1.0μmol/L Gly 30 μmol/L MK-801.以原代培养的大鼠海马神经元为标本,运用膜片钳技术的细胞吸附式方法记录NMDA通道的单通道电流.结果 在急性缺氧条件下,NMDA通道的开放时间常数τ1,τ2较对照组延长,分别由(0.47±0.12)ms,(5.42±0.33)ms变为(1.02±0.17)ms,(7.47±0.93)ms;关闭时间常数τ1,τ2较对照组明显缩短,分别由(21.13±4.21)ms,(167.83±23.23)ms变为(6.54±1.44)ms,(21.32±2.87)ms;平均开放概率增大,由0.17±0.11变为0.79±0.32,差异有显著意义(P＜0.05).谷氨酸浓度增加时,NMDA通道开放时间常数增大,关闭时间常数减小,开放概率增大.结论 缺氧及谷氨酸能提高海马神经元NMDA通道的兴奋性,促进NMDA通道开放增加.     

胍丁胺拮抗谷氨酸所致大鼠海马神经元兴奋性神经毒性的研究

目的探讨胍丁胺对L-谷氨酸（Glu）诱导的大鼠海马神经元损伤的影响。方法采用大鼠原代海马神经元培养的方法,用不同浓度Glu（1、10、100μmol/L）处理原代培养海马神经元1h,建立Glu诱导的原代培养大鼠海马神经元损伤模型,经乳酸脱氢酶（LDH）活性检测和显微镜下观察,确定建立大鼠海马神经元损伤模型的最佳浓度。处理组在已建立的大鼠海马神经元损伤模型中加入不同浓度（10、50、100μmol/L）胍丁胺,观察胍丁胺对Glu诱导的海马神经元损伤的作用。未经Glu处理的为正常对照组。结果上清液中的LDH活性（P〈0.01）和形态学观察均提示100μmol/L Glu为诱导原代海马神经元损伤的最佳浓度;100μmol/L胍丁胺能显著抑制模型中大鼠海马神经元LDH的释放（P〈0.01）;明显改善损伤后的神经元形态。结论胍丁胺对Glu诱导的大鼠海马神经元损伤具有保护作用。     

褪黑激素对新生大鼠海马神经元延迟整流钾电流的影响

目的 用膜片钳技术观察褪黑激素对电压门控性延迟整流钾电流(Ik)的影响,探讨褪黑激素在中枢神经系统的作用机制及其生物学意义.方法 选择7～12 d原代培养的新生Wistar大鼠海马锥体神经元,用膜片钳电压钳全细胞记录模式观察Ik的基本电生理特点,并观察不同浓度褪黑激素,包括1、10、100 nmol/L、1、10、100 μmol/L和1 mmol/L对Ik的幅度及动力学特性的影响.结果 利用海马锥体神经元的钾电流对4-AP、TEA的敏感性及电生理特性的不同可分离出激活、失活缓慢,具有强烈外向整流特性的延迟整流钾电流.褪黑激素对海马锥体神经元Ik的影响是快速、可逆、呈电压依赖性的,但对其激活曲线没有影响.褪黑激素对Ik的作用具有浓度依赖性.1～100nmoI/L的褪黑激素可逐渐递增地增加Ik幅度;1～100 μmol/L褪黑激素对Ik的增加程度随浓度增加而增大,而1 mmol/L褪黑激素的增加程度却减小.结论 褪黑激素可逆地增强体外培养新生大鼠海马神经元的Ik电流,这或许参与了神经元损伤和记忆损害的某些环节.     

铅对大鼠海马神经元胞质PKC活性的影响

目的 :观察不同低浓度醋酸铅不同染铅时间对大鼠海马神经元原代培养细胞胞质蛋白激酶C(PKC)活性及神经元细胞生长的影响。方法 :出生 4～ 8dWistar大鼠海马神经元原代细胞培养 ,显微照相 ,并不同时间不同浓度染铅 ,应用改良的Takai法测定PKC活性的变化。结果 :0 .1～ 1.0 μmol/L染铅 ,PKC活性依浓度依赖方式被激活 ,染铅浓度 >1.0 μmol/L ,PKC活性下降 ;染铅 15min后PKC活性升高并保持。低浓度醋酸铅并可抑制原代神经元细胞生长 ,呈浓度依赖方式。结论 :低浓度醋酸铅可持续激活大鼠海马神经元原代培养细胞胞质PKC ,抑制原代神经元细胞生长。     

