应用FISH、FCM检测APL PML/RARA融合基因及临床应用的研究

目的　研究应用荧光原位杂交技术 (FISH)、流式细胞技术 (FCM)检测急性早幼粒细胞白血病 (APL)PML/RARa融合基因及残留白血病细胞的意义。方法　应用CG、M -FISH、FCM对 30例APL患者初发和缓解期的骨髓标本进行分析 ,分别检测t(15 ;17)易位和PML/RARa融合基因及残留白血病细胞的存在。结果　对初发期骨髓标本进行CG和FISH分析发现 ,10 0 %具有t(15 ;17)易位 ,阳性核型占 6 8%～ 10 0 % ,其中有 8例还伴有其他异常 ;10 0 %具有PML/RARa融合基因 ,且阳性中期相的比例高达 96 %～ 10 0 % ;结果具有显著差异 (P <0 0 0 1)。对CR期的骨髓标本进行CG、FISH分析 ,CG为正常核型 ,FISH仍可检出 0 %～ 4 5 %的PML/RARa融合基因。对CR后 12个月的标本进行CG、FISH分析 ,CG均为正常核型 ;FISH仍可检出 0 %～ 37%的PML/RARa融合基因 ,较CR期有所降低。对这 30例APL患者初发期、完全缓解期及完全缓解后 12个月时进行了FCM检测 ,并得出定性结果。完全缓解期检测结果与M -FISH分析一致 ;对完全缓解后 12个月时M -FISH结果进行定性分析发现 30例患者中有 6例为融合基因阴性 ,相应的FCM定性分析结果却发现只有其中的 2例呈现阴性 ,其余 4例仍然为阳性。随访至CR后 2年 ,发现 7例PML/RARa融合基因阳性中期相比例较高 (CG分     

EvaGreen实时定量PCR检测急性髓系白血病GRAF基因表达

目的 研究急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)中粘着斑激酶相关性鸟苷三磷酸酶调节因子(GTPase regulator associated with the focal adhesion kinase,GRAF)基因的表达及其临床意义.方法 建立EvaGreen染料法实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative PCR,RQ-PCR),对71例AML患者和21例良性血液病患者中GRAF转录本水平进行检测,分析其临床相关性.结果 所建立的EvaGreen RQ-PCR方法具有良好的特异性、重复性,敏感度达102拷贝/μL.AML患者中GRAF转录本水平(0.01%～169.75%,中位3.82%)较对照组(14.49%～126.85%,中位56.04%)显著降低(P<0.05),GRAF基因表达量与患者性别、年龄、外周血白细胞计数、血红蛋白、血小板计数、FAB亚型、染色体核型分组均无相关性(P>0.05).结论 AML患者中GRAF基因表达下调,可能与其发病有关.     

FISH在免疫表型特殊的急性早幼粒细胞白血病诊断中的应用

为探讨荧光原位杂交(fluoresence in situ hybridization,FISH)技术在免疫表型特殊的急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)诊断中的应用,作者用流式细胞仪(flow cytometry,FCM)检测APL患者骨髓中单个核细胞的免疫表型,并用FISH检测患者是否存在PML/RARα融合基因.结果发现,少数APL患者免疫表型为CD13 ,CD33 ,CD34-和HLA-DR ,而利用FISH技术检测后,发现存在PML/RARα融合基因,与典型的APL患者HLA-DR-、PML/RARα融合基因( )的结果不同,提示临床上不能只将免疫表型作为诊断白血病的独立指标,而应该结合传统的FAB分型及新兴的分子诊断技术如FISH、PCR等来协助诊断.     

FISH技术在PML/RARA融合基因检测中的应用体会

急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)是急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)的一种特殊类型(M3),其临床特点是出血倾向严重,常易并发弥散性血管内凝血及原发性纤溶亢进,早期病死率高,所以APL的早期诊断和及早治疗至关重要。现已明确t(15;17)是APL的特征性染色体异常,并在分子水平上导致PML/RARA融合基因的形成[1]。对APL患者进行PML/RARA融合基因的检测具有重要的临床价值,可为患者的诊断、疗效和预后提供有效帮助。采用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术对PML/RARA融合基因进行检测,具有成功率高、准确、省时,对检测标本限制低等优点[2]。因此,如何确保FISH的制片质量显得尤为重要。本科室经实践总结经验,对一些操作细节进行了改进,效果显著,现介绍如下。     

