CTLA4Ig基因转染猪皮异种移植的体外实验研究

目的 探索重组腺病毒载体（Recombinant adenovirus,rAdv）介导CTLA4Ig基因转染猪皮异种移植免疫耐受的分子机制。方法 构建CTLA4Ig重组腺病毒载体,转染猪树突状细胞（Dendritic Cell,DC）,以猪表皮细胞匀浆液为刺激原,观察DC递呈猪表皮抗原刺激人T细胞增殖、活化及信号转导的影响;同时,以CTLA4Ig转染小鼠DC细胞,观察该DC膜表面分子CD40、CD80表达。结果 CTLA4Ig转染DC能显著抑制人外周血T淋巴细胞增殖能力（P＜0.01）和T细胞肌醇磷脂信号系统转导活性,IL－2分泌亦受到明显抑制（P＜0.05）;转染CTLA4Ig的小鼠DC膜表面分子CD80表达降低（P＜0.05）。结论 腺病毒介导CTLA4Ig基因转染转皮能诱导人外周血T淋巴细胞免疫耐受。     

腺病毒介导CTLA4Ig基因修饰的骨髓基质细胞诱导特异性免疫耐受的实验研究

目的　通过腺病毒介导CTLA4Ig在骨髓基质细胞 (bonemarrowstromalcells ,BMSCs)中的表达 ,探讨CTLA4Ig体外诱导特异性免疫耐受的机制 ,为该基因修饰的BMSCs联合造血干细胞移植 (hematopoieticstemcelltransplantation ,HSCT) ,达到预防移植物抗宿主病 (graft versus hostdisease ,GVHD)和纠正预处理损伤的造血微环境 (hematopoieticinductivemicroenvironment,HIM)积累实验依据。方法　以CTLA4Ig 重组腺病毒按感染复数 (mutiplicityofinfection ,MOI) 5 0转染BMSCs,利用亲和层析的方法纯化培养上清中的目的蛋白CTLA4Ig ,加入到混合淋巴细胞反应 (mixedlymphocytereaction ,MLR)体系中 ,通过MTT显色观察其抑制淋巴细胞增殖的生物学效应 ,以ELISA检测体系中IL 2的水平。结果　纯化的CTLA4Ig对MLR反应体系中淋巴细胞的增殖有明显的抑制作用 ,且在一定范围内与CTLA4Ig的浓度呈依赖性关系 ;体系中IL 2水平与淋巴细胞数有相似的变化趋势 ,且成正相关 (γ =0 85 2 2 ) ;CTLA4Ig组的淋巴细胞数与IL 2水平与对照组相差显著 (P <0 0 5 )。结论　转染后BMSCs表达的目的蛋白CTLA4Ig能有效阻断B7/CD2 8共刺激信号途径 ,从而抑制T细胞活化 ,抑制IL 2的产生     

CTLA4Ig基因修饰的BMSCs在GVHD发生中的意义

目的　通过腺病毒介导CTLA4Ig在骨髓基质细胞 (bonemarrowstromalcells ,BMSCs)中表达 ,探讨CTLA4Ig体外诱导T细胞特异性免疫耐受的可行性及其机制 ,并观察该基因修饰的BMSCs促进造血的功能。方法　以CTLA4Ig 重组腺病毒按感染复数 (mutiplicityofinfection ,MOI) 5 0转染BMSCs,利用亲和层析的方法纯化培养上清中的目的蛋白CTLA4Ig,加入到混合淋巴细胞反应 (mixedlymphocytereaction ,MLR)体系中 ,通过MTT显色观察其抑制淋巴细胞增殖的生物学效应 ,以ELISA检测体系中IL 2的水平 ;通过BMSCs支持CD34+ 细胞扩增 ,观察基因修饰对其支持造血的影响。结果　纯化的CTLA4Ig对MLR反应体系中淋巴细胞的增殖有明显的抑制作用 ,且在一定范围内与CTLA4Ig的浓度呈依赖性关系 ;体系中IL 2水平与淋巴细胞数有相似的变化趋势 ,且成正相关 (r =0 .85 2 2 ) ;CTLA4Ig组的淋巴细胞数与IL 2水平与对照组相差显著 (P <0 .0 5 ) ,但支持CD34+细胞扩增的能力无显著差异 (P >0 .0 5 )。结论　CTLA4Ig的表达能有效阻断B7 CD2 8/CTLA4共刺激信号途径 ,从而抑制T细胞活化 ,抑制IL 2的产生 ;而该基因的表达未明显影响BMSCs支持造血的功能     