吡拉西坦对海马神经元钙激活钾通道的作用

目的 研究吡拉西坦对原代培养海马神经元钙激活钾通道（KCa通道）的作用,以揭示吡拉西坦抗缺血性脑损伤的电生理机制。方法 应用膜片钳制技术记录原代培养的海马神经元的单通过电流活动,经p-CLAMP软件进行微机采样储存数据和数据的分析处理。结果 吡拉西坦对KCa通道具有明显的激活作用,增加通道开放概率,缩短通道关闭时间（P＜0．01）。结论 吡拉西坦可能通过激活KCa通道而对缺血神经元具有保护作用。     

尼莫地平对海马神经元保护作用的实验研究

目的:探讨尼莫地平对海藻酸(KA)处理海马神经元的保护作用。方法:在体外培养7d的海马神经元中加入不同浓度的尼莫地平(50、100、200μmol/L),30min后分别加入两种浓度的KA(50、100μmol/L),培养24h后,用MTT细胞活性测定法和免疫细胞化学染色评定尼莫地平对KA损伤海马神经元的保护作用。结果:50、100μmol/L的KA均能使海马神经元活性明显下降(P<0.05);50μmol/L的KA所致的神经元活性下降可被50、100、200μmol/L的尼莫地平阻断(P<0.05),仅200μmol/L的尼莫地平可阻断由100μmol/L的KA所致的神经元活性的下降(P<0.05)。免疫细胞化学染色所示的海马神经元形态学变化同MTT检测结果基本一致。结论:尼莫地平对KA所致的海马神经元损伤具有剂量依赖性保护作用。     

人参皂苷Rb1对阿尔茨海默病模型细胞大电导钙激活钾通道变化机制的影响

【目的】观察阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)模型细胞的大电导钙激活钾通道BKCa的变化及人参皂苷Rb1对AD模型细胞上BKCa通道的影响。【方法】实验分为Aβ25-35模型组(终浓度为5、10、20、40μmol/L)、人参皂苷Rb1预处理组(终浓度为0.5、1、2、4μmol/L)、治疗组(Aβ25-35+人参皂苷Rb1)和空白对照组。采用膜片钳技术观察各组BKCa通道的平均开放时间、平均开放概率和电流幅度,选择Aβ25-35模型组及人参皂苷Rb1预处理组的最佳浓度,并观察人参皂苷Rb1对AD细胞的作用。【结果】20μmol/L Aβ25-35可显著降低BKCa通道的平均开放时间(P0.05),抑制BKCa通道开放;4μmol/L人参皂苷Rb1组BKCa通道平均开放概率和开放时间较空白对照组均显著升高(P0.05),与模型组比较均显著升高(P0.05或P0.01)。【结论】人参皂苷Rb1治疗AD的机制可能与其能激活BKCa通道、对抗Aβ25-35的毒性作用并保护神经细胞有关。     

红藻氨酸作用后海马神经元胞膜表面的超微结构的原子力显微镜观察

目的 观察原代培养神经元在红藻氨酸(KA)作用下细胞表面形态的三维构像变化。方法 利用原子力显微镜(AFM)对大鼠海马神经元经不同浓度的KA(25和250μmol／L，50和100nmol／L)分别作用10min和100min后的表面结构进行纳米级水平扫描和观测。结果 正常海马神经元表面光滑，起伏均匀、规律；KA作用后神经元呈退行性改变，表现为胞体肿胀，胞膜表面粗糙，出现隆起和“孔洞”样结构，并且其变化程度分别与作用时问和KA浓度呈量-效关系。结论 KA对海马神经元毒性作用后胞膜表面超微结构所产生的明显变化，可借助AFM清晰观察，并定量分析。     

