人IκBα真核表达载体的构建及其在大鼠肝移植缺血-再灌注损伤中的作用

目的:构建人IκBα真核表达质粒,探讨对大鼠肝移植缺血-再灌注损伤的保护作用。方法:应用RT-PCR和重叠延伸PCR技术,得到点突变的人IκBα,定向克隆至PcDNA3.0真核表达载体。将SD大鼠原位肝移植模型分为三组:Ⅰ组为空白对照组,Ⅱ组为PcDNA3.0空载体转染组,Ⅲ组为PcDNA3.0-IκBα转染组。分别于术后2、12、24和72 h取材。用RT-PCR测定肝组织中核转录因子(NF-κB)p65、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、细胞间黏附分子1(ICAM-1)mRNA的表达及肝功能变化。结果:经酶切和DNA序列测定鉴定,证实重组质粒构建正确;Ⅲ组与Ⅰ组、Ⅱ组相比:NF-κBp65、TNFα、ICAM-1 mRNA的表达水平及肝酶学指标均明显降低(P<0.05)。结论:真核表达质粒PcDNA3.0-IκBα构建成功,IκBα通过抑制NF-κBp65 mRNA的表达及其核移位减轻大鼠肝移植缺血-再灌注损伤。     

人IκBαM真核表达载体的构建及其对大鼠肝移植缺血再灌注中ICAM-1的影响

目的构建人IκBαM真核表达质粒,探讨人IκBαM对大鼠肝移植缺血再灌注中ICAM-1的影响。方法应用RT-PCR和重叠延伸PCR技术,得到点突变的人IκBαM,定向克隆至PcDNA3.0真核表达载体。将SD大鼠原位肝移植模型分4组：组Ⅰ为假手术组（行游离肝脏手术）,组Ⅱ为空白对照组（行大鼠原位肝移植手术）,组Ⅲ为PcDNA3.0空载体转染组（移植前两天行人PcDNA3.0转染供肝）,组Ⅳ为PcDNA3.0-IκBαM转染组（移植前两天行人PcDNA3.0-IκBαM转染供肝）。分别于术后2h、12h、24h和3d取材。应用免疫组化、RT-PCR测定肝组织中ICAM-1的表达,同时检测各时点肝脏酶学的变化。结果经酶切和DNA序列测定鉴定,证实重组质粒构建正确;PcDNA3.0-IκBαM转染组与组Ⅱ、组Ⅲ相比：免疫组化示ICAM-1于移植后12h、24h的表达差异具有显著性;术后12hICAM-1mRNA的表达水平具有显著性差异;肝脏受损指标（ALT）在各时点差异具有显著性,尤其在术后12h最为显著（P〈0.05）。各移植组与Ⅰ组差异有显著性,（P〈0.05）。结论真核表达质粒PcDNA3.0-IκBαM构建成功,IκBαM通过抑制ICAM-1的表达减轻大鼠肝移植缺血再灌注损伤。     

细胞粘附分子1在大鼠原位肝移植冷缺血再灌注损伤中的表达

近年研究证明,某些粘附分子是内皮细胞和白细胞粘附的原因,其中,l型细胞粘附分子（ICA－1）及其配体白细胞功能相关抗原一l（LFAI）尤其重要,据报道,抗ICAM－l单抗可抑制体内沙帕细胞的粘附。'"。为此,我们应用大鼠同基因原位肝移植冷缺血再灌注损伤动物模型,探讨ICAM－l在大鼠原位肝移植冷缺血再灌注损伤中的发病机制及其表达意义。一、材料和方法1．材料：雄性健康Wistar大鼠,供体重180－230已受体重ho－300g,购于中国科学院上海动物中心。小鼠抗大鼠ICAM司单抗IA29IgG及IA29F（ah'）,购于日本东京SeihagakllKOgyo…     

缺血预处理对减体积肝移植大鼠缺血再灌注损伤的保护作用

目的探讨缺血预处理（IPC）对减体积肝移植大鼠缺血再灌注损伤的保护作用及其机制。方法将36只成年雄性SD大鼠行50%减体积肝移植,随机分为对照组（Control）组和IPC组,检测术后2、6、24 h血清丙氨酸转氨酶（ALT）水平变化。检测术后24 h肝组织形态学变化、丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）含量;检测髓性过氧化物酶（MPO）活性以反映中性粒细胞浸润情况;ELISA法检测肝组织中肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平。结果与Control组比较,IPC组术后6、24 h ALT水平显著下降（P〈0.01）;组织病理学显示,Control组肝细胞明显空泡样变性伴局部坏死,小叶结构破坏,门脉周围水肿、充血,炎症细胞浸润明显,而IPC组损伤减轻;与Control组比较,IPC组MDA水平显著下降而SOD含量则明显增加（P〈0.01）,肝组织中TNF-α和MPO亦显著降低（P〈0.01）。结论IPC明显减轻减体积肝移植术后再灌注损伤,其机制部分与增强抗氧化、抑制脂质过氧化、减轻炎症反应密切相关。     