重组hCTLA4Ig对小鼠脾淋巴细胞活化的抑制作用

目的 探讨基因重组hCTLA4Ig对小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响。方法 于不同时相点在Con A刺激的小鼠脾淋巴细胞及BALB/c与昆明种小鼠混合淋巴细胞培养中加入不同剂量hCTLA4Ig，应用^3H-TdR掺入法测定淋巴细胞增殖情况。结果 重组hCTLA4Ig能显著抑制ConA刺激的脾淋巴细胞及混合淋巴细胞反应中的细胞增殖。结论 重组hCTLA4Ig能抑制鼠淋巴细胞的活化。     

双歧杆菌对单核细胞来源的树突状细胞成熟及功能影响的体外研究

目的 研究双歧杆菌对正常成年人外周血单核细胞来源的树突状细胞(dendritic cell, DC)刺激淋巴细胞增殖功能及分泌细胞因子的影响.方法 以GM-CSF、IL-4联合诱导单核细胞生成未成熟DC,加入不同剂量热灭活的双歧杆菌,观察DC形态,检测混合淋巴细胞反应,ELISA法测IL-12、IFN-γ分泌.结果 经双歧杆菌死菌刺激后,可获得具有典型树突状突起形态的DC;诱导后的DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力增强(P＜0.01),分泌IL-12、IFN-γ的水平提高(P＜0.05),呈剂量依赖型.结论 双歧杆菌能影响单核细胞来源的DC的分化、成熟及功能的发挥,且不同剂量的双歧杆菌对DC的成熟程度影响有差异.     

人骨髓间充质干细胞对异体外周血T淋巴细胞的抑制作用及机制

目的:探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)体外对异体外周血T淋巴细胞的抑制作用及机制.方法:从骨髓中分离培养MSCs,反复贴壁进行纯化;用尼龙棉柱法纯化异体外周血T淋巴细胞;观察MSCs对植物血凝素(PHA)刺激下T淋巴细胞增殖的影响,用ELISA方法检测IFN-γ,IL-4水平变化.结果:MSCs对PHA诱导的T淋巴细胞增殖有抑制作用,并呈剂量依赖性;同时MSCs亦可抑制T淋巴细胞的IFN-γ分泌,但可促进IL-4的分泌.结论:MSCs对异体外周血T淋巴细胞的增殖有抑制作用,其作用可能与其影响T淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-4有关.     

转hCTLA4Ig树突状细胞诱导T细胞免疫耐受的实验研究

目的　通过逆转录病毒载体将人CTLA4Ig转染DCs ,探讨转人CTLA4Ig(hCTLA4Ig)树突状细胞 (DCsRev)诱导T细胞免疫耐受的可能性。方法　通过重组逆转录病毒将目的基因hCTLA4Ig转染到大鼠骨髓来源的DCs中 ,通过流式细胞检测目的基因hCTLA4Ig表达及DCs表面分子的改变 ;通过混合淋巴细胞反应 (MLR)检测DCsRev抑制T细胞免疫反应的能力。 结果　重组逆转录病毒转染DCs的最大效率为 91 2 5 % ;在功能上 ,DCsRev不但丧失了刺激MLR的能力 ,并且能够强烈抑制MLR中反应T细胞的增殖 ,而且抑制率与加入DCsRev的数量和DCsRev预处理反应T细胞的时间长短有关。具体来说 ,DCsRev数量在 10 3 ～ 10 4之间时 ,抑制率与剂量呈正相关 ,最高为 71 96%。而当DCsRev数量达到 5× 10 4抑制率下降为 5 9 2 %。在 12～ 48h之间 ,随着预处理时间的延长 ,抑制率却不断下降 ,预处理 12h抑制率最高 ,为 99 6%。但不做预处理 ,在反应开始时同时加入DCsRev ,则抑制率明显降低 ,仅为 5 9 2 %。对腹腔注射DCsRev大鼠脾T淋巴细胞体外分析表明 ,DCsRev也能在动物体内诱导耐受 ,但这种免疫耐受状态不能维持终身。结论　通过逆转录病毒载体将人CTLA4Ig转染DCs,不但DCs表面CD86分子被CTLA4Ig有效的封闭 ,并且能够诱导抗原特异性T细胞的免疫耐受     

