新生大鼠心肌细胞培养方法的改进

目的:建立便捷,成熟的新生大鼠心肌细胞体外培养方法。方法:本实验对常用的培养方法加以改进,采用胰蛋白酶及Ⅰ型、Ⅱ型胶原酶共同消化法,分离新生大鼠心肌细胞,并对体外培养的心肌细胞的存活率、活力及纯度进行鉴定。结果:分离的心肌细胞存活率为96%,培养3 d后有60%~80%的细胞开始搏动,搏动频率平均50次/min,心肌细胞纯度在75%以上。结论:本实验建立的新生大鼠心肌细胞体外培养方法是成熟,可靠的。     

新生大鼠心肌细胞的原代培养及鉴定

目的：探讨新生大鼠心肌细胞原代培养的方法,培养存活率高和纯度高的心肌细胞。方法：无菌条件下取出出生1~2 d的SD大鼠心脏,用2.5 g/L胰蛋白酶和 2.0 g/L Ⅱ型胶原酶等量混合液在37℃条件下分次消化心肌组织。以差速贴壁并将时间延长至90 min纯化心肌细胞,48 h后换液。结果： 将心肌细胞24 h贴壁生长,于2~3 d心肌细胞伸出伪足,形成细胞簇,同步搏动,频率约80~130次/min,存活率为（93.9±2.8）%,纯度为（91.9±2.2）%。结论：以本实验的方法培养的心肌细胞存活率高、纯度高,是一种较为理想的原代心肌细胞培养方法。     

新生SD大鼠心肌细胞培养方法的简化及改良

目的改良简化心肌细胞培养的条件和方法,培养纯度高、存活时间长的新生SD大鼠的心肌细胞。方法采用含牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）的Ⅱ型胶原酶单次消化心肌、差速贴壁1 h纯化心肌细胞进行培养,全过程在37℃条件下进行。于培养5、10、15、20、25、30 d时,用台盼蓝染色法检测细胞的存活率,并在生物倒置显微镜下观察形态学变化。取培养48 h的细胞,用免疫组织化学染色的方法检测心肌细胞的纯度。结果心肌组织在6 h时基本消化完全。培养5、10、15、20、25、30 d时,用台盼蓝染色法检测心肌细胞的存活率均大于95%,培养30 d时仍为95.2%。在生物倒置显微镜下观察,培养24 h左右的细胞之间形成交联并有细胞搏动。培养48h的细胞经免疫组织化学染色法测定,心肌细胞的纯度为（97.1±1.9）%。结论应用改良并简化的心肌细胞培养方法和培养条件,可得到纯度和存活率均高能满足大多数科研要求的原代乳鼠心肌细胞。     

新生大鼠右心室心肌细胞的原代培养及鉴定

目的:建立一种简便、重复性好的新生大鼠右心室心肌细胞原代培养方法,为右心疾病及肺循环右心相关研究提供可靠的细胞工具。方法:采用出生1～3 d无特定病原体级,SD新生大鼠12只,无菌操作开胸取心脏后,在体视显微镜下分离右心室,用胰蛋白酶与Ⅱ型胶原酶联合消化法消化右心室心肌组织,差速贴壁法纯化右心室心肌细胞。用0.4%台盼蓝染色检测右心室心肌细胞存活率,在倒置显微镜下观察右心室心肌细胞的生长特点并记录细胞搏动频率。利用cTnT对右心室心肌细胞进行免疫荧光染色鉴定细胞纯度。结果:采用胰蛋白酶及Ⅱ型胶原酶联合消化右心室心肌组织及差速贴壁法分离所得右心室心肌细胞存活率为(94.96±2.13)%。培养的心肌细胞24 h大部分贴壁并伸出伪足,少数细胞出现自发性搏动;48 h后细胞基本全部贴壁,伪足延长,出现局部同步化搏动;72 h后细胞伪足继续延长并形成细胞簇,搏动基本同步化;96 h后细胞连接成片,呈现完全同步化搏动,搏动频率为(121.2±10.7)次/min。用cTnT染色培养的细胞纯度达(96.71±2.66)%。结论:体视显微镜下分离右心室结合复合酶消化法能成功培养出纯度高、功能较好的新生SD大鼠右心室心肌细胞。     