肝移植后缺血再灌注损伤的研究进展

许多肝外科手术过程中 ,尤其是当处理广泛肝损伤或切除大范围的肝内损伤时 ,需要一段时间缺血期 (血流阻断期 )。在重建血供时 ,肝脏易受到进一步的损伤使已经缺血的损伤加剧 ,这就被称为缺血再灌注损伤 ( I-R)。在肝移植领域中 ,它包括了一个功能低下的移植物的常见临床结果所伴随的多种情况 [1 ]。1　病理生理再灌注开始后肝脏的损伤是由于不同复杂机制之间相互作用的结果 ,在再灌注早期阶段 ,内皮细胞肿胀、血管收缩、白细胞停滞 [2 ] 、血小板在血窦内聚集导致微循环衰竭。内皮细胞和枯夫细胞肿胀是细胞内水肿的结果。由于缺血导致能量…     

银杏叶提取物在大鼠肝移植缺血再灌注损伤中的预处理效用

目的:探讨银杏叶提取物对大鼠移植肝缺血再灌注损伤模型的预处理效用.方法:采用Kamada's袖套法建立大鼠缺血再灌注原位肝移植模型.将大鼠随机分成假手术组(SO组)、生理盐水对照组(NS组)、银杏叶提取物预处理组(EGb组).各组分别观察移植肝再灌注后2 h、6 h和24 h肝组织中TNF-α、IL-1含量及血清ALT和AST含量和肝组织学变化.结果:SO组与NS组血清ALT和AST含量,肝组织TNF-α和IL-1活性明显升高(P＜0.01),肝细胞形态学发生异常变化.EGb预处理组,上述指标的异常变化均明显减轻,与NS组比较差异有显著性意义(P＜0.01).结论:银杏叶提取物可通过抑制Kuffer氏细胞激活减少释放TNF-α和IL-1始动因子并调控缺血再灌注因子水平达到保护供肝作用.     

肝移植缺血再灌注损伤

肝移植缺血再灌注损伤预防医学系汤兵综述康格非，吴逸人审校中国分类号Ｑ５９３．１自１９５５年ｗｅｌｃｈ首次报道实验性肝移植以来。全球移植中心名录处１９９６年公布，至１９９５年年底已有４８９６７例肝移植，它已成为仅次于肾移植的第二位的大器官移植。供肝保存...     

肝移植热缺血再灌注损伤的防治

自1955年Welch首次报道实验性肝移植以来,全球移植中心名录处1996年公布,至1995年底已有48967例肝移值,它成为仅次于肾移植的第二位大器官移植。然而获得一个无损伤且功能良好的供肝是肝移植成功的关键。由于我国尚无脑死亡法,临床所能利用的大多是无心跳的尸体供肝。尸体供肝因其热缺血和再灌注性肝损伤最后易导致移植肝无功能,使移植失败。所以供肝的来源与质量是造成     

肝移植缺血再灌注损伤介质及其作用

原位肝移植(OLT)在过去十几年里取得了可喜的进步,正在以每年约4000例的速度增加,现已广泛用于终末期肝病的治疗。由于手术技巧、麻醉管理的改进,免疫抑制剂和UW溶液的应用,已使移植成功率和病人长期存活率显著增加。但据报道,肝脏早期无功能率仍达到1％左右,术后1～2年内的     

