原发胃癌中p16基因及其甲基化状态、表达异常的研究

目的：检测胃癌组织中p16基因及启动了甲基化状态和p16蛋白表达情况。方法：选择p16基因及启动子区域,用PCR－SSCP、MSP（甲基化特异的PCR）法、测序和免疫组化等方法对100例胃癌患者的癌组织和癌旁组织进行检测。结果：71％的病例p16表达阴性,54％的病例具有p16基因启动子区的高甲基化,50％的病例同时有p16表达阴性和p16基因启动子区的高甲基化,无突变和纯合缺失检出。结论：提示p16基因启动子区域高甲基化是胃癌中p16基因失活的主要原因。     

食管鳞癌组织p16基因调控区甲基化及其蛋白表达研究

目的探讨p16基因在食管癌变过程中表达缺失与其启动子区甲基化的关系。方法采用MSP免疫组化方法,检测环太行山地区45例食管鳞癌患者癌组织p16基因启动子区甲基化状态及蛋白表达情况。结果p16基因在癌组织中表达异常41例（91．1％）,间变组织中表达异常38例（84．4％）,发生纯合型甲基化的组织分别为33例（73．3％）（癌组织）和32例（71．1％）（间变组织）,而其周围正常组织26例（57．8％）均发生了p16启动子区的杂合型甲基化。p16基因纯合型甲基化与癌组织、间变组织、p16蛋白表达缺失相关（P〈0．05）。结论该地区食管癌组织p16基因在癌前病变中p16启动子区即发生了纯合型甲基化、食管癌变的早期事件。p16基因启动子区甲基化可单独影响p16蛋白的正常表达。     

肿瘤抑制基因p16在胰腺腺癌细胞系中因纯合性缺失而失表达

目的检测肿瘤抑制基因p16在胰腺腺癌细胞系中的基因改变和在mRNA以及蛋白质水平的表达.方法使用PCR方法检测基因的缺失情况;使用单链构象多态性(SSCP)方法检测基因有无突变;使用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测基因启动子区域的甲基化状态;使用RT-PCR方法检测基因在mRNA水平的表达;使用免疫细胞化学染色和Western blot方法检测基因在蛋白质水平的表达.结果被检测的6个胰腺腺癌细胞系中,有3个细胞系存在p16基因的纯合性缺失,这3个细胞系在mRNA水平和蛋白质水平均无p16基因的表达.在全部6个细胞系中没有发现p16基因突变和启动子区域的过甲基化.结论在被检测的6个胰腺腺癌细胞系中,纯合性缺失是造成p16基因失表达的原因.     

5-氮杂-2′-脱氧胞苷对肺癌SPC-A-1细胞p16、MGMT基因甲基化及其表达的影响

目的观察5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）对体外培养的肺癌SPC-A-1细胞p16、MGMT基因启动子区DNA甲基化状态及其表达的影响,探讨肺癌细胞p16、MGMT基因失活的机制及去甲基化制剂对p16、MGMT基因表达的调控。方法 5-Aza-CdR处理体外培养的肺癌SPC-A-1细胞,甲基化特异性PCR（MSP）法检测用药前后细胞p16、MGMT基因的甲基化状态,RT-PCR法检测用药前后细胞p16、MGMT mRNA。结果加入5-Aza-CdR前,SPC-A-1细胞p16、MGMTmRNA表达缺失,其启动子区域表现为DNA甲基化。加入5-Aza-CdR后,SPC-A-1细胞中p16、MGMT基因呈现DNA去甲基化,而且表达缺失的p16、MGMT mRNA重新表达。结论启动子区高甲基化是肺癌细胞p16、MGMT基因失活的主要原因之一,去甲基化制剂5-Aza-CdR能逆转p16、MGMT基因甲基化状态,从而调控p16、MGMT基因表达。     

老年肺癌病人痰标本中p16基因异常甲基化的研究

目的分析老年肺癌病人痰标本中p16基因启动子区域异常高甲基化的改变情况,评价该指标作为肺癌辅助诊断分子标记物的价值。方法运用半巢式甲基化特异性聚合酶链反应技术,检测94例老年原发性肺癌病人痰标本和部分对应肿瘤组织,以及10例慢性肺炎病例痰标本中p16基因启动子区域的甲基化改变。结果74%的肺癌病人痰标本中检测到了p16基因异常高甲基化,与传统细胞学(46.8%)相比,痰标本中p16基因异常高甲基化对肿瘤的检出率(74.5%)灵敏度更高(P<0.01);痰细胞中p16甲基化检测和细胞学相结合,对肿瘤的检出率可达86.17%(81/94)。如果痰标本中p16基因启动子区域发生高甲基化,其对应的肿瘤组织中p16基因亦为高甲基化。10例慢性肺炎病人痰标本中仅3例检测出p16基因甲基化。结论痰标本中p16基因甲基化是临床肺癌辅助诊断的有效分子生物标记物之一。     

