RCS大鼠视网膜色素变性过程中视网膜形态学研究

目的研究遗传性视网膜色素变性大鼠(Royal College of Surgeons rat,RCS rat)在视网膜变性发展过程中视网膜形态学变化.方法 RCS-p (视网膜含色素的变性大鼠)按出生后视网膜变性的发展状况分为变性早期(RCS15 d)、中期(RCS 30 d)、晚期(RCS90 d)3个时相点,分别采用相应时期的RCS-rdy p (视网膜含色素的正常大鼠)作为对照组(control groups,C 15 d,C 30 d,C 90 d),每组5眼,取各组大鼠眼球进行视网膜切片,行HE染色,采用MIAS-1000图像分析系统在400倍光镜下测视网膜外节(OS)、外核层(ONL)以及内核层(INL)厚度.结果①视网膜感光细胞随着病变的发展逐渐变性死亡,晚期视网膜色素上皮层和感光细胞层结构紊乱,但光镜下观察内核层、神经节细胞层仍保持较正常的形态.②与对照组比较,RCS大鼠视网膜色素变性过程中感光细胞外节膜盘堆积,外核层变薄,内核层在变性中期增厚,早期及晚期变薄.结论①RCS大鼠病变发展过程中视网膜各层神经元形态改变的不一致性.②变性中期视网膜内核层较对照组增厚,可能与该时期内核层神经元缺乏前级神经元的信号输入致细胞突起反应性增生,产生视网膜形态重构(remodeling)有关.     

干细胞移植治疗视网膜色素变性研究进展

视网膜色素变性（RP）是一组遗传性退行性视网膜疾病,主要影响视杆细胞和视网膜色素上皮细胞（RPE）。早期特征性临床表现为夜盲和周边视野的丧失,最终导致中心视力的丧失,目前尚无有效治疗方法。近年来干细胞移植治疗视网膜色素变性取得了一些进展,下面就对其进行综述。     

Nogo-A/B蛋白在RCS大鼠视网膜色素变性过程中的表达

目的 观察髓磷脂抑制蛋白Nogo-A/B在遗传性视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)遗传模型皇家外科学院大鼠( Royal college of surgeons rat,RCS)视网膜变性发展过程中的表达并探讨其意义.方法 按出生后视网膜变性的发展程度将RCS-p+(视网膜含色素的变性大鼠)分为P15d、P30d、P60d和P90d 4组,采用相应时期的RCS-rdy+p+(视网膜含色素的正常大鼠)作为对照,5只/时间点,利用免疫组织化学技术及免疫印迹检测2组(共40只)RCS视网膜上Nogo-A/B蛋白的表达趋势.结果 与对照组相比,①P15d、P30d RCS-p+大鼠视网膜各层结构和细胞数目无明显变化,仅节细胞数目轻微减少;P60d、P90d大鼠视网膜外核层(outer nuclear layer,ONL)和内核层(inner nuclear layer,INL)结构出现明显紊乱,细胞数目的减少以ONL和神经节细胞层(ganglion cell layer,RGC)层为主.②IH显示Nogo-A/B蛋白在RCS-p+大鼠各时间段视网膜表达均为阳性,P15d开始出现,随变性过程呈升高趋势,主要表达在INL和RGC层,阳性细胞数目显著高于对照组.③WB免疫印迹检测结果显示P15d、P30d、P60d和P90d Nogo-A蛋白表达量分别为(0.82737±0.212 92)、(1.110 19±0.089 99)、(1.315 52±0.028 57)、(1.268 81±0.080 42),与对照组相比有显著差异(P＜0.05).Nogo-B2蛋白与Nogo-A蛋白表达趋势一致,但总体表达量较低.结论 Nogo-A蛋白可能参与了视网膜色素变性过程中视神经损伤后的再生修复抑制.     

视网膜色素变性缓慢型视网膜变性基因突变的研究

视网膜色素变性（ＲＰ）是由视网膜光感受器和色素上皮细胞变性导致的，特征为夜盲和进行性视野缺损的一组常见致盲眼底病，同时又是具有遗传异质性的单基因遗传病，是遗传性视觉损害和致盲的最常见原因之一。目前全世界约有１５０万人患此病，其中中国人占１／４左右。由...     