hBcl-2基因转染对大鼠肝移植缺血再灌注损伤的保护作用

目的 研究hBcl-2基因转染对大鼠肝脏抗缺血再灌注损伤的效应,并探讨其减轻移植肝缺血再灌注损伤的可行性.方法 (1)同源重组法构建复制缺陷型重组腺病毒Adv-EGFP,Adv-Bcl-2,转染293细胞并包装成腺病毒颗粒后大量扩增和纯化.同法构建空载体病毒质粒;(2)雄性SD大鼠,随机分为Adv-Bcl-2转染组、Adv-EGFP转染组、缺血再灌注组、假手术对照组,以两袖套法建立同种异体肝移植模型.转染组经门静脉灌注转染重组腺病毒Adv-Bcl2-或Adv-EGFP;缺血再灌注组、假手术对照组不予任何处理.实时定量PCR和Western blotting检测各组肝组织bcl-2mRNA和蛋白表达变化;门静脉血流恢复后第0,60及180 min三个时间点测定受体血清AST,LDH,MDA含量.组织切片检测肝细胞形态改变.结果 Adv-Bcl-2转染组bcl-2 mRNA和蛋白表达水平较Adv-EGFP转染组和对照组明显增高(P<0.01) ;Adv-Bcl-2转染组中血清AST,LDH含量明显低于Adv-EGFP转染组和缺血再灌注组.Adv-Bcl-2组血清MDA水平明显低于缺血再灌注组和Adv-EGFP组(P<0.01).与假手术组比较,Adv-Bcl-2处理组HE染色见少量肝细胞水肿和空泡变性,未见片状或点状坏死等.缺血再灌注组和Adv-EGFP组HE染色镜下观察可见小叶结构破坏、肝细胞弥漫不同程度水样变性、体积明显增大、细胞间边界模糊,还可见大量细胞出现脂肪变性及少量碎片状坏死.结论 Adv-Bcl-2转染能通过诱导bcl-2基因表达减轻移植肝缺血再灌注损伤.     

细胞凋亡与肝移植缺血-再灌注损伤的研究进展

20世界 60年代 ,人们发现了细胞自发死亡与消失的现象。 1 972年 ,Kerr等[1 ] 首先提出了细胞凋亡(Apoptosis)的概念 ,指细胞受到一些特殊信号刺激后 ,按照内在程序 ,即细胞所固有的“死亡程序”,由其自身内部机制调控的主动的细胞死亡 ,属于机体自身的生理活动 ,也称为程序性细胞死亡 (Programmed cell death,PCD)。近些年 ,随着器官移植的不断开展和深入研究 ,人们逐渐认识到细胞凋亡在器官移植中具有特殊的生物学意义。肝移植中的缺血 -再灌注损伤 (ischemia reperfusion,I/ R)主要发生在肝脏保存再灌注损伤 (Hepatic preservationre…     

A20在大鼠小体积肝移植早期缺血再灌注损伤中的作用机制

目的 初步研究A20在小移植物损伤中的地位和作用，为临床应用提供理论依据。方法 选取雄性SD大鼠，分为正常对照组、全肝移植组和小体积肝移植组3组，在移植后0．5及3、6、24h的4个时间点分别取材、送检。主要进行肝功能检测及肝组织病理组织学检查；采用原位末端标记法(TUNEL法)检测细胞凋亡情况，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测A20在肝组织中的表达，Westernblot检测肝组织内蛋白的表达。结果 移植后各时点丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)水平均升高，至术后6h达到高峰，组织病理学检查可见小体积肝移植组移植后6h损伤最重。TUNEL法细胞凋亡检查见小体积肝移植组各时间点细胞凋亡数均显著多于全肝移植组，移植后6h为高峰。Western blot和RT-PCR法在不同水平检测结果提示保护性基因A20在小体积肝移植组的移植物内表达下降，并随再灌注时间的延长迅速下调。结论 大鼠小体积肝移植术后再灌注损伤以肝细胞功能改变及大量肝细胞凋亡为特点。肝组织内保护性基因A20的下调可能是小移植物缺血再灌注损伤发生的重要始动环节之一。     

三七总皂甙对大鼠肝移植缺血再灌注损伤的保护作用

目的探讨三七总皂甙对大鼠肝移植I／R损伤的影响及可能机制。方法SD大鼠随机分为3组：假手术(SO)组，生理盐水灌注(NS)组，三七总皂甙灌注(PNS)组。于供肝再灌注后2h处死动物取出肝脏标本，检测肝细胞凋亡及BCL-2，MDA水平。结果假手术组肝细胞凋亡少见，NS组与PNS组与SO组比较，肝细胞凋亡显著增高。PNS组与NS组比较，肝细胞凋亡显著降低。肝细胞BCL-2蛋白的阳性表达，PNS组与NS组和SO组比，差异有显著性。MDA含量：PNS组与NS组和SO组比，差异有显著性。结论PNS预处理对肝脏缺血／再灌注损伤(I／R)具有保护作用，其可能机制为抑制氧自由基生成，上调调控基因BCL-2蛋白的表达抑制肝细胞凋亡。     