t(15;17)的变异型插入易位ins(17;15)(q21;q14q22)的细胞遗传学和分子遗传学研究

目的　报道 1例 t(15 ;17)的变异型插入易位 ins(17;15 ) (q2 1;q14 q2 2 )病例及其染色体涂染、逆转录 - PCR的研究结果。方法　骨髓细胞经直接法或 2 4 h培养和外周血单采白血病细胞培养 6天后制备染色体标本 ,以 R显带技术进行核型分析 ;以 15号和 17号整条染色体涂染探针进行染色体涂染 ;以逆转录 -PCR技术检测 PML - RARα和 RARα- PML融合基因的转录本。结果　该患者骨髓细胞和外周血白血病细胞染色体 R显带核型分析结果均提示 15 q-和 17q ;涂染研究证实 17号染色体长臂插入一段 15号染色体来源的染色体片段 ;逆转录 - PCR检出 PML- RARα融合基因短型转录本 ,未检出 RARα- PML 融合基因的转录本 ,符合 ins(17;15 )所致的遗传学改变。结论　染色体涂染和逆转录 - PCR技术是明确急性早幼粒细胞白血病患者涉及 15和 17号染色体插入易位的可靠手段。     

小鼠黏蛋白1(MUC1)基因的体外转录及其在NIH/3T3细胞中的表达

目的体外转录获得小鼠黏蛋白1(MUC1) mRNA并在NIH/3T3细胞中表达。方法通过反转录PCR从小鼠4T1细胞中扩增MUC1基因,然后插入真核表达载体pc DNA3. 1(+)中构建重组表达载体pc DNA3. 1(+)-MUC1。双酶切鉴定正确后,以该质粒为模板,下游引物中引入血凝素标签(HA TAG)序列,PCR扩增MUC1-HA TAG融合基因片段,然后克隆至表达载体pc DNA3. 1(+),重组载体经双酶切鉴定和DNA序列测定后作为模板,PCR扩增获得含T7启动子和MUC1-HA TAG融合基因片段的PCR产物作为体外转录模板,通过体外转录、加尾、纯化最终获得修饰的MUC1 mRNA。通过多种转染试剂将体外转录MUC1-HA TAG mRNA转入NIH/3T3细胞,Western blot法检测融合蛋白MUC1-HA TAG的表达。结果反转录PCR扩增的MUC1基因长度约为1900 bp,酶切鉴定和序列分析证实MUC1-HA TAG融合基因已成功插入pc DNA3. 1(+)质粒。插入序列与Gen Bank中小鼠的MUC1基因序列完全一致,HA TAG正确插入MUC1下游,读框正确。Western blot法分析证实体外转录修饰的MUC1-HA TAG mRNA能在NIH/3T3细胞中表达。结论体外转录修饰的小鼠MUC1-HA TAG mRNA能在哺乳动物NIH/3T3细胞中翻译表达。     

PML翻译后修饰在肿瘤细胞中的研究进展

<正>早幼粒细胞白血病(promyelocytic leukemia,PML)基因最初被发现于急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)中,在大部分APL病例中发现染色体异位t(15;17),即17号染色体上的维甲酸受体α(retinoic acid receptorα,RARα)基因与位于15号染色体上的PML基因相互异位,产生新的融合蛋白PML-RARα,这种融合蛋白在APL中发挥重要的作用[1]。PML蛋白又称TRIM19,属于     

急性髓系白血病PRAME基因转录本的定量研究

目的 探讨黑色素瘤优先表达抗原(preferentially expressed antigen of melanoma,PRAME)基因转录本在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者中的表达和临床意义.方法 建立荧光染料EvaGreen实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative PCR,RQ-PCR)对56例初诊AML患者和20例对照的骨髓单个核细胞标本中PRAME转录本进行检测,分析其临床相关性.结果 PRAME转录本含量在对照组和AML患者中分别为0～1.46%(中位0.18%)和0～21 618.09%(中位9.79%)(P＜0.01);FAB亚型中M1、M2、M3和M4患者中PRAME转录本含量较对照组明显增高,而M5患者与对照组差异无统计学意义.PRAME转录本含量与染色体预后分组显著负相关(r=-0.438,P=0.001),低危组患者中PRAME转录本含量显著高于中危组和高危组患者.AML-M2患者中t(8;21)易位阳性者PRAME转录本含量(135.06%～21 618.09%,中位2 201.88%)明显高于无t(8;21)易位者(0.14%～1696.30%,中位17.97%)(P=0.002).对1例AML患者不同阶段的标本检测发现诱导缓解后PRAME转录本明显下降,复发时又明显升高.结论 PRAME转录本在AML患者中高表达,是患者预后良好的一个标记,可用于AML患者的随访监测.     