中西医联合治疗视网膜色素变性的初步观察

目的：探讨视网膜色素变性中西医联合用药的治疗方法。方法：本组38例（73眼）视网膜变性的临床分类以及应用维生素E烟酸酯联合活血化瘀中药的疗效观察。结果：本组病例治疗后总有效率86．78％。结论：中西医联合治疗措施是我们对PR治疗的一项新的探讨。     

香港地区汉族人视紫红质基因和视网膜色素变性1基因与视网膜色素变性的双基因关联分析

目的研究视紫红质基因(RHO)和视网膜色素变性1(RP1)基因在香港地区汉族视网膜色素变性(RP)患者中的突变频率及特征,并进一步探讨它们在RP发病机理中潜在的相互作用。方法运用高通量构象敏感凝胶电泳和直接测序方法,对151例香港地区汉族RP先证者和150名对照者进行了RHO和RP1基因全编码区和邻近剪切位点的内含子区域序列突变的检测。对携带基因突变的12例RP先证者的46名亲属进一步作分离分析。运用单因素分析、多因素分析和基因型家系不平衡分析研究RHO和RP1基因对RP的作用。结果RHO基因和RP1基因的突变检出率各为1.3%。RHO基因中-26G>A可增高RP危险性,而RP1基因中R872H则可降低RP危险性。多因素Logistic回归分析揭示了RHO基因IVS423G>A分别与RP1基因N985Y和C2033Y之间存在相互作用。结论在香港地区汉族RP患者中,RHO和RP1基因的突变率比其他人群中RP患者的突变率低。除了致病性基因突变,非编码区的序列改变也可改变RP的易感性。部分RP患者由双基因突变引起,当然多基因共同作用也完全可能存在。     

内源性神经干细胞的原位激活与微环境

研究显示,神经损伤可激活内源性神经干细胞（NSC）增殖、分化和迁移。内源性NSC的原位激活受其微环境中各种信号分子的调控。Wnt、Notch和bHLH信号途径对NSC的激活有着重要的作用。促有丝分裂因子、神经营养素可促进NSC的增殖、分化,中药、针灸亦有一定的促进作用。本文对神经干细胞的生物学特性及微环境的影响加以阐述。     

视网膜色素变性的中医治疗概况

视网膜色素变性（retinitis pigmentosa,RP）是一组以进行性感光细胞及色素上皮功能丧失为共同表现的遗传性视网膜变性疾病,属眼科疑难病之一。主要临床特征是早期出现夜盲、进行性视野缺损、视网膜骨细胞状色素沉着和视网膜电图显著异常或无波形等。是眼底病致盲的重要原因之一。     

RCS大鼠自然病程中视网膜边缘生发区细胞增殖及Shh/Ptc信号途径改变的观察

目的 观察遗传性视网膜色素变性RCS大鼠病程发展中视网膜边缘生发区Shh/Ptc信号途径改变及其与该区细胞增殖能力变化的关系.方法 RCS大鼠按出生后病程变化分为15、30、60、90 d 4组(免疫组化每组4只,PCR每组3只),以同龄含色素的正常大鼠(Long-Evan's 大鼠)作为正常对照.视网膜组织切片DAPI荧光染色观察外核层(outer nuclear layer,ONL)厚度的变化;视网膜细胞增殖标记Ki67免疫荧光染色观察视网膜边缘生发区细胞增殖能力的变化;荧光定量PCR检测视网膜边缘生发区Shh/Ptc信号途径中关键分子Shh、Ptc1、Smo和Gli1 mRNA表达水平.结果 ①RCS大鼠从第15天开始,随着年龄的增加视网膜ONL逐渐变薄,第90天ONL几乎消失.②正常对照组大鼠视网膜边缘生发区Ki67阳性细胞较少,与同龄正常对照组大鼠相比,出生30、60 d组大鼠Ki67阳性细胞数均显著增多(P＜0.05);大鼠各年龄组间比较,60 d组Ki67阳性细胞数明显增多(P＜0.01).③60 d组大鼠视网膜边缘生发区Shh、Ptc1、Smo和Gli1mRNA表达水平明显上调.结论 出生后60 d RCS大鼠视网膜边缘生发区Shh/Ptc信号途径的激活,可能刺激了该部位细胞短期的增殖.     