双嘧达莫预处理对大鼠原位肝移植缺血再灌注损伤的保护作用

目的:探讨双嘧达莫(DP)预处理对大鼠原位肝移植缺血再灌注损伤(IRI)的保护作用及机制。方法:建立大鼠原位肝移植动物模型,应用不同剂量DP(B组:0.1mg·kg-1、C组:0.2mg·kg-1、D组:0.4mg·kg-1)进行预处理,并与盐水预处理组(A组)进行对照,分别检测移植前、移植后6h血清肝酶谱及移植前、移植后1h及6h肝组织一氧化氮(NO)、髓过氧化物酶(MPO)水平。结果:C、D组与A组比较能明显降低移植后血清肝脏酶学水平、增加组织内NO水平、降低MPO水平(P<0.01),C组作用更为明显。结论:DP预处理能够对大鼠原位肝移植的IRI产生保护作用。     

抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体减轻大鼠移植肝缺血再灌注损伤的实验研究

目的研究抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体(Anti-TNF-αmAb)对大鼠移植肝缺血再灌注损伤的作用及机制。方法SD大鼠80只,体重(250±20)g,随机分为受体组与供体组。两两随机配对后再随机分为实验组和对照组,建立原位肝移植模型。实验组供肝经门静脉冷灌注20ml4℃的生理盐水+抗TNF-α单克隆抗体(0.1mg/kg);对照组供肝经门静脉冷灌注20ml4℃的生理盐水。采用全自动生化分析仪,酶联免疫吸附实验(ELISA)法,HE染色,TUNEL法分别测定血肝功能酶(ALT,AST),血浆TNF-α,肝组织病理改变及肝细胞凋亡情况。结果实验组应用抗TNF-α单克隆抗体后血ALT,TNF-α水平显著低于对照组(P<0.01),血AST水平低于对照组(P<0.05),肝组织形态学无明显改变,细胞凋亡显著减少。结论抗TNF-α单克隆抗体能有效减轻大鼠移植肝脏缺血再灌注损伤,缓解肝功能下降。     

人双突变型低氧诱导因子1α真核表达载体的构建及鉴定

目的构建能在哺乳动物细胞得到常氧下高表达的携带HIF-1α突变型HIF-1α-Ala402-Ala 564基因真核表达载体pShuttle2-HIF1α—Ala402-Ala564。方法 采用分子克隆技术,在业已完成的pShuttle2-HIF-1α—Ala564的基础上,用连续聚合酶链式反应（PCR）定点突变的方法将其第402位脯氨酸密码子CCA突变为丙氨酸密码子GCA,构建成双突变HIF-1α真核表达载体pShuttle2-HIF-1α—Ala402-Ala564。结果 经酶切鉴定及基因测序证实人双突变型低氧诱导因子1α真核表达载体pShuttle2-HIF1α—Ala402-Ala564构建成功。结论 成功构建重组人双突变型低氧诱导因子1α真核表达载体pShuttle2-HIF1α—Ala402-Ala564,为缺血性心脏病的HIF-1α基因治疗研究奠定基础。     

短时间多次缺血预处理对大鼠移植肝缺血再灌注损伤的保护作用

目的:探讨短时间多次缺血预处理(ischemic preconditioning,IP)对大鼠移植肝脏缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)的保护作用。方法:采用SD大鼠原位肝移植动物模型,供肝冷保存120 min,无肝期14 min。54只SD大鼠随机分成5组：对照组(A组,n=6),不做肝脏移植手术;肝移植组(B组,n=12),供体大鼠肝脏4℃乳酸林格液保存2 h后,采用双袖套法行原位肝移植;缺血预处理肝移植组(C1、C2、C3组,每组12只)：将供肝进行缺血预处理后切除供体大鼠肝脏,4℃乳酸林格液保存2 h,行原位肝移植,根据阻断第一肝门5 min,开放再灌注5 min为1个循环,处理1～3个循环分别命名为C1、C2和C3组。术后检测各组血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)活性,每分钟胆汁量,免疫组化检测肝细胞Bcl-2表达,TUNEL法检测细胞凋亡,电镜观察细胞超微结构的改变。结果:术后B组血清ALT、AST、LDH活性明显高于A组,每分钟胆汁量明显低于A组(P<0.01);C组ALT、AST、LDH活性虽明显高于A组(P<0.01),但比B组明显降低(P<0.05);随着IP次数增加,C1、C2、C3组ALT、AST、LDH活性递减,而每分钟胆汁量逐渐增加。细胞形态学检查发现,与B组比较,C组供肝组织细胞结构改变较小,Bcl-2表达增加,凋亡指数降低(P<0.01或P<0.05)。结论:IP对大鼠供肝缺血再灌注损伤具有保护作用,短时间多次IP对肝脏的保护作用更强。     