BCR/ABL重组质粒实时荧光定量PCR标准品的制备

目的：用T-A克隆法构建含BCR/ABL融合基因的重组质粒,并用实时定量PCR（RQ-PCR）方法制备标准品。方法：通过培养细胞,提取总RNA并逆转录为cDNA后做PCR,电泳胶回收纯化,T-A克隆与pUCm-T载体连接,转染DH5a菌,蓝白斑筛选阳性菌落后,大量提取质粒,再进行RQ-PCR,最后制得BCR/ABL的重组质粒标准品。结果：蓝白斑筛选实验、PCR扩增均证实BCR/ABL融合基因重组到pUCm-T载体上,经RQ-PCR定量后得到BCR/ABL重组质粒标准品的标准曲线。结论：该方法能大量制备质粒标准品,并且可被推广应用。     

人DC-SIGN绿色荧光融合蛋白真核表达与功能鉴定

目的:构建人DC-SIGN绿色荧光融合蛋白的真核表达载体,在COS7细胞表面表达鉴定.方法:用RT-PCR从人外周血单个核细胞扩增DC-SIGN蛋白基因片段,连接到T载体.测序鉴定后切下相应片段,连接到pEGFP-C1表达载体,重组质粒(命名为:DS-pEGFP-C1)转染COS7细胞,表达DC-SIGN绿色荧光融合蛋白(命名为:DS-EGFP).荧光定量PCR检测融合基因mRNA拷贝量,激光扫描共焦显微镜鉴定DS-pEGFP-C1的表达和摄取减毒牛型分枝杆菌BCG功能.结果:用RT-PCR扩增得到正确的目的基因片段并构建成真核表达载体DS-pEGFP-C1,转染COS7细胞,荧光定量PCR检测DS-pEGFP-C1转录mRNA拷贝量是4.52×1011 copies/ml,激光扫描共焦显微镜检测证实DS-EGFP在COS7细胞表面表达,同时具有摄取BCG的功能.结论:本研究成功构建人DC-SIGN绿色荧光融合蛋白的真核表达载体DS-pEGFP-C1,表达了融合蛋白,后者能够摄取BCG.     

重组慢病毒表达PML核定位信号缺失体抑制急性早幼粒白血病细胞系c-Myc蛋白表达

目的构建携带PML(ΔNLS)基因的重组慢病毒,研究其对NB4细胞中c-Myc蛋白表达的影响。方法以质粒p CMV-HA-PML(ΔNLS)为模板,PCR扩增PML(ΔNLS)基因,克隆入慢病毒载体LV5-EF1a-GFP/puro,与p Helper 1.0和p Helper 2.0共转染293T细胞,包装病毒。收取病毒上清液,纯化后感染NB4细胞,荧光倒置显微镜观察感染效率,RT-PCR法检测PML(ΔNLS)mRNA的转录水平,Western blot检测PML(ΔNLS)、β-catenin、γ-catenin和c-Myc蛋白表达的变化。CCK-8实验观察细胞增殖。结果成功构建PML(ΔNLS)过表达慢病毒,病毒感染NB4细胞,感染效率达82.74%,LV5-PML(ΔNLS)携带的PML(ΔNLS)能够在NB4细胞中稳定表达;感染LV5-PML(ΔNLS)的NB4细胞中β-catnin、γ-catenin和c-Myc蛋白表达下降(P0.05);NB4细胞增殖活力明显高于未感染组和空病毒载体组(P0.05)。结论成功构建了重组慢病毒PML(ΔNLS),PML(ΔNLS)过表达可促进NB4细胞体外增殖,并抑制c-Myc蛋白表达。     