乳鼠心肌细胞原代培养方法的改进

目的 对乳鼠的心肌细胞进行原代培养方法的改进.方法 参照乳鼠心肌细胞原代培养方法,并进行改进,选用混合消化酶(0.08%胰蛋白酶 0.04%～0.06% Ⅱ型胶原酶等量加入的混合液)及DF培养液进行消化和培养,减少了对心肌细胞的损伤,差速贴壁分离纯化后,加入5-溴-α-脱氧尿嘧啶抑制成纤维细胞分裂增殖.结果 本方法培养的心肌细胞存活率为95.7%,培养2～5 d,视野中绝大多数为已搏动的心肌细胞和心肌细胞团,成纤维细胞无明显增殖.结论 本方法是一种较为理想的乳鼠心肌细胞原代培养方法.     

牛磺酸对大鼠培养心肌细胞钙转运功能的作用

以大鼠培养心肌细胞的脂质过氧化损伤模型，采用４５Ｃａ示踪技术，直接进行心肌肌浆网、线粒体钙转运功能的测定，同时观察牛磺酸对心肌过氧化损伤的保护作用。结果表明，牛磺酸能显著改善心肌肌浆网、线粒体钙转运功能，对心肌细胞具有保护作用     

新生自发性高血压大鼠心肌细胞与成纤维细胞的相互作用

为研究自发性高血压大鼠心肌细胞与成纤维细胞在体外培养下的相互作用。收集上述细胞的24h培养上清液作为这两种细胞的条件培养基，观察血管紧张素Ⅱ 1型受体拮抗剂洛沙坦或酪氨酸蛋白抑制剂金雀异黄素对细胞^3H-TdR和^3H-Leu掺入率的影响。结果发现，心肌成纤维细胞培养基可明显促进这两种细胞的生长，该作用不能被洛沙坦抑制，而可被金雀异黄素抑制。心肌细胞培养基无促进这两种细胞生长作用。结果提示，成纤维细胞可能分泌经酪氨酸蛋白激酶介导的促生长因子，调控心肌细胞和心肌成纤维细胞的生长。     

乳鼠心肌细胞的原代培养

目的 :观察原代培养的乳鼠心肌细胞的形态学特征。方法 :使用 型胶原酶、胰蛋白酶和 DNase 消化心脏组织 ,差速贴壁分离法和化学试剂抑制法纯化心肌细胞。结果 :第 1天心肌细胞几乎全部贴壁 ,少数细胞出现自发性搏动 ;第 3天形成细胞簇或细胞单层 ,收缩明显而有力 ;透射电镜可见肌小节、Z线、闰盘 ;良好的形态和活力可维持2 0 d。结论 :使用 型胶原酶、胰蛋白酶和 DNase 分离培养心肌细胞可获得形态、活力良好的心肌细胞 ,该方法值得进一步推广。     

新生SD大鼠心房肌细胞的原代培养及改良

目的：探讨新生SD大鼠心房肌细胞的原代培养及鉴定,并对其中部分步骤进行改良。方法：采用出生1～3 d的SD乳鼠,运用“两步法”提取心房肌细胞,利用心房肌细胞与成纤维细胞贴壁时间不同和Brd U能抑制成纤维细胞繁殖进行心房肌细胞纯化,并运用双色免疫荧光进行鉴定。结果：36 h后镜下可见细胞已经贴壁,并可见少数细胞出现自发搏动,72 h后细胞铺满瓶底90%,经双色免疫荧光鉴定超过95%为心房肌细胞。结论：“两步法”可缩短胰酶消化时间,Ⅱ型胶原酶+BSA联合消化可以更有效地培养出原代心房肌细胞。     

机械法分离培养新生大鼠脊髓神经干细胞

目的 探讨新生大鼠脊髓源性神经干细胞的分离培养方法。方法 采用机械法及无血清培养技术从新生24h的SD大鼠脊髓中分离出脊髓源性神经干细胞,并采用免疫细胞化学方法鉴定神经干细胞和分化情况。结果 分离的细胞生长旺盛,单克隆化生成的细胞团,分离培养获得的细胞团呈Nestin强阳性,经胎牛血清诱导后可分化成为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论 利用机械法成功分离培养了新生大鼠脊髓神经干细胞,该细胞可连续传代,具备多向分化潜能。     

