人α半乳糖苷酶和α1,2岩藻糖基转移酶协同抑制NIH3T3细胞与人血清的异种免疫反应(英文)

目的:研究人α半乳糖苷酶和人α1,2岩藻糖基转移酶在NIH3T3细胞上协同性地抑制Gal抗原表位的表达和相关异种反应性。方法:流式细胞术比较G抗原、H抗原和人天然抗体(IgG和IgM)的表达水平,蛋白质印迹检测G抗原糖蛋白的表达,四唑盐(MTT)比色试验检测NIH3T3细胞在人血清介导的裂解作用下的活力。结果:转染人α半乳糖苷酶和人α1,2岩藻糖基转移酶的NIH3T3细胞中G抗原的表达及其与人天然抗体(IgG和IgM)的结合能力都显著下降,其抗人血清介导的细胞裂解反应能力有效提高。结论:人α半乳糖苷酶和α1,2岩藻糖基转移酶能够相互协同抑制Gal抗原表位表达和相关异种排斥反应。     

岩藻糖基转移酶FUT4基因表达对急性淋巴细胞白血病患儿预后的影响研究

目的 岩藻糖基转移酶Ⅳ(fucosyltransferase Ⅳ,FUT4)是负责催化合成岩藻糖基化寡糖Lewis X(LeX)和Lewis Y(LeY)等的关键酶,在许多上皮来源的恶性肿瘤中高表达,且在肿瘤细胞中的表达特点和调控机制不同.本研究探讨儿童急性淋巴细胞白血病(Acute Lymphocytic Leuke...     

腺病毒载体介导的人分泌型α(1,2)岩藻糖基转移酶的表达降低Galα(1,3)Gal抗原表位水平(英文)

目的:检测人分泌型α(1,2)岩藻糖基转移酶降低Galα(1,3)Gal表位(gal表位)水平.方法:以人腺病毒载体表达人分泌型α(1,2)岩藻糖基转移酶.流式细胞术比较H血型抗原和gal表位的表达水平.MTT法分析小鼠NIH3T3细胞对人天然抗体和补体介导的细胞裂解作用的敏感性.结果:设计并构建了表达人分泌型α(1,2)岩藻糖基转移酶基因的复制缺陷型重组腺病毒载体Ad5hSeFT.流式细胞分析结果表明,NIH3T3细胞及Ad5null和Ad5hSeFF感染后的NIH3T3细胞,UEA-Ⅰ凝集素结合细胞的平均荧光强度(MFI)分别为2.3±0.6,2.1±1.0和36.5±5.9;GS-IB4凝集素结合细胞的MFI值分别为167±23,170±19和100±14;人天然IgG和IgM抗体结合细胞的MFI值分别为31±3,32±4和22±4.结论:NIH3T3细胞被Ad5hSeFF感染后在细胞表面表达了H血型抗原,导致细胞表面gal表位的表达下降了40％,并且这种下降增强了细胞对正常人血清裂解作用的抵抗力.     

以腺病毒为载体表达猪α(1,3)半乳糖基转移酶反义RNA抑制Galα(1,3)Gal抗原表位的表达

目的:尝试以反义RNA的方法抑制Galα(1,3)Gal抗原表位(gal抗原)的表达.方法:以人腺病毒载体表达猪α(1,3)半乳糖基转移酶基因的反义RNA.流式细胞术比较H血型抗原和gal抗原的表达水平.结果:构建了表达反义RNA的重组腺病毒载体Ad5anti-sGT600和Ad5anti-sGT1100.反义RNA的表达使NIH3T3细胞表面的gal抗原表位下降约30％.另外,反义RNA与人分泌型α(1,2)岩藻糖基转移酶的共同作用可使gal抗原表位的水平进一步下降.结论:重组腺病毒Ad5anti-sGT600和Ad5anti-sGT1100可有效降低gal抗原表位的表达.     