白血病bcr/abl融合基因的定量检测及临床意义

目的探讨慢性粒细胞性白血病(ehron ic myeloid leukem ia CML)ber/ab l融合基因检测及意义。方法采用荧光定量PCR(FQ-PCR)检测56例慢性粒细胞性白血病中ber/ab l融合基因的表达。结果对照组bcr/ab l基因表达均为阴性。56例慢性粒细胞性白血病病人bcr/ab l基因表达阳性率为87.5%(49/56),表达值范围3.0×107-7.9×107基因拷贝/L;33例CML患者Ph染色体分析结果中25例为Ph( )/bcr(十),2例为Ph(-)/bcr( ),4例Ph( )/bcr(-),1例Ph(-)/bcr(-);8例CML患者治疗前ber/ab l基因表达均值为(2.60±0.9)×107基因拷贝/L,治疗后为(1.78±0.6)×107基因拷贝/L,两者具有显著性差异(P<0.05=。结论bcr/ab l融合基因表达水平的定量检测及动态观察,对CML的临床诊断、疗效观察和预后具有重要意义。     

人类疱疹病毒6型荧光定量PCR检测方法的建立和应用

目的 建立人类疱疹病毒6型(HHV-6)荧光定量PCR检测方法,并检测临床样本.方法 根据文献合成HHV-6 U65-66基因片段的特异性引物和TaqMan探针,构建质粒制备标准品,评估该方法的特异性、灵敏度和重复性;并用该方法检测93份临床诊断为病毒性脑炎的脑脊液标本.结果 本实验检测HHV-6的灵敏度为3×10(0)拷贝/μl;标准曲线间线性关系(R2)为0.999,扩增效率为97.9％;同一样本重复检测3次,组内Ct值的变异系数最大为0.61％,组间为3.13％;特异性检测中只有HHV-6阳性标本出现扩增曲线.93份临床标本中检出HHV-6阳性2例,检出率为2.15％.结论 本实验所建立的荧光定量PCR检测HHV-6的方法特异强、灵敏高、重复性好,具有应用于临床检测的潜在价值.     

一种快速分离纯化外周血细胞线粒体DNA方法的建立

目的探索快速分离纯化人外周血细胞线粒体DNA(mtDNA)的方法. 方法收集抗凝外周血,首先破红细胞,然后裂解白细胞,去除细胞膜和核DNA后获得mtDNA;再经过去除蛋白和RNA,获得纯mtDNA.用PCR扩增人线粒体ND1基因片段,PCR产物经纯化后测序和核苷酸同源性分析.结果用本研究中建立的方法制备的mtDNA纯度高,每毫升抗凝血可获得100ng左右的mtDNA.经过PCR扩增ND1基因433bp片段,较用细胞总DNA为模板,模板用量少,扩增产物多.测序后经核苷酸同源性分析证实扩增片段为ND1基因.结论本研究中建立的快速分离外周血细胞mtDNA的方法,可制备高纯度的mtDNA用于线粒体相关研究.     

实时荧光定量PCR检测BCR-ABL融合基因的临床意义

目的探讨BCR-ABL(P210型)融合基因的检测在慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)诊断和预后判断、监测CML残留病灶等方面的重要意义。方法采集邯郸市中心医院慢性粒细胞白血病患者骨髓或外周血,用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,RQ-PCR)方法检测BCR-ABL P210型融合基因,其中男43例,女27例,年龄从18到64岁。正常对照30例。结果 BCR-ABL P210融合基因阳性的结果58例,其比率为82.9%。BCR-ABL P210融合基因阴性的结果12例,其比率为17.1%。正常对照30例均为阴性结果。在慢性粒细胞白血病患者中BCR-ABL P210融合基因阳性检出与阴性检出差异有显著性意义(P0.05)。结论对于慢性粒细胞白血病患者进行BCR-ABL P210融合基因的检测,有利于其早期诊断。实时荧光定量PCR技术检测BCR-ABL融合基因准确可靠,对于评价疗效、监测微小残留病变(minimal residual disease,MRD)以及预测疾病进展具有重要的临床应用价值。     

NanoString数字基因定量技术在生物医学领域的应用进展

NanoString数字化基因分析系统是最新的多重基因定量检测技术.此技术可直接检测条形码探针标记的单个mRNA转录子,并通过数字计数进行定量;它仅需100 ng的RNA即可对逾八百个特异的mRNA转录子进行准确的定量;它无需酶促和扩增过程,其检测的敏感性和准确性与实时荧光定量PCR（RQ-PCR）技术相当.近年来,NanoString技术的特点及优势使其被越来越广泛地应用到生物医学前沿领域,包括高通量基因表达结果验证、基因表达谱研究、基因调控网络研究、临床疾病分子分型及诊断预后等领域.     

