皮下注射胰岛素抑制胰岛β细胞凋亡预防NOD鼠糖尿病

目的：观察皮下注射胰岛素免疫干预对非肥胖糖尿病（non-obese diabetic,NOD）鼠胰岛炎、B细胞凋亡和糖尿病的影响,并探讨其诱导免疫耐受的机制。方法：60只NOD雌鼠随机分为胰岛素处理组（n=34）和磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline,PBS）对照组（n=28）,分别于4周、12周、20周、28周皮下注射中效胰岛素优泌林N（Humulin N）6U（60μL）＋不完全弗氏佐剂（incomplete Freund＇s adjuvant,IFA）60μL,对照组予PBS（60μL）＋IFA（60μL）。于12周龄观察胰岛炎和胰岛B细胞凋亡;检测胰岛Fas和FasL的表达;测定血清IL-4和IFN-γ浓度,以及胰岛内I-Aβ^x7,IL-1β,IFN-γ,Fas,IL-4 mRNA的表达水平。结果：NOD鼠皮下注射胰岛素加IFA组30周龄和52周龄时发病率仅为21．4％和28．6％,而皮下PBS加IFA组为71．4％和85．7％（P〈0．05）。胰岛素组胰岛炎积分比对照组低,但差异无统计学意义（P〉0．05）。胰岛素组胰岛Fas抗原表达和B细胞凋亡率均比PBS对照组低（均P〈0．05）。胰岛素组胰岛内I-Aβ^x7,IFN-γ,IL-1β,FasmRNA表达较PBS对照组低（均P〈0．05）,而IL-4mRNA表达较对照组高（P〈0．05）;胰岛素组血清IL-4比PBS组高,IFN-γ比PBS组低（均P〈0．05）。结论：皮下注射胰岛素能诱导NOD鼠的免疫耐受而预防糖尿病的发生,但不能阻断胰岛炎的进展。皮下注射胰岛素能诱导调节性T细胞产生,使全身和胰岛局部T细胞由,Th1向Th2转型,从而抑制Fas介导的B细胞凋亡而预防糖尿病。     

吡格列酮对炎性因子所致胰岛细胞凋亡的保护作用

目的：探讨Ppar-γ激动剂吡格列酮（PGZ）对炎性因子所诱导的胰岛细胞凋亡的保护作用，初步研究其作用机制。方法：Western—blotting检测NIT-1细胞的Ppar-γ受体蛋白表达；联合IL-1β及IFN-γ作用于体外培养的胰岛细胞株NIT-1，建立胰岛细胞炎症模型，观察（IL-1β＋IFN-γ）与PGZ预孵育NIT-1细胞的凋亡；MTT法、流式细胞术检测细胞生长抑制率及凋亡率，比色法检测凋亡细胞caspase-3比活性。结果：NIT-1细胞表达Ppat-γ蛋白；（IL—1β＋IFN-γ）组作用24h对NIT-1细胞生