CTLA4Ig抑制BMP2基因转染的MSCs诱导的免疫应答

目的通过腺病毒介导人细胞毒T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(CTLA4Ig)及人骨形态发生蛋白2(BMP2)在骨髓间充质干细胞(MSCs)中的表达,探讨CTLA4Ig对BMP2转染的异基因MSCs诱导的免疫应答的抑制作用。方法以CTLA4Ig和BMP2重组腺病毒转染MSCs。ELISA法检测包装的病毒感染MSCs后,CTLA4Ig及BMP2蛋白的表达;观察CTLA4Ig对混合淋巴细胞反应(MLR)的抑制作用。结果腺病毒载体介导CTLA4Ig和BMP2体外感染的MSCs能够分泌CTLA4Ig及BMP2蛋白,且CTLA4Ig融合蛋白可以有效抑制AdBMP2基因转染的MSCs的刺激作用。结论给予CTLA4Ig腺病毒进行基因治疗可有效的抑制AdBMP2转染的异基因MSCs引起的免疫应答,诱导MSCs移植耐受;为BMP2基因修饰的同种异体间的MSCs移植提供了实验依据。     

CTLA4Ig抑制BMP2基因转染的MSCs诱导的免疫应答

目的 通过腺病毒介导人细胞毒T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(CTLA4Ig)及人骨形态发生蛋白2(BMP2)在骨髓间充质干细胞(MSCs)中的表达,探讨CTLA4Ig对BMP2转染的异基因MSCs诱导的免疫应答的抑制作用.方法 以CTLA4Ig和BMP2重组腺病毒转染MSCs.ELISA法检测包装的病毒感染MSCs后,CTLA4Ig及BMP2蛋白的表达;观察CTLA4Ig对混合淋巴细胞反应(MLR)的抑制作用.结果 腺病毒载体介导CTLA4Ig和BMP2体外感染的MSCs能够分泌CTLA4Ig及BMP2蛋白,且CTLA4Ig融合蛋白可以有效抑制AdBMP2基因转染的MSCs的刺激作用.结论 给予CTLA4Ig腺病毒进行基因治疗可有效的抑制AdBMP2转染的异基因MSCs引起的免疫应答,诱导MSCs移植耐受;为BMP2基因修饰的同种异体间的MSCs移植提供了实验依据.     

CD28、CD40通路共刺激对淋巴细胞增殖反应的影响及CsA的抑制作用

目的：探讨CD28、CD40通路共刺激后淋巴细胞增殖反应的变化及免疫抑制剂环孢素A(CsA)、抗CTLA4单克隆抗体对共刺激通路激活后淋巴细胞增殖反应的影响。方法：采用单克隆抗体与淋巴细胞表面CD3、CD28及CD40L分子结合产生相应刺激信号,根据刺激条件不同设组为：①抗CD3单抗单刺激(A组)(剂量为10μg／L、100μg／L、1000μg,／L);②抗CD3单抗 抗CD28单抗(B组);③抗CD3单抗 抗CD40L单抗(C组);④抗CD3单抗 抗CTLA4单抗(D组)共刺激(A、B、C、D组中抗CD3单抗剂量固定为100μg／L,其余3种单抗各设10μg／L、100μg／L、1000μg／L3种剂量);⑤抗CD3单抗 抗CD28单抗 抗CD40L单抗(E组);⑥抗CD3单抗 抗CD28单抗 抗CTLA4单抗(F组)共刺激(E、F组中抗CD3单抗和抗CD28单抗的剂量固定为100μg／L,抗CD40L单抗和抗CTLA4单抗的剂量各设10μg／L、100μg／L、1000μg／L);⑦CsA干预组：抗CD3单抗 CsA(G组);⑧抗CD3单抗 抗CD28单抗 CsA(H组);⑨抗CD3单抗 抗CD28单抗 抗CD40L单抗 CsA(I组),G、H、I组中所有单抗浓度均固定为100μg／L,CsA浓度设为10μg／L、100μg／L、1000μg／L。采用[^3H]-TdR同位素掺人法测定淋巴细胞增殖水平,液体闪烁计数仪测定放射性计数值。结果：用抗CD3单抗 抗CD28单抗共刺激后,淋巴细胞增殖反应明显高于抗CD3单刺激,而在抗CD3单抗 抗CD40L单抗刺激组,淋巴细胞增殖反应低于抗CD3单刺激组。抗CTLA4单抗所提供的刺激信号可抑制抗CD3单刺激及抗CD3 抗CD28共刺激导致的淋巴细胞增殖反应,并且随着抗CTLA4单抗剂量的增加,抑制作用增强。CsA对共刺激后的淋巴细胞增殖反应有抑制作用,且随着剂量增大其抑制作用也增强,但对单刺激后增殖反应的抑制作用更为明显。结论：CD28共刺激通路在淋巴细胞活化中起着关键作用。抗CD40L单抗的刺激作用可能被其对T细胞与抗原递呈细胞(APC,包括B细胞等)间的阻断效应所掩盖。抗CTLA4单抗及CsA对共刺激后淋巴细胞的增殖反应均有抑制作用。     