我国主要HIV-1流行株耐药基因型检测方法的研究

目的 研究针对中国主要HIV-1流行株优化的实验室自建耐药基因型实验室自建检测方法( in-house)的扩增效果及检测敏感度.方法 选取中国主要流行亚型的B、CRF07 _BC、CRF01_AE亚型各10份样本,这些样本为2007 -2009年本实验室采集采自河南、新疆、湖南三地已接受抗病毒治疗患者的样本,并已确定亚型.选用生物梅里埃公司的Nuclisens Easy Q方法对选取的30份样本的病毒载量平行进行3次病毒载量检测,取平均值作为载量数值.对每份样本用HIV阴性血浆进行5个浓度的梯度稀释,稀释为＞ 1000、401～1000、101 ～400、50 ～100和＜50拷贝/ml 5个浓度梯度.提取核酸后,进行RT-PCR和巢式PCR扩增,对扩增结果进行统计扩增结果,确定每种亚型的扩增效果和最低检测限.随机选取12份样本的初浓度和最低浓度进行测序,对测序结果进行耐药结果分析和序列一致性分析.结果 所选样本的病毒载量介于2.03×102 ～5.92×104拷贝/ml之间.自建的In-house法对载量50 ～1000拷贝/ml范围的样本仍可达到较高的扩增效果(86％).样本稀释前后耐药位点相似,序列一致性在97％以上,在低病毒载量时优势病毒株的检测则更敏感.结论 自建的实验室方法的灵敏度较高,对低病毒载量水平的样本仍有较高的扩增效果.     

重组原核质粒GST-hTudor-SN-SN(1～4)的构建及表达

目的 将人类Tudor-SN(tudor staphylococcal nuelease)蛋白SN(1～4)基因片段分别定向连入pGEX-4T-1质粒,使Tudor-SN蛋白sN各功能片段与(;"蛋白在大肠埃希菌BL21细胞内融合表达.方法 以重组质粒pSG5-Tudor-SN-flag为模板,PCR法扩增出目的 基因,利用EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切法将目的 片段连接纠pGEX-4T-1载体卜,再将构建成功的GST-hTudor-SN-SN(1～4)重组质粒转化人大肠埃希菌BL-21内,IPTG诱导表达后再以考马斯亮蓝染色法检测GST融合蛋白的表达.结果 以单/双酶切和基因测序法鉴定构建的重组质粒均无误,考马斯亮监染色法观察到GST融合蛋白的正确表达.结论 重组原核GST.hTudor-SN-SN(1-4)质粒成功构建和表达.     

腺病毒介导的PML(NLS-)过表达对白血病NB4细胞增殖和凋亡的影响

目的 利用腺病毒介导PML(NLS-)的过表达,探讨PML(NLS-)对NB4白血病细胞增殖凋亡的影响.方法 重组腺病毒质粒Ad-PML(NLS-)经Pac Ⅰ酶切线性化后转染AD293细胞,获得重组腺病毒Ad-PML(NLS-),经4轮扩增后,测定重组腺病毒滴度;重组腺病毒感染NB4细胞,荧光显微成像和流式细胞术检测感染效率,RT-PCR法和Western blot法检测NB4细胞中PML(NLS-)的转录及表达水平,MTT实验观察细胞增殖,流式细胞术分析细胞周期及凋亡.结果 重组腺病毒质粒Ad-PML(NLS-)经酶切和测序鉴定正确,经4轮扩增病毒滴度为1 ×1010pfu/mL;重组腺病毒Ad-PML(NLS-)感染NB4细胞效率达75％,PML(NLS-)基因可在NB4细胞中高效表达;NB4细胞增殖活力明显高于未感染组和空病毒载体感染组(P＜0.05),S期细胞比例明显增高(P＜0.05),G2期细胞比例明显减少(P＜0.05);实验组细胞凋亡率明显低于空病毒感染组(P＜0.05).结论 PML(NLS-)过表达能够促进白血病NB4细胞的体外增殖能力,抑制其凋亡.