星形胶质细胞条件培养液对缺氧损伤神经元的影响

目的分析星形胶质细胞(Ast)与腺苷对缺氧/复氧损伤神经元的保护作用,揭示腺苷对神经系统的保护机制。方法体外培养SD大鼠大脑皮层Ast和海马神经元及大脑皮层神经元,纯化后给予神经元缺氧/复氧处理,收集复氧18 h后的Ast条件培养液(ACM)和腺苷预处理的Ast条件培养液(ACMa),然后用ACM、ACMa及ACM+腺苷(ACM+含100μmol·L-1腺苷的DMEM液)以15的浓度培养缺氧损伤神经元;光镜观察神经元形态学变化,二甲氧唑黄比色法测定细胞活性。结果 ACMa组、ACM+腺苷组及ACM组的神经元缺氧损伤后的细胞形态较模型组得到明显改善,细胞活性较模型组也得到显著提高。不同条件培养液对缺氧/复氧后神经元活性的作用:ACMa>ACM+腺苷>ACM。结论 Ast条件培养液对缺氧/复氧损伤的神经元有重要的保护、修复作用,腺苷可通过Ast间接地保护和修复受损神经元。     

姜黄素对氧化应激损伤后海马神经元血红素加氧酶-1 的表达影响

目的：探讨姜黄素对氧化应激损伤后的海马神经元血红素加氧酶-1（hemeoxygenase-1,HO-1）的表达影响。方法i将培养的原代海马神经元,分为6组：空白对照组、损伤对照组、姜黄素不同剂量治疗组（2．5μmol／L,5μmol／L,10μmol／L,20μmol／L）。利用1mmol／L的H2O2处理海马神经元1h,制作神经元氧化应激损伤模型。按照以上分组情况加入等浓度的姜黄素培养液,37℃、5％CO2孵箱孵育6h,采用倒置相差显微镜观察细胞的形态变化;免疫荧光、PCR半定量检测细胞内HO-1的表达。结果：①5μmol／L组、10μmol／L组细胞形态变化不明显;损伤对照组和2．5μnol／L组细胞损伤明显;②损伤对照组与空白对照组比较,P〈0．05;损伤对照组与2．5μmol／L组、20μmol／L组两两比较差异无统计学意义（P〉0．05）;5μmol／L组、10μmol／L组与损伤对照组比较,差异有统计学意义（P〈0．05）;PCR检测结果提示20μmol／L组比2．5μmol／L组HO-1的表达量减少。结论：姜黄素对氧化应激损伤海马神经元的保护机制可能是通过上调HO-1的表达实现的。     

Effect of etomidate on voltage-dependent potassium currents in rat isolated hippocampal pyramidal neurons

Background Previous studies demonstrated general anesthetics affect potassium ion channels, which may be one of the mechanisms of general anesthesia. Because the effect of etomidate on potassium channels in rat hippocampus which is involved in memory function has not been studied, we investigated the effects of etomidate on both delayed rectifier potassium current （IK（DR）） and transient outward potassium current （I_K（A）） in acutely dissociated rat hippocampal pyramidal neurons.Methods Single rat hippocampal pyramidal neurons from male Wistar rats of 7-10 days were acutely dissociated by enzymatic digestion and mechanical dispersion according to the methods of Kay and Wong with slight modification. Voltage-clamp recordings were performed in the whole-cell patch clamp configuration. Currents were recorded with a List EPC-10 amplifier and data were stored in a computer using Pulse 8.5. Student＇s paired two-tail t test was used for data analysis. Results At the concentration of 100 μmol/L, etomidate significantly inhibited IK（DR） by 49.2% at ＋40 mV when depolarized from -110 mV （P 〈0.01, n=8）, while did not affect IK（A） （/1=8, P 〉0.05）. The IC50value of etomidate for blocking IK（DR）was calculated as 5.4 μmol/L, with a Hill slope of 2.45. At the presence of 10 μmol/L etomidate, the V1/2 of activation curve was shifted from （17.3±1.5） mV to （10.7±9.9） mV （n=8, P 〈0.05）, the V1/2 of inactivation curve was shifted from （-18.3±2.2） mV to （-45.3±9.4） mV （n=8, P 〈0.05）. Etomidate 10 μmol/L shifted both the activation curve and inactivation curve of IK（DR））to negative potential, but mainly affected the inactivation kinetics.Conclusions Etomidate potently inhibited IK（DR） but not IK（A） in rat hippocampal pyramidal neurons. IK（DR） was inhibited by etomidate in a concentration-dependent manner, while IK（A） remained unaffected.     