成人肾脏足细胞的原代培养和鉴定

目的建立一种重复性好、操作简便的成人肾脏足细胞原代培养方法。方法取肾脏肿瘤手术切除后远离患病部位的正常肾脏组织，分离出肾皮质，剪碎研磨并通过差异过筛法分别通过80目（孔径220μm）、40目（450μm）、120目（125μm）细胞筛网，收集120目筛网上肾小球利用植块法进行接种，将接种培养面向上放置，4h后添加培养液并将培养瓶翻转过来正常放置培养箱内孵育。采用形态学观察和细胞间接免疫荧光染色法，对去氧肾上腺素、第八因子（F8）蛋白、波形蛋白、角蛋白和肾母细胞瘤蛋白（WT-1）进行鉴定；并用流式细胞仪分析足细胞纯度。结果接种3d后可见绝大部分肾小球贴壁；5d后几乎全部肾小球贴壁，少许肾小球周围有细胞爬出，体积中等，呈多边形，无突起伸出；7～10d可见所有肾小球周围大量多边形细胞爬出，细胞迅速生长至融合状态，呈铺路石样外观，符合去分化状态足细胞特征；此时胰蛋白酶差异消化去除成纤维细胞传代培养。消化传代后的足细胞胞体、胞核逐渐增大，自细胞体伸出明显树枝状突起，常见双核，符合分化状态足细胞特征。免疫荧光染色发现传代7d后细胞表达足细胞特异性蛋白WT-1、去氧肾上腺素，不表达F8蛋白、波形蛋白、角蛋白，排除内皮细胞、系膜细胞和壁层上皮细胞污染。流式细胞仪分析足细胞纯度为98．3％。结论应用差异过筛法分离人肾小球，并结合植块法进行接种可促进肾小球贴壁，简便、高效地培养出原代足细胞。     

组织贴块法人的支气管上皮细胞的原代培养

目的 通过组织贴块法建立人的支气管上皮细胞原代培养的方法.方法 采用无血清支气管上皮培养基,对经手术切除获得的支气管进行组织贴块法培养获得的细胞进行原代培养和传代,通过倒置显微镜以及细胞免疫化学观察和鉴定细胞.结果 此方法获得的细胞成活率高、纯度高,细胞呈扁平、多边形,象铺路的鹅卵石样分布.细胞角蛋白表达阳性.结论 组织贴块法是一种简便、有效的培养人的支气管上皮细胞的方法,无血清培养基可提供满意的生长条件,提高上皮细胞的纯度,为进一步研究不同的呼吸系统疾病提供了良好的模型.     

人肝细胞的微载体培养及其意义

目的：探讨大量培养高活性人肝细胞的理想方法，为肝脏病研究提供良好的细胞材料。方法：在限制贴壁、定时振荡条件下，采用载体ｃｙｔｏｄｅｘ３为材料进行人肝细胞的微载体培养。结果：预先将体外两步灌流分离的人肝细胞振荡３０分钟后，肝细胞易与微载体相粘附．在被覆聚羟乙基异丁烯酸的培养瓶中继续间歇性振荡２４小时，约７０％的肝细胞附着于微载体之上。在使用激素限定条件培养液培养的１５天内，肝细胞保持蛋白分泌功能和多细胞粘附聚集球形体形态特征。结论：本法培养人肝细胞具有细胞数量多、密度大和活性好的特点，适宜于体外生物人工肝支持系统、肝细胞移植以及培养肝细胞因子的提取。     

大鼠小脑颗粒神经元体外原代培养

目的 体外原代培养大鼠小脑颗粒神经元,为研究慢性砷暴露对小脑神经元的毒性作用提供实验方法.方法 取生后5～7天Wistar仔鼠,体式显微镜下分离小脑皮层,0.25％胰蛋白酶消化、DNA Ⅰ酶洗涤制成单细胞悬液,两次差速贴壁后接种在多聚赖氨酸包被的培养板内,相差镜下观察大鼠小脑颗粒神经元成长、发育变化及突触形成.采用神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫荧光技术鉴定神经元.结果 培养后第24小时,相差显微镜下可见大鼠小脑颗粒神经元贴壁,呈网状排列;第2～3天,神经元胞体由椭圆形变成圆形,轮廓逐渐清晰,细胞伸出突起,突起逐渐延长,细胞间通过突起连接,形成了稀疏的神经元突触网络;第4～6天,细胞体积进一步增大,细胞间通过广泛的突触联系,神经元清晰饱满,形成了复杂的神经元网络.共聚焦显微镜下,可见大量含NSE的神经元.结论 成功地进行了大鼠小脑颗粒神经元的原代培养,该方法可为今后研究慢性砷暴露对小脑细胞的毒性作用提供实验依据.     