稳定表达抗HER2单克隆抗体的FUT8基因敲除细胞株的建立

本研究在实验室前期构建的敲除α-1,6-岩藻糖基转移酶(FUT8)基因的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株(FUT8-/--CHO-S)基础上,建立了稳定表达IgG1型抗HER2单克隆抗体的稳转细胞株。以曲妥珠单抗为模式蛋白,构建了带有嘌呤霉素抗性基因的表达载体pIRES-HC和pIRES-LC,并用电穿孔法共转染入FUT8-/--CHO-S细胞,通过嘌呤霉素加压培养、Dot Blot和WesternBlot等检测方法,经过两轮有限稀释筛选出了高表达的稳转细胞株Tru-FUT8-/--CHO-S。该细胞株在批次培养(Batch)中最高生长密度达每毫升6.05×106个,抗体产量为168 mg/L。在补料培养(Fed-Batch)中,通过补料CHO Feed4的添加,最高生长密度提高到每毫升17.1×106个,抗体产量达到437 mg/L,试验结果表明改造的FUT8-/--CHO-S细胞株具有开发成工业细胞株的潜力。     

FUT2基因参与人肿瘤细胞系BEL-7404、SGC-7901和SPC-A-1上H血型抗原的表达

目的:调查H血型抗原在人肿瘤细胞系BEL-7404、SPC-A-1和SGC-7901上的表达.方法:免疫组织化学和流式细胞术分析细胞上H抗原在体内外的表达.RT-PCR,Southern印迹和限制性酶切分析确定FUT2基因在细胞中的表达.结果:SGC-7901,BEL-7404和SPC-A-1细胞表面H抗原表达的平均荧光强度分别为162±43,81±25和28±17.并且用RT-PCR从这些细胞中扩增出(?)约1.0 kb DNA条带,此条带能被FUT2特异核酸探针检出.结论:人肿瘤细胞系BEL-7404,SPC-A-1和SGC-7901于体内外在细胞表面均表达H抗原,但表达水平在细胞之间变化显著.FUT2基因的表达在细胞膜上产生这些抗原.     

携带人α1,2-岩藻苷转移酶基因转基因小鼠的建立

目的：建立携带人α1，2-岩藻苷转移酶[alpha（1，2）-fucosyltransferase，HT]基因的转基因小鼠模型。方法：采用受精卯显微注射法，将人HT转基因构件导入昆明白小鼠受精卵的雄原核内，然后将注射后仍健康的受精卵植入假孕母管内，等其自然分娩。对G0代小鼠，应用聚合酶链反应（PCR）和Southern杂交检测人HT基因的整合情况、应用逆转录PCR（RT—PCR）检测人HT基因mRNA水平的表达，应用流式细胞计数（FCM）检测H抗原及α—Gal抗原在小鼠外周血单核细胞（PBMCs）表面的表达。结果：注射后卵的存活率和幼鼠出生率分别为84．9％（968／1140）和10．8％（105／968），外源基因的整合率为7．6％（8／105），基因整合阳性小鼠中有7只的心、肝、肾及骨骼肌组织均有人HT mRNA表达，并且PBMCs表面H抗原表达阳性，表达强度为人PBMCs的95％-150％，同时α—Gal抗原表达减少，为正常小鼠的5％-10％。转基因小鼠已经稳定传3代。结论：携带人α1，2-岩藻糖苷转移酶基因的转基因小鼠模型已制备成功。     

反义猪α(1,3)半乳糖转移酶转基因小鼠的人鼠异种反应性降低(英文)

目的:研究体内α(1,3)半乳糖转移酶α(1,3)GT反义抑制降低Galα(1,3)Gal(Gal表位)异种抗原的作用。方法:原核显微注射法产生转基因小鼠,PCR和Southern-blot鉴定转基因的整合,RT-PCR检测小鼠α(1,3)GT的表达,组织学染色检查脾脏形态,免疫荧光检测Gal表位,流式细胞仪分析人血清中异种天然抗体(IgM和IgG)和补体(C3c)对鼠源细胞的结合。结果:猪反义α(1,3)半乳糖转移酶转基因小鼠发育正常,但部分杂合体小鼠脾脏有细胞坏死特征。转基因小鼠细胞表面Gal表位数量明显减少。与野生型对照相比,转基因小鼠多种组织的细胞对人血清异种天然抗体的结合降低30％-60％,对补体的结合降低40％-50％。结论:通过反义基因抑制α(1,3)半乳糖转移酶的表达能有效降低人异种反应性。     