缺血预处理对大鼠减体积肝移植缺血再灌注损伤的影响

目的 观察缺血预处理(ischemia preconditioning,IPC)对大鼠减体积肝移植后肝组织氧化还原因子-1(Redox factor-1,Kef-1)蛋白表达及术后肝脏损伤的影响.方法 将100只Lewis成年雄性大鼠随机分成3组缺血预处理组(IPC组)、50%移植组(PLT组)和假手术组(SO组),分别于移植后0.5、2、6和24 h取材,通过Western免疫杂交法和免疫组织化学技术结合图像分析定量检测移植后各时间点Ref-1蛋白表达变化,同时结合血清学和组织病理学分析Ref-1表达变化的意义.结果 IPC可使减体积肝移植后早期肝实质细胞中Ref-1蛋白表达增高.与PLT组相比,IPC组早期Ref-1蛋白表达明显升高(P＜0.05).病理学分析显示PLT组术后24h可见到门脉周围大量炎细胞浸润,肝窦扩张明显,肝组织损伤较重;而IPC组则损伤较轻.术后6和24 h血清ALT值分别为PLT组(1186.65±142.31)u/L;(1498.91±126.79)u/L;IPC组(799.61±125.97)u/L;(659.27±135.68)u/L.与PLT组相比,IPC组术后6和24h血清ALT值明显降低(P＜0.05;P＜0.01).结论 IPC可减轻减体积肝移植后早期肝脏的损伤,其机制可能与促进Ref-1蛋白的表达有关.     

肺缺血再灌注损伤后TNFα的变化及其意义

肿瘤坏死因子－α（Ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒａｌｐｈａ，ＴＮＦα）在休克、创伤、脓毒症等引起的炎症反应发病环节中具有重要作用。有关肺缺血再灌注损伤早期ＴＮＦα的变化及其作用，报道不多。本实验检测了大鼠肺在体缺血再灌注损伤早期肺组织和血浆ＴＮＦα含量变化，探讨ＴＮＦα变化与肺组织损害的关系。１　材料与方法１．１　动物模型与分组：健康Ｗｉｓｔａｒ大鼠４８只，体重２００～５００ｇ，雌雄不拘，随机分为二组。按Ｅｐｐｉｎｇｅｒ模型〔１〕，腹腔注射３％戊巴比妥钠（４０ｍｇ／ｋｇ）麻醉后，气管切…     

外源性联合应用EPCs和SDF-1α对大鼠肝移植缺血再灌注的保护作用

目的：探讨外源性注射骨髓来源的血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）或基质细胞源性因子-1α（stro－mal derived factor-1 alpha,SDF-1α）或两者联合,比较性评估3种方法对大鼠肝移植术后缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury,IRI）的影响。方法：LEWIS大鼠骨髓EPCs提取培养,流式表型鉴定,激光共聚焦功能鉴定;建立大鼠原位肝移植模型,随机分为5组：A组（假手术组）,B组（手术组）,C组（SDF-1α组）,D组（EPCs组）,E组（SDF-1α+EPCs组）;再灌注12 h后处死各组大鼠,免疫组化检测肝组织再生以及肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）的表达情况;WB检测肝组织血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、HGF、转化生长因子-β（transforming growth factor-beta,TGF-β）、B细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Caspase-3）蛋白表达;ELISA检测VEGF、HGF、TGF-β表达。结果：LEWIS大鼠骨髓提取的EPCs CD34、CD133的阳性比例分别为78.32%、70.76%,同时具有结合ac-LDL和UEA-1功能的EPCs,阳性率达80%以上;SDF-1α诱导EPCs穿过的细胞数[（79.6±6.3）个]明显高于对照组[（36.2±2.9）个]（P=0.000）;各组大鼠肝组织中,C、D组肝组织HGF分泌和再生情况免疫评分明显高于A、B组（P=0.000）,E组免疫评分明显高于C、D组（P=0.000）;各组VEGF、HGF、TGF-β、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达结果,C、D组VEGF、HGF、TGF-β、Bcl-2蛋白表达明显高于A、B组（P=0.000）,E组VEGF、HGF、TGF-β蛋白表达明显高于C、D组（P=0.000）,而C、D、E组Bcl-2蛋白表达比较差异无统计学意义。B、C、D组Caspase-3蛋白表达明显高于A组（P=0.000）,而E组Caspase-3蛋白明显低于C、D组（P=0.000）;ELISA结果与Western blot结果一致。结论：外源性联合应用EPCs和SDF-1α能有效保护肝移植缺血再灌注的损伤,诱导肝细胞再生,减少肝细胞凋亡。