神经干细胞与大鼠RPE细胞间的线粒体转运及对RPE细胞凋亡的影响

目的 研究小鼠神经干细胞(neural stem cells, NSCs)C17.2细胞系与从RCS大鼠变性视网膜中原代分离视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial,RPE)的线粒体交换方式及其对RPE细胞特性的影响.方法 分离RCS大鼠RPE细胞并进行培养和鉴定.分别用线粒体特异性标记物Mitotracker-red和Mitotracker-green标记RPE细胞和小鼠NSCs细胞的线粒体,将两种细胞共培养,激光共聚焦显微镜下观察两种细胞之间隧道纳米管(tunneling nanotubes,TNT)的形成及线粒体转运方式.采用流式细胞仪检测与NSCs共培养后RPE细胞的反应性活性氧类(reactive oxygen species,ROS)水平、细胞周期和细胞凋亡水平的变化.结果 来源于RCS大鼠视网膜的第3代RPE细胞生长状态良好,RPE65及Bestrophin蛋白阳性率细胞均大于95%.与NSCs共培养24 h后,可见RPE细胞与NSCs间TNT的形成,NSCs中的线粒体向RPE细胞方向单向运动,接受NSCs转运的线粒体后,RPE细胞的ROS水平降低(P<0.01);RPE细胞的增殖能力增加,处于S期的细胞比例明显增加(P<0.01),细胞增殖指数(PI)显著增加(P<0.05);RPE细胞早期凋亡细胞比例显著降低(P<0.05).结论 NSCs可通过与相邻的变性RPE细胞之间形成TNT并向其转运线粒体而改善变性RPE细胞的存活.     

骨髓间充质干细胞向视网膜神经节样细胞分化过程中的电生理特性

目的：利用乳鼠视网膜细胞条件分化液将骨髓间充质干细胞( BMSCs)分化为视网膜神经节样细胞,比较BMSCs、诱导后的视网膜神经节样细胞以及原代培养的视网膜神经节细胞(RGCs)的电生理特性。方法：取传至第3代的大鼠BMSCs,利用乳鼠视网膜细胞条件分化液作为诱导剂,进行增殖培养、分化诱导;免疫组织化学法观察NF、MA...     

转录因子诱导人脐带间充质干细胞转分化为视网膜色素上皮样细胞的研究

目的 探讨采用关键转录因子将人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUC-MSCs)转分化为视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)样细胞的方法。方法 通过流式细胞技术鉴定hUC-MSCs的表面标记分子;通过诱导hUC-MSCs分化成为脂肪、骨和软骨细胞确定其多系分化能力;采用慢病毒包装系统获得分别含有11个转录因子Sox2、Pax6、Rax、Six6、Nr2e1、Otx2、Lhx2、Crx、Mitf-A、Klf4和c-Myc的病毒,并通过感染hUC-MSCs来诱导hUC-MSCs向RPE样细胞分化。结果 hUC-MSCs表达CD29、CD44、CD73、CD90和CD105,但不表达CD11b、CD34, CD45和HLA-DR等分子标记,在成脂、成骨、成软骨分化培养基中可分化为脂肪、骨和软骨细胞。视网膜及RPE发育相关的关键转录因子能够将hUC-MSCs直接转分化为RPE样的细胞,并表达ZO-1、RPE65、Bestrophin-1(Best-1)、CK8/18、Cralbp、Mertk、Tyrosinase(Tyr)、PEDF等RPE细胞的特征分子。结论 视网膜及RPE发育相关的关键转录因子可直接将hUC-MSCs分化为RPE样细胞。     

载脂蛋白E与视网膜疾病关系的研究

目的 :通过检测中国汉族人视网膜色素变性患者的载脂蛋白E表型及孔源性视网膜脱离病人视网膜下液(SRF)及血液中载脂蛋白E(apoE)的含量 ,探讨载脂蛋白E与视网膜疾病的关系。方法 :采用等电聚焦及免疫印迹方法检测正常人和视网膜色素变性患者的aopE表型及ELISA方法测定孔源性视网膜脱离病人视网膜下液(SRF)及血液中载脂蛋白E(apoE)的含量。结果 :aopE的ε4 等位基因与视网膜色素变性的发病有关联 (RR =2 5 0 71P <0 0 1)。SRF中apoE的含量与视网膜脱离的范围及时间相关 (P <0 0 1)。结论 :aopE的ε4 基因可能是视网膜色素变性发病的又一遗传因素 ;apoE与孔源性视网膜脱离的损伤修复有关     