基于转录组的不同产地党参糖基转移酶鉴定及分析

潞党参为山西道地药材,其药效成分党参多糖等含量显著高于其他产地党参[Codonopsis pilosula(Franch.) Nannf.]。糖基转移酶是党参主要药效成分党参多糖和党参苷Ⅰ等合成的关键酶,本研究基于不同产地党参转录组数据,对糖基转移酶基因进行GO及KEGG功能注释、保守结构域分析、进化树分析及表达模式分析,为探索潞党参道地性形成机制提供理论依据。本研究共筛选鉴定出98个糖基转移酶基因,分属于GT family 1、GT family 2、GT family 90等家族。GO功能注释发现多属于分子功能中的催化活性条目。KEGG功能注释发现党参糖基转移酶主要参与聚糖生物以及萜类和聚酮类化合物代谢。其中, GT family 1的42个糖基转移酶基因保守结构域为:[X]-W-[2X]-Q-[3X]-[LH]-[5X]-[FLTHCGWNS]-[2X]-E-[4X]-[GVP]-[4X]-P-[4X]-Q-[2X]-[NAK]。通过与拟南芥的糖基转移酶序列比对分析,党参糖基转移酶主要位于拟南芥UGT73、72、85分支中。基因表达模式分析发现党参CpUGT73AH2在潞党参植株...     

转人α1,2岩藻糖苷转移酶基因猪动脉内皮细胞的活化抑制实验

目的探讨人α1,2岩藻糖苷转移酶(HT)基因转移抑制猪动脉内皮细胞(PAEC)Ⅱ型活化的作用和机制。方法用不同条件刺激转人HT基因和正常的PAEC,在不同时段分别采用细胞酶联免疫吸附测定方法检测细胞间黏附分子(ICAM)-1在细胞表面的表达。采用免疫细胞化学方法检测细胞接受刺激12h后2种PAEC核因子(NF)-κB阳性细胞百分数。结果3种刺激均可以活化PAEC,使其表面ICAM-1的表达逐步升高,并在12h左右达到峰值。实验组和对照组细胞在接受刺激4h后ICAM-1的表达差异有统计学意义(P值均<0.05),实验组细胞ICAM-1的表达量均低于对照组,细胞的活化受到抑制。在不同条件下刺激12h后2种细胞的NF-κB阳性细胞百分数差异有统计学意义(P值均<0.05),表达人HT的PAECNF-κB阳性细胞百分数比正常猪动脉内皮细胞低。结论表达人HT的PAECⅡ型活化受到抑制,人HT基因转移可能一定程度抑制异种移植急性血管排斥反应(AVR),并且可能通过NF-κB发挥作用,PAECⅡ型活化的条件是多样的。     

rolB基因对颠茄表型发育和托品烷生物碱合成的影响

发根农杆菌pRiA4质粒上的rol基因是促进次生代谢的强效基因,可利用rol基因对颠茄进行分子育种以提升颠茄中托品烷生物碱(tropane alkaloids, TAs)含量。本研究将rolB基因在颠茄植株中进行超表达,为了研究rolB基因对颠茄TAs生物合成的影响,分析了转基因颠茄的表型、TAs含量及TAs合成途径中关键酶基因的表达水平。结果表明,转基因颠茄根系发达,叶片增大、叶片鲜重增加、叶片颜色加深,花朵增大、花形改变,雌蕊高度降低,花粉活力下降。转基因颠茄茎中TAs的含量显著高于对照,东莨菪碱、山莨菪碱、莨菪碱的含量分别为对照的2.11～2.91、1.23～2.37、4.88～5.20倍。与对照组相比, TAs合成途径中的关键酶基因N-甲基腐胺转移酶(PMT)、吡咯烷聚酮合酶(PYKS)、托品酮还原酶I (TRI)、芳香族氨基酸氨基转移酶4 (ArAT4)、UDP-糖基转移酶1 (UGT1)和莨菪碱6-β-羟化酶(H6H)的表达上调,且托品酮还原酶II (TRII)作为代谢分流基因表达下调。研究表明rolB基因通过增强TAs合成途径代谢流和减弱竞争支路代谢分流,增强了颠茄根中T...     