5一羟色胺对人胎盘滋养细胞L-型钙通道的影响

目的探讨5一羟色胺对胎盘滋养细胞钙通道的影响。方法将体外培养的胎盘滋养细胞分为对照组和低（1．01xmol／L）、高（10．0μmol／L）浓度5一羟色胺组。采用全细胞膜片钳实验方法,在待测胎盘滋养细胞外液中分别加入Nimodpine（10μmol／L）、Flunarizne（10μmol／L）和替曲朵辛（Trxl01．Lmol／L）,进行电流检测;同样的实验条件和方法,在待测胎盘滋养细胞外液中分别加入5-TH（1μmol／L和101xmol／L）,测试电流值;在细胞外液中分别加入5-TH（μmol／L）和Nimodpine（10μmol／L）、5-TH（10μmol／L）和Nimodpine（10μmol／L）后再检测电流。结果胎盘滋养细胞L-型钙通道开放在一60--50mV之间,最大峰值电流在一40～30mV为82．31±6．46（pA）。加入Nimodpine（10μmol／L）。可阻断此电流大部分成份。Flunarizne（10Ixmol／L）和’兀X（10肛m0ⅣL）不能抑制该电流成份。加入5-TH（1μmol/L和10μmol／L）峰值电流明分别为104．77±10．84（pA）和117．16±9．67（pA）,与对照组相比有显著差异（P〈0．05）;加入5-TH（1μmo]／L）和Nimodpine（101xmol／L）、5一TH（10μmol／L）和Nimodpine（10μmol／L）后;峰值电流分别为85．35±6．54（pA）、89．42±7．62（pA）,与对照组相比无显著差异（P〉0．05）。结论5-TH可激动胎盘滋养细胞L-型钙通道,促使钙电流值增加。     

Influence of calcium influx on intracellular pH of neocortical and hippocampal neurons in primary culture

研究钙内流对原代培养的皮质和海马神经元内ｐＨ（ｐＨｉ）的影响。为了达到此目的，暴露单个神经元于谷氨酸（Ｇｌｕ，１００μｍｏｌ／Ｌ）或氯化钾（ＫＣｌ，５０ｍｍｏｌ／Ｌ）。用微荧光法测定细胞内游离钙（〔Ｃａ２＋〕ｉ）和ｐＨｉ。结果表明，Ｇｌｕ暴露或Ｋ＋－诱导的去极化可导致海马神经元明显酸化（△ｐＨ～０．４）。在无钙溶液中，这一ｐＨ降低被显著减少（Ｇｌｕ暴露）或转化成增高（Ｋ＋－诱导的去极化）。相反，皮质神经元对Ｇｌｕ的反应很弱，只有轻微的酸化。实际上，去极化诱导的ｐＨｉ在两种细胞中呈反方向变化。由上述结果得出结论：海马与皮质神经元的不同是海马神经元在钙通道激活后允许更大量的钙离子从细胞外液流入。     

小鼠小肠迷走神经初级传入神经元酸敏感电流的特征

目的 分析小鼠小肠迷走神经初级传入神经元上酸敏感电流的特征及药理学特性,初步探讨介导酸敏感电流的离子通道.方法 运用活性荧光染料（DiI）逆行标记小鼠小肠迷走神经初级传入神经元,全细胞膜片钳技术记录和分析不同pH值的细胞外液刺激诱发的酸敏感电流及与pH值的关系.在pH值5.0的细胞外液中（对照）分别添加酸敏感离子通道（ASIC）拮抗剂（30 μmol/L benzamil和100 μmol/L amiloride）和瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV1）拮抗剂（10 μmol/L capsazepine和10 μmol/L ruthenium red）,观察诱发酸敏感电流的变化.结果 在DiI标记的52个神经元中的33个神经元上可记录到三种类型的内向电流（快、慢和持续型）.酸敏感电流的电流幅度均随pH值的降低而增大.30 μmol/L benzamil和100 μmol/L amiloride使快电流的瞬时成分和慢电流的电流幅度显著减小（P＜0.05和P＜0.01）;10 μmol/L capsazepine和10 μmol/L ruthenium red能使持续型电流的电流幅度明显减小（均P＜0.05）.结论 小肠迷走神经初级传入神经元至少表达三种对酸反应的离子通道,分别是ASIC的两种不同亚型和TRPV1.     