胃癌死亡相关蛋白激酶基因甲基化对其信使核糖核酸和蛋白表达的影响

目的 研究胃癌组织死亡相关蛋白激酶(DAPK)基因启动子区甲基化对原发性胃癌组织中DAPK mRNA及蛋白表达的影响.方法 采用逆转录(RT)-PCR法检测62例原发性胃癌及癌旁组织DAPK mRNA表达,甲基化特异性PCR(MSP)法检测DAPK启动子区CpG岛甲基化状态,对其中34例胃癌组织甲基化阳性者的DAPK蛋白表达进行Western印迹法检测.结果 胃癌组织中DAPKmRNA和蛋白表达水平明显低于癌旁组织,分别为0.2863±0.2027比0.5736±0.1968、0.2616±0.0913比0.6529±0.1808,差异均有统计学意义(P值均＜0.01).DAPK在胃癌组织和癌旁组织中的甲基化频率分别为54.8%和17.7%,差异有统计学意义(P＜0.01).在胃癌组织中,甲基化组DAPKmRNA表达明显低于非甲基化组(0.1399±0.0835比0.4640±0.1569,P＜0.01).DAPK基因甲基化与胃癌TNM分期显著相关(P=0.04).结论 原发性胃癌组织DAPK mRNA和蛋白表达缺失或低下与其启动子甲基化程度增高显著相关.     

乳头状甲状腺癌抑癌基因TSHR、P16和RAS启动子甲基化研究

目的 研究促甲状腺激素受体(TSHR)、P16和RAS 3个抑癌基因在乳头状甲状腺癌的表达,分析其启动子甲基化与肿瘤发生的关系.方法 对50例乳头状甲状腺癌组织和32例对照组织(20例结节性甲状腺肿,12例甲状腺腺瘤)提取RNA后,以RT-PCR检测3个抑癌基因mRNA的表达情况,采用甲基化PCR(MSP)检测上述组织中3个抑癌基因启动子区甲基化的情况,并对3个抑癌基因甲基化和未甲基化的组织随机进行测序.结果 50例乳头状甲状腺癌组织中,有34例(68.0%)TSHR基因、27例(54.0%)P16基因、30例(60.0%)RAS基因启动子发生了甲基化;32例对照组织中,有7例(21.9%)TSHR基因、5例(15.6%)P16基因、10例(31.3%)RAS基因启动子发生了甲基化;乳头状甲状腺癌组TSHR、P16、RAS基因启动子甲基化率均显著高于对照组(均P<0.05).TSHR、P16和RAS mRNA在乳头状甲状腺癌中的表达量明显低于对照组织(0.41±0.11对0.63±0.08,0.51±0.17对0.72±0.22,0.56±0.10对0.67±0.16,均P<0.05).经DNA测序证实,3个抑癌基因启动子发生甲基化的其CpG岛碱基未发生改变,仍为CG;未发生甲基化的碱基由CG变为TG.结论 3个抑癌基因启动子甲基化与乳头状甲状腺癌的发生和发展均相关.     

肿瘤抑制基因p16在胰腺腺癌细胞系中因纯合性缺失而失表达

目的：检测肿瘤抑制基因p16在胰腺腺癌细胞系中的基因改变和在mRNA以及蛋白质水平的表达。方法：使用PCR方法检测基因的缺失情况；使用单链构象多态性（SSCP）方法检测基因有无突变；使用甲基化特异性PCR（MSP）方法检测基因启动子区域的甲基化状态；使用RT－PCR方法检测基因在mRNA水平的表达；使用免疫细胞化学染色和Western blot方法检测基因在蛋白质水平的表达。结果：被检测的6个胰腺腺癌细胞系中，有3个细胞系存在p16基因的纯合性缺失，这3个细胞系在mRNA水平和蛋白质水平均无p16基因的表达。在全部6个细胞系中没有发现p16基因突变和启动子区域的过甲基化。结论：在被检测的6个胰腺腺癌细胞系中，纯合性缺失是造成p16基因失表达的原因。     

巢式MSP法检测胃癌患者血浆p16、MGMT基因甲基化

目的:探讨胃癌患者血p16和MGMT基因启动子区甲基化状态.方法:采用巢式甲基化特异性PCR法(nestedmethylation-specific PCR,nMSP)对6例胃癌患者血浆中p16和MGMT基因启动子区甲基化状态进行研究.同时以16例健康体检作为对照.结果:在受检的69例胃癌患者中,p15、MGMT基因启动子区甲基化率分别为30.4%(21/69)、17.4%(12/69).对照组未见p16、MGMT基因启动子区甲基化.胃癌患者血浆中存在p16和MGMT基因启动子区甲基化,其中p16基因启动子区甲基化与对照组相比差异显著,具有统计学意义.结论:检测血浆循环DNA中p16、MGMT基因启动子区的甲基化状态,可为胃癌的早期分子诊断提供了有用信息.     