海洋链霉菌Streptomyces parvus SCSIO Mla-L010中大环内酰胺类抗生素vicenistatin的糖基定向改造

目的 利用海洋链霉菌Streptomyces parvus SCSIO Mla-L010中糖基转移酶的底物宽泛性对vicenistatin进行糖基定向化改造.方法 采用组合生物合成技术分别将其他糖苷类天然产物生物合成途径中的糖基合成基因导入到SCSIO Mla-L010菌株中,构建糖基合成基因异源表达重组菌株;以有机溶...     

异种移植模型转人a1,2岩藻糖基转移酶基因小鼠显微注射DNA片段的制备

目的制备转人琢1,2岩藻糖基转移酶(HT)基因小鼠显微注射DNA片段。方法引物两端设计酶切识别位点,聚合酶链反应(PCR)扩增HTcDNA全长序列,两端含有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切识序列;回收HTcDNA片段并与PMD18-T载体连接,EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切纯化质粒鉴定;EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切pMD18-HTcDNA重组质粒和pCMV-MCS质粒,回收HTcDNA片段和pCMV-MCS质粒片段,进而连接,转化感受态细菌,纯化质粒对其进行酶切、PCR和测序鉴定;PvuⅠ和NotⅠ依次单酶切重组质粒pCMV-MCS-HTcDNA,回收大小约2.85kb片段,溶于适量显微注射用缓冲液。结果成功构建了重组质粒pCMV-MCS-HTcDNA,酶切回收了2.85kb的显微注射DNA片段。结论通过基因工程技术可以获得转人HT基因小鼠显微注射DNA片段,包含基因表达元件,可以用于显微注射法建立转人HT基因小鼠。     

三七PnUGT1基因的全长cDNA克隆和生物信息学分析

本研究通过对三七的转录组高通量测序结果进行分析,采用5’-RACE和RT-PCR方法,对其中一条可能参与三萜皂苷合成的UDP-糖基转移酶基因转录本(Pn02086)进行全长克隆,预测了该基因编码蛋白的理化性质、保守结构域等,并对其进行了进化分析。通过全长克隆,得到一条开放阅读框为1 488 bp的cDNA序列,命名为PnUGT1,GenBank登录号JX018210。该基因编码495个氨基酸,蛋白分子量为55.453 kD,属于不稳定蛋白。二级结构中α-螺旋占36.16%、β-折叠占11.31%、无规卷曲占52.53%。InterProScan预测该蛋白具有7个保守结构域,包括在植物次生代谢产物中相关糖基转移酶特有的PSPG保守基序。该蛋白不具有信号肽和跨膜区,最有可能定位在细胞质中。序列比对和进化关系分析表明,该蛋白和蒺藜苜蓿三萜合成相关的UDP-糖基转移酶AAW56092的亲缘关系较近,PSPG保守区域的相似性为66%。该基因在三七叶中表达量较在花、茎和根中的表达量高。推测PnUGT1基因可能参与了三七皂苷的合成。     

封闭内质网蛋白激酶IRE1α对肠道发育的影响

目的探讨肌醇酶1α(IRE1α)在非洲爪蟾胚胎发育中的作用。方法利用全胚胎原位杂交法检测IRE1α在胚胎发育晚期的表达;设计合成特异性封闭IRE1α的反义寡核苷酸(MO),通过显微注射方法实现基因封闭。结果 IRE1α在胚胎发育晚期高表达于胰腺。在体外翻译系统中,IRE1αMO可以阻断IRE1α蛋白质的合成。封闭IRE1α对胚胎发育早期无明显影响;但在发育晚期导致肠道结构消失,胚胎发育明显异常。结论 IRE1α对非洲爪蟾胚胎发育早期无影响,但在晚期导致肠道发育异常。     

龋齿疫苗的研究进展

美国亚拉巴马大学 (UAB)和 Forsyth牙科中心的研究者发现 ,由引起龋齿的变异链球菌 (Sm)抗原构成的嵌合蛋白在龋齿小鼠模型中有效。　　 UAB的研究者研制了一种双头合成抗原 ,一侧为 Sm糖基转移酶的葡萄糖结合区 ,此酶能帮助细菌附着于牙齿表面 ,推测抗此酶抗体能阻止细菌附着于牙齿 ,从而使其不能引起龋齿。合成分子的另一半是大肠杆菌的硫氧还蛋白 ,一种免疫刺激物。研究者通过鼻腔给予小鼠疫苗 ,然后使它们接触足以引起龋齿剂量的 Sm来试验此原型疫苗的效果。　　结果显示 ,免疫鼠的 Sm数量明显少于对照动物 ,龋齿损害程度亦较轻。…     