CTLA4 Ig在诱导小鼠心脏移植免疫耐受中的作用

目的　通过建立小鼠心脏移植模型 ,探讨CTLA4Ig在免疫抑制和诱导免疫耐受中的作用。方法　建立小鼠心脏移植模型 ,供体分别为DBA/2和 6 15新生鼠心脏 ,受体为BALB/c小鼠 ,移植后分别予以CTLA4Ig 0 .1、1、5mg·kg-1·d-1,治疗 1周 ,观察不同剂量CTLA4Ig对新生鼠移植心脏存活时间的影响 ;BALB/c小鼠首次移植 2周后再次移植DBA/2或 6 15新生鼠心脏 ,观察CTLA4Ig对再次移植心脏存活的影响。结果　与对照组相比 ,CTLA4Ig 0 .1mg·kg-1·d组 ,移植心脏的存活时间不能延长 ,CTLA4Ig 1mg·kg-1·d和 5mg·kg-1·d-1组能显著延长心脏的存活时间 ,但两组间差异不显著 (P >0 .0 5 )。再次移植 6 15心脏各组 ,移植心脏的存活时间均无显著延长 ,而再次移植DBA/2新生鼠心脏 ,CTLA4Ig 1mg·kg-1·d-1和 5mg·kg-1·d-1组 ,其移植心脏的存活时间仍然能显著延长 (P <0 .0 1)。结论　CTLA4Ig能延长新生鼠心脏移植存活时间 ,且能诱导抗原特异性免疫耐受     

应用重组腺病毒载体制备人CTLA4Ig融合蛋白

目的在实验室水平制备并鉴定人CTLA4Ig融合蛋白.方法将人CTLA4Ig cDNA片段构入重组腺病毒载体中,用该表达载体感染293细胞并在其中表达人CTLA4Ig,再应用SPA亲合层析柱自细胞培养上清中纯化出该融合蛋白,以WESTERN印迹验证后,观察了所制备CTLA4Ig对混合淋巴细胞反应的影响.结果经亲合层析柱洗下的蛋白为分子量为53.0kd的单一组分,经WESTERN印迹证实为CTLA4Ig,并发现所制备CTLA4Ig能呈剂量依赖性抑制混合淋巴细胞反应.结论本法成功制备了具有生物学活性的重组人CTLA4Ig融合蛋白.     

间接抗原递呈途径在同种异体表皮细胞移植排斥反应中的作用研究

目的　探讨间接同种异型识别在体外培养的同种异体表皮细胞移植排斥反应中的作用。方法　体外分离培养人表皮细胞 (Epidermalcells ,EC)、异体人外周血淋巴细胞 (Peripheralbloolymphocytes ,PBL)和单个核细胞 (Peripheralbloodmononuclearcells ,PBM ,含单核细胞 )。将毒性T淋巴细胞相关抗原 4(CTLA4Ig)腺病毒载体转染EC。转染与未转染的EC中均加入异体PBL或PBM共同培养 ,应用氚标记胸腺嘧啶脱氧核苷 ( 3H TdR)掺入法 ,测定各培养系中PBL、PBM增殖情况。结果　CTLA4Ig腺病毒载体能成功转染EC并表达相应蛋白。未转染的EC刺激异体PBL轻度增殖 (P <0 .0 5 ) ,以及刺激含单核细胞的PBM明显增殖 (P <0 .0 1) ;经CTLA4Ig腺病毒载体转染的EC刺激PBL、PBM增殖则明显减弱 (P <0 0 5 )。结论　间接同种异型识别在EC排斥中发挥了重要作用 ,CTLA4Ig能明显减轻该作用。     