大鼠视网膜共培养诱导神经干细胞分化为视网膜神经节细胞

目的:研究新生大鼠视网膜组织与胚胎上丘源神经干细胞共培养对干细胞分化的影响.方法:采用机械分离、无血清培养基选择培养的方法从孕14 d的胚鼠上丘中获取神经干细胞并传代培养.使用组织-细胞共培养系统将出生4 d的乳鼠视网膜组织与上丘源神经干细胞共培养,观察干细胞分化过程,对分化细胞进行鉴定,并与干细胞的自然分化过程进行比较.结果:从胚鼠上丘中获得的细胞在无血清培养条件下聚集呈球形悬浮生长,可以持续传代培养,具有多向分化能力,经免疫荧光鉴定证实为神经干细胞.新生大鼠视网膜组织与胚胎上丘源神经干细胞共培养促进干细胞的分化,并诱导分化出Thy1.1阳性细胞.结论:从胚胎大鼠上丘可以分离培养神经干细胞,与新生鼠视网膜组织共培养可以诱导上丘源神经干细胞分化出视网膜神经节细胞.     

Time course degeneration and expression of glial fibrillary acidic protein in mer-knockout mice

Background Muller cells in the mammalian retina normally express low levels of glial fibrillary acidic protein （GFAP）; however, its expression is upregulated in response to the loss of retinal neurons. The change in expression of GFAP is one of the earliest indicators of retinal damage and is correlated with the time course of disease. The aim of this study was to investigate the time course of degeneration and the expression of GFAP in the retina of mer knockout mice. Methods A total of 30 mer knockout mice, aged from 15-20 days to 1 year and 32 age-matched wild type mice as controls were tested. Immunohistochemistry was used to show the expression of GFAP in the central and peripheral retina of mer knockout and control mice at postnatal age of 15 days （P15d）, 20 days （P20d）, 4 weeks （P4w）, 6 weeks （P6w）, 8 weeks （P8w）, 3 months （P3m）, 6 months （P6m） and 1 years （P1y）.Results The expression of GFAP in the central and peripheral retina of wild type mice was limited to the retinal ganglion cell and nerve fiber layers. In the central retina of mer knockout mice, GFAP expression was upregulated at P4w and GFAP immunolabelling penetrates across the entire thickness of the retina at P8w; whereas in the peripheral retina, the GFAP expression was upregulated at P20d and GFAP immunolabelling penetrates the entire retina after P4w. Conclusions Increased expression of GFAP in Muller cells of mer knockout mice occur at P20d in the peripheral retina and P4w in the central retina. GFAP expression in Muller cells appears to be a secondary response to the loss of retinal neurons. Increased expression of GFAP may occur prior to any detectable morphological changes in the retina. This study suggests that the loss of retinal neurons may begin in the early stages of retinitis pigmentosa, prior to the discovery of any morphological changes in the retina.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外培养及其向视网膜神经样细胞诱导分化的实验研究

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)体外培养和扩增及其向视网膜神经细胞诱导分化的可能性。方法取SD大鼠双侧股骨和胫骨骨髓细胞进行体外培养。培养视网膜神经细胞,收集视网膜细胞培养上清液,配制成条件分化液。将培养的rMSCs先经神经选择诱导后再换用条件分化液诱导,并对诱导的细胞进行免疫荧光鉴定。结果体外培养的rMSCs生长较好并扩增迅速,经2种分化液诱导后可先分化为神经先祖细胞,继而分化为视网膜神经样细胞。分别应用nestin、NeuN、GFAP、Thy1.1行免疫荧光检测,细胞呈阳性反应。结论rMSCs能于体外培养存活和扩增,并且在一定条件下可被诱导分化为视网膜神经样细胞,体外自制分化条件及模拟眼内环境行骨髓间充质干细胞的诱导,将为进一步的眼内移植提供理论依据。