小鼠小肠迷走神经初级传入神经元酸敏感电流的特征

目的 分析小鼠小肠迷走神经初级传入神经元上酸敏感电流的特征及药理学特性,初步探讨介导酸敏感电流的离子通道.方法 运用活性荧光染料(DiI)逆行标记小鼠小肠迷走神经初级传入神经元,全细胞膜片钳技术记录和分析不同pH值的细胞外液刺激诱发的酸敏感电流及与pH值的关系.在pH值5.0的细胞外液中(对照)分别添加酸敏感离子通道(ASIC)拮抗剂(30 μmol/L benzamil和100 μmol/L amiloride)和瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1)拮抗剂(10 μmol/L capsazepine和10 μmol/L ruthenium red),观察诱发酸敏感电流的变化.结果 在DiI标记的52个神经元中的33个神经元上可记录到三种类型的内向电流(快、慢和持续型).酸敏感电流的电流幅度均随pH值的降低而增大.30 μmol/L benzamil和100 μmol/L amiloride使快电流的瞬时成分和慢电流的电流幅度显著减小(P＜0.05和P＜0.01);10 μmol/L capsazepine和10 μmol/L ruthenium red能使持续型电流的电流幅度明显减小(均P＜0.05).结论 小肠迷走神经初级传入神经元至少表达三种对酸反应的离子通道,分别是ASIC的两种不同亚型和TRPV1.     

Rapid effect of stress concentration corticosterone on glutamate receptor and its subtype NMDA receptor activity in cultured hippocampal neurons

Objective: To study the rapid effect of glucocorticoids (GCs) on NMDA receptor activity in hippocampal neurons in stress and to elucidate its underlying probable membrane mechanisms. Methods: Whole-cell patch-clamp recording was used to assess the effect of stress concentration corticosterone (B) on the responses of cultured hippocampal neurons to glutamate and NMDA (N-methy-D-asparatic acid). To make clear the target of B, intracellular dialysis of B(10μmol/L)through patch pipette and extracellular application of bovine serum albumin-conjugated corticosterone (B-BSA, 10μmol/L)were carried out to observe their influence on peak amplitude of NMDA-evoked current. Results: B had a rapid, reversible and inhibitory effect on peak amplitude of GLU-or NMDA-evoked current in cultured hippoeampal neurons. Furthermore, B-BSA had the inhibitory effect on INMDA as that of B, but intraeeUularly dialyzed B had no significant effect on INMDA. Conclusion: These results suggest that under the condition of stress, GCs may rapidly, negatively regulate excitatory synaptic receptors-glutamate receptors (GluRs), especially NMDA receptor (NMDAR) in central nervous system, which is mediated by rapid membrane mechanisms, but not by classical, genomic mechanisms.     

腺苷对人肺腺癌细胞A549增殖和细胞周期的影响

目的：探讨腺苷对人肺腺癌细胞株A549增殖和细胞周期的影响。方法：体外培养肺腺癌细胞株A549,采用RT-PCR方法检测腺苷受体mRNA在A549细胞中的表达情况。以0、1、10、100和1 000μmol/L的腺苷分别作用A549细胞24、48和72 h后,采用MTT方法检测细胞光密度值,分析不同时间、不同浓度的腺苷对A549细胞存活率的影响。以100μmol/L的腺苷作用A549细胞24 h,采用流式细胞术检测其细胞周期。对上述所得数据进行单因素方差分析和独立样本t检验。结果：四种腺苷受体A1、A2A、A2B和A3在A549细胞中均有表达。MTT结果显示,作用时间24 h,各腺苷处理组（1、10、100和1 000μmol/L）细胞存活率分别为91%、84%、80%、73%;作用时间48 h,各腺苷处理组细胞存活率分别为82%、69%、58%、55%;作用时间72 h,各腺苷处理组细胞存活率分别为86%、56%、52%、38%,表明腺苷对A549细胞具有生长抑制效应,抑制率随着腺苷浓度升高而增强。与对照组相比,100μmol/L腺苷作用于A549细胞24 h后,能增加G1期细胞比例（对照组：59.07±0.70;100μmol/L：65.05±0.62,t=-11.04,P〈0.01）,并减少G2期细胞比例（对照组：6.67±0.95;100μmol/L：1.29±0.43,t=8.89,P〈0.01）。结论：腺苷能够抑制人肺腺癌细胞A549的生长,并改变其细胞周期分布。