腺病毒介导的CTLA4Ig和OX40Ig基因转移诱导大鼠心脏移植物长期存活的作用

目的探讨腺病毒介导CTLA4Ig和OX40Ig基因转移延长异基因大鼠心脏移植物存活时间的作用及其相关机制。方法将Lewis大鼠随机分为5组对照组、空载病毒AdEGFP处理组、AdCTLA4Ig处理组、AdOX40Ig处理组和AdCTLA4Ig-IRES-OX40Ig处理组。在心脏移植的同时,对照组不予其他处理,其他各组分别经尾静脉注射(1~5)×109pfu/ml AdEGFP、AdCTLA4Ig、AdOX40Ig、AdCTLA4Ig-IRES-OX40Ig进行耐受诱导,每天观察心脏移植物的存活情况,完全停跳的心脏经组织学证实后定为排斥。ELISA法测定目的基因的表达水平。混合淋巴细胞反应、过继转移实验、IL-2逆转实验和RT-PCR检测研究其诱导耐受的机制。结果心脏移植物的平均存活时间AdCTLA4Ig-IRES-OX40Ig处理组(151.5d±42.8d),AdCTLA4Ig处理组(43.2d±11.1d),AdOX40Ig处理组(60.2d±11.4d)与对照组(5.7d±0.5d)和空载病毒AdEGFP处理组(5.2d±0.4d)比较明显延长(P均<0.01),并且AdCTLA4Ig-IRES-OX40Ig处理组在延长移植物存活时间上明显优于AdCTLA4Ig和AdOX40Ig处理组(P均<0.01)。耐受Lewis大鼠脾细胞对供体DA大鼠脾细胞表现为低应答,并且该低应答状态能够被外源性白细胞介素-2(IL-2)部分逆转。过继转移结果说明该低应答状态能够转移给同系正常Lewis大鼠。在耐受大鼠体内发生了Th1/Th2型细胞因子偏移。结论AdCTLA4Ig-IRES-OX40Ig介导的基因转移能够在大鼠体内长期高效表达,并诱导异基因心脏移植物长期存活,其机制可能与T细胞无能、Th1/Th2型细胞因子偏移及其调节性T细胞等有关。     

CTLA4—Ig对过敏性哮喘作用的研究

目的：通过CTLA4－Ig阻断B7／CD28的结合防止CD＋4T激活,探讨其治疗哮喘的可行性。方法：分别用6只BALB／C小鼠作为正常,哮喘,治疗组,于气道激发后24h进行外周血,支气管肺泡灌洗液89BALF）细胞计数及分类,细胞因子测定和病理切片。结果 ：哮喘组BALF细胞数增加,炎性细胞比例上升,全身及局部IL－4水平增高,病理示气道民性炎症性改变,治疗组可减轻上述改变,两组比较差别有显著性。结论：CTLA4－Ig可引起抗原特异性免疫耐受,抑制哮喘反应。     

干预协同刺激信号对反复自然流产患者Th1/Th2转换影响的体外研究

目的 探讨干预协同刺激信号对反复自然流产患者Th1／Th2转换的影响。方法 用人绒毛膜癌细胞株JEG-3制备滋养细胞抗原;用该抗原刺激反复自然流产患者外周血单个核细胞,并分为两组：实验组加入细胞毒性T细胞相关抗导4（CTLA4Ig,10μg／mL组和1μg／mL组）,对照组加IgG（10μg／mL组和1μg／mL组）,培养72h,分别取24h和72h上清液,采用酶联免疫吸附法（ELISA）测上清液中白介素2（IL-2）、干扰素γ（IFN-γ）和白介索4（IL-4）的水平。结果 与同质量浓度的对照组相比,CTLA4Ig组产生的IL-4水平明显高于对照组（P〈0．05）,而产生的IL-2水平明显低于对照组（P〈0．05）,IFN-γ水平两组间差异无统计学意义（P〉0．05）。与CTLA4Ig1μg／mL组相比,CTLA4Ig10μg／mL组产生的IL-4水平明显升高（P〈0．05）,IL-2水平明显降低（P〈0．05）,IFN-γ水平两组间差异无统计学意义（P〉0．05）。结论 CTLA4Ig能通过阻断CD80／CD86共刺激信号,使反复自然流产患者Th1／Th2细胞因子向Th2型细胞因子偏移。