肺癌组织p16基因启动子区甲基化的研究

DNA甲基化可以引起染色体结构、DNA构型和稳定性及DNA与蛋白质分子相互作用方式的改变，从而控制基因表达。研究发现，基因缺失和启动子区异常甲基化是p16基因失活的主要原因。我们联合应用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation specific PCR，MSPCR)、逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫组化方法检测肺癌组织中p16基因的异常改变，以了解p16基因在肺癌发生发展中的作用。     

燃煤型砷中毒患者p16基因缺失及启动区CpG岛甲基化的观察

目的检测燃煤型砷中毒(地砷病)患者p16基因缺失及启动区甲基化的变异,探讨p16基因异常改变在地砷病发生发展乃至癌变过程中的作用。方法采用多重PCR法对103例砷中毒患者和110例正常对照人群p16基因第1、第2外显子缺失情况进行检测;同时采用甲基化特异性PCR法(MSP)和PCR产物测序技术对95例砷中毒患者和100例正常对照人群p16基因启动区甲基化情况进行分析。结果(1)正常对照组p16基因缺失率为5．45％;病例组为14．56％,以第2外显子缺失为主,其中轻、中、重度中毒组p16基因缺失率分别为9．09％、12．50％和19．51％;非癌变组和癌变组p16基因缺失率分别为8．70％和38．89％。以上差异有统计学意义(P<0．05或P<0．01)。(2)对照组p16基因甲基化阳性率为2．00％;病例组为42．11％,其中轻、中、重度中毒组p16基因甲基化阳性率分别为26．32％、41．67％和50．00％;非癌变组和癌变组阳性率分别为21．74％和55．56％。以上差异均有统计学意义(P<0．05或P<0．01)。结论p16基因缺失及启动区甲基化在地砷病的发生发展乃至癌变过程中起重要作用。     

Detection of RASSF1A promoter hypermethylation in serum from gastric and colorectal adenocarcinoma patients

AIM：To evaluate the diagnostic role of serum RASSF1A promoter hypermethylation in gastric and colorectal adenocarcinoma.
METHODS：Methylation-specific polymerase chain reaction （MSPCR） was used to examine the promoter methylation status of the serum RASSF1A gene in 47 gastric adenocarcinoma patients, 45 colorectal adenocarcinoma patients, 60 patients with benign gastrointestinal disease （30 with benign gastric disease and 30 with benign colorectal disease）, and 30 healthy donor controls. Apaired study of RASSF1A promoter methylation status in primary tumor, adjacent normal tissue, and postopertive serum were conducted in 25 gastric and colorectal adenocarcinoma patients who later were underwent surgical therapy.
RESULTS：The frequencies of detection of serum RASSF1A promoter hypermethylation in gastric （34.0%） and colorectal （28.9%） adenocarcinoma patients were significantly higher than those in patients with benign gastric （3.3%） or colorectal （6.7%） disease or in healthy donors （0%） （P 〈 0.01）. The methylation status of RASSF1A promoter in serum samples was consistent with that in paired primary tumors, and the MSPCR results for RASSF1A promoter methylation status in paired preoperative samples were consistent with those in postoperative serum samples. The serum RASSF1A promoter hypermethylation did not correlate with patient sex, age, tumor differentiation grade, surgical therapy, or serum carcinoembryonic antigen level. Although the serum RASSF1A promoter hypermethylation frequency tended to be higher in patients with distant metastases, there was no correlation between methylation status and metastasis.
CONCLUSION：Aberrant CpG island methylation within the promoter region of RASSF1A is a promising biomarker for gastric and colorectal cancer.     

Detection of RASSF1A promoter hypermethylation in serum from gastric and colorectal adenocarcinoma patients

AIM: To evaluate the diagnostic role of serum RASSF1A promoter hypermethylation in gastric and colorectal adenocarcinoma.METHODS: Methylation-specific polymerase chain reaction (MSPCR) was used to examine the promoter methylation status of the serum RASSF1A gene in 47 gastric adenocarcinoma patients, 45 colorectal adenocarcinoma patients, 60 patients with benign gastrointestinal disease (30 with benign gastric disease and 30 with benign colorectal disease), and 30 healthy donor controls. A paired study of RASSF1A promoter methylation status in primary tumor, adjacent normal tissue, and postoperative serum were conducted in 25 gastric and colorectal adenocarcinoma patients who later were underwent surgical therapy.RESULTS: The frequencies of detection of serum RASSF1A promoter hypermethylation in gastric (34.0%)and colorectal (28.9%) adenocarcinoma patients were significantly higher than those in patients with benign gastric (3.3%) or colorectal (6.7%) disease or in healthy donors (0%) (P ＜ 0.01). The methylation status of RASSF1A promoter in serum samples was consistent with that in paired primary tumors, and the MSPCR results for RASSF1A promoter methylation status in paired preoperative samples were consistent with those in postoperative serum samples. The serum RASSF1A promoter hypermethylation did not correlate with patient sex, age, tumor differentiation grade, surgical therapy,or serum carcinoembryonic antigen level. Although the serum RASSF1A promoter hypermethylation frequency tended to be higher in patients with distant metastases,there was no correlation between methylation status and metastasis.CONCLUSION: Aberrant CpG island methylation within the promoter region of RASSF1A is a promising biomarker for gastric and colorectal cancer.     