Effect of IRE1α knockdown on gut development

目的 探讨肌醇酶1α(IRE1α)在非洲爪蟾胚胎发育中的作用.方法 利用全胚胎原位杂交法检测IRE1α在胚胎发育晚期的表达;设计合成特异性封闭IRE1α的反义寡核苷酸(MO),通过显微注射方法实现基因封闭.结果 IRE1α在胚胎发育晚期高表达于胰腺.在体外翻译系统中,IRE1αMO可以阻断IRE1α蛋白质的合成.封闭IRE1α对胚胎发育早期无明显影响;但在发育晚期导致肠道结构消失,胚胎发育明显异常.结论 IRE1α对非洲爪蟾胚胎发育早期无影响,但在晚期导致肠道发育异常.     

用包埋在果胶酸钙凝胶中的重组大肠杆菌生产三磷酸核苷

三磷酸核苷是用糖基转移酶合成寡糖的重要中间体 ,可从单磷酸核苷经过量表达聚磷酸激酶 (PPK )的大肠杆菌BL 2 1(DE3)或以 1% (w/ v)聚磷酸作为磷酸供体和能量来源的产氨棒状杆菌 (Corynebacterium ammoniagenes ATCC2 12 6 4 )产生。果胶酸钙凝胶的颗粒在聚磷酸反应液中 ,6 0 d内能保持稳定 ,而 PPK的活性比初值降低了 5 0 %。这项技术可应用于大规模合成寡糖。用包埋在果胶酸钙凝胶中的重组大肠杆菌生产三磷酸核苷@龚家玮     

半乳糖糖基转移酶反义核酸诱导卵巢癌细胞凋亡的实验研究

目的研究α-1,4半乳糖糖基转移酶(α-1,4galactosyl transferase,α-1,4Gal-T)基因反义核酸诱导卵巢癌细胞COC1凋亡的作用。方法人工合成α1,4Gal-T基因的反义寡脱氧核苷酸,采用脂质体介导的基因转染方法将反义寡脱氧核苷酸转入卵巢癌细胞COC1中。用流式细胞仪检测其红细胞三糖基神经酰胺(Globotriaosyl ceramide,Gb3)的表达,以及卵巢癌细胞COC1的凋亡率。结果脂质体介导的反义寡脱氧核苷酸转入卵巢癌细胞COC1后,其红细胞三糖基神经酰胺含量显著下降(P<0.05),卵巢癌细胞COC1的凋亡率显著升高(P<0.05)。结论1,4Gal-T基因反义核酸能够诱导卵巢癌细胞COC1的凋亡。     

壳寡糖通过p38MAPK糖基化修饰抑制TNF-α诱导的EA.hy926细胞IL-6、IL-8的表达

目的探讨壳寡糖对血管内皮细胞损伤的保护机制。方法以EA.hy926血管内皮细胞为研究对象,通过TNF-α刺激,建立高表达IL-6、IL-8的内皮细胞损伤模型。以RT-PCR和ELISA方法分别从mRNA和蛋白水平检测壳寡糖对IL-6、IL-8表达的影响。采用Western blot方法检测壳寡糖对p38MAPK信号通路及糖基转移酶(OGT)表达的影响。分析验证p38MAPK信号通路抑制剂和葡萄糖氨对TNF-α诱导的IL-6、IL-8表达的影响。结果成功建立了TNF-α诱导的高表达IL-6、IL-8的血管内皮细胞损伤模型。壳寡糖可从mRNA转录和蛋白翻译水平抑制IL-6、IL-8的表达。初步揭示壳寡糖对TNF-α诱导血管内皮细胞表达IL-6、IL-8的抑制作用可能是通过p38的磷酸化和O-连接糖基化相互作用来完成的。结论壳寡糖可通过OGT调控TNF-α诱导的EA.hy926细胞IL-6、IL-8的表达,保护血管内皮细胞,减少炎症损伤。