SD大鼠心肌细胞分离方法探索

目的:探索一种稳定、简单、成功率高的,分离成年SD大鼠心肌细胞的方法。方法:采用Langendorff灌流法及二步酶解法获取单个心肌细胞,并与四步法进行比较。结果:二步法可获得横纹清晰、立体感强的单个心肌细胞,初步存活率(79.1±2.9)%,复钙后存活率(46.8±2.8)%,分别显著高于四步法的[(75.2±4.2)%,(40.2±2.2)%,P均0.05]。与四步法相比,二步法酶解所需时间和平均试验成本明显减少[(40.2±3.3)min:(30.1±3.4)min,(115.2±5.7)元:(100.6±7.6)元,P均0.05]。结论:该法快捷、简单、经济、重复性好,为心肌细胞的电生理研究打下良好基础。     

骨髓基质细胞不同培养方法效果比较

目的：观察全骨髓培养法与密度梯度离心法对培养骨髓基质细胞的效果差异,建立简单、经济、实用分离骨髓间充质干细胞方法。方法：体外提取骨髓基质细胞,分别采用全骨髓培养法与密度梯度离心法培养骨髓基质细胞,观察细胞形态学、细胞活力、细胞周期及细胞表面分子表达差异。结果：两种方法均能有效培养出骨髓间充质干细胞,各细胞周期的细胞检出率无显著差异（P〉0．05）,细胞形态学无差异,细胞表面分子CD34、SH1、SH2、SH3表达差异不显著（P〉0．05）。结论：全骨髓培养法在分离培养骨髓基质细胞方面与密度梯度离心法具有类似效果。     

乳鼠窦房结细胞的原代培养和形态学特征

目的比较差速贴壁技术和常规培养方法在体外获取窦房结自律细胞的密度,并观察其形态学特征。旨在建立可靠的窦房结自律细胞体外取材分离、纯化培养及形态学鉴定。方法取24 h内新生Wistar乳鼠1 20只,随机分为实验组(差速贴壁技术培养方法)和对照组(常规培养方法),每组60只。每次随机各取5只乳鼠行窦房结取材,分别用2种方法进行原代细胞纯化培养。通过光、电镜观察比较2种方法体外窦房结自律细胞的密度比及形态学特征。结果体外培养窦房结细胞有3种不同形态,梭形细胞、三角形细胞和不规则形细胞,其中梭形细胞最多,搏动频率最快;三角形细胞与心房肌三角形细胞特征相似;实验组窦房结梭形细胞比例明显高于对照组[(65±4)%vs(45±3)%,P<0.01]。结论采用差速贴壁技术纯化培养方法较常规培养可更明显提高窦房结梭形细胞的比例,是一种可靠的窦房结自律细胞培养、纯化技术。在培养的乳鼠窦房结细胞中,细胞体积小、搏动频率快的梭形细胞即是窦房结的起搏细胞。     

微电极阵芯片技术在整体心脏、心肌组织片和培养心肌中的应用研究

目的 探讨微电极阵芯片技术(mieroelectrode arrays,MEA)在整体心脏、心肌组织片和培养心肌电活动的应用.方法 用MEA技术记录豚鼠整体心脏、SD大鼠心脏组织片和小鼠乳鼠心脏培养心肌的组织场电位变化规律.结果 (1)豚鼠整体心脏灌流30～90 min,记录到稳定的自主节律(120±90)次/min;心室和心房肌的场电位时程为(210±78)ms和(164±58)ms,房室传导时间为(320±150)ms.(2)SD大鼠心脏组织片兴奋性可以保持2 h,心室和心房组织的场电位时程为(115.80±11.61)ms和(83.71±6.48)ms.(3)小鼠乳鼠心脏原代培养自发搏动频率为(150±100)次/min,培养2～72 h,记录到同步的多位点场电位,并能随刺激频率同步显示场电位变化.结论 MEA技术是一个敏感、低噪音和长时间稳定的记录整体动物心脏、心脏靶点取样组织和培养心肌细胞的场电位、细胞间电活动传导和激动起源规律的研究工具.