IRX1在胰腺癌中的表达及其启动子区甲基化状态

目的 检测胰腺癌的易洛魁族同源盒基因(IRX1)的表达及其启动子区的甲基化状态,探讨两者间的相关性.方法 采用实时PCR法检测12例胰腺癌组织及6株胰腺癌细胞株的IRX1 mRNA 表达.基因序列分析IRX1基因启动子区结构.应用甲基化抑制剂5-氮杂-2＇-脱氧胞苷(5-Aza-dC)处理胰腺癌细胞,采用甲基化特异性PCR(MSP)、非甲基化特异性PCR (USP)及实时PCR检测处理前后IRX1启动子甲基化状态和IRX1 mRNA表达.结果 胰腺癌组织IRX1 mRNA的表达量为0.31±0.11,显著低于癌旁正常胰腺组织的1.05±0.32(P ＜0.01).胰腺癌细胞AsPCl、BxPC3、Capan-2、PANC1、PaTu8988和SW1990的IRX1 mRNA表达量分别为0.36±0.08、0.34±0.16、0.37±0.11、0.25±0.06、0.31±0.04、0.36±0.02,均显著低于人肾上皮293细胞的1.03±0.28(P＜0.05或＜0.01).IRX1基因启动子区富含CpG岛.各胰腺癌细胞株IRX1基因启动子CpG岛对应位点均有甲基化,经5-Aza-dC处理后甲基化状态得以逆转,IRX mRNA的表达也得以恢复.结论 胰腺癌的IRX1 mRNA表达下降,与其IRX1基因启动子区CpG岛高甲基化状态相关.     

Silencing of the VHL tumor-suppressor gene by DNA methylation in renal carcinoma.

Mutational inactivation and allelic loss of the von Hippel-Lindau (VHL) gene appear to be causal events for the majority of spontaneous clear-cell renal carcinomas. We now show that hypermethylation of a normally unmethylated CpG island in the 5' region provides another potentially important mechanism for inactivation of the VHL gene in a significant portion of these cancers. This hypermethylation was found in 5 of 26 (19%) tumors examined. Four of these had lost one copy of VHL while one retained two heavily methylated alleles. Four of the tumors with VHL hypermethylation had no detectable mutations, whereas one had a missense mutation in addition to hypermethylation of the single retained allele. As would be predicted for the consequence of methylation in this 5' CpG island, none of the 5 tumors expressed the VHL gene. In contrast, normal kidney and all tumors examined with inactivating VHL gene mutations but no CpG island methylation had expression. In a renal cell culture line, treatment with 5-aza-2'-deoxycytidine resulted in reexpression of the VHL gene. These findings suggest that aberrant methylation of CpG islands may participate in the tumor-suppressor gene inactivations which initiate or cause progression of common human cancers.     

hMLH1基因高甲基化在胃癌发生、发展中的作用

基因启动子区CpG岛甲基化使许多基因失活，从而导致恶性肿瘤的发生和发展。目的：检测hMLHl基因启动子区CpG岛甲基化水平，探讨其胃癌发生、发展中的作用。方法：以甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）检测41例胃癌、40例癌前病变和38例对照组织中hMLHl基因启动子区CpG岛甲基化状态，并分析其与胃癌患者临床病理特征的关系。结果：胃癌组织中hMLHl基因启动子区CpG岛甲基化阳性率为34．1％，显著高于癌前病变组的5．0％和对照组的0％（P〈0．05）。hMLHl基因甲基化阳性率与胃癌患者的年龄和肿瘤浸润深度有关（阳性率分别为46．4％对7．7％和55．0％对14.3％，P〈0．05），与性别、肿瘤分化程度和淋巴结转移无关（阳性率分别为34．8％对33．3％、28．0％对43．8％和38．1％对30．0％）。结论：胃癌组织中存在hMLHl基因启动子区CpG岛高甲基化，可能与胃癌的发生、发展有关．且可能在老年胃癌患者的肿瘤发生过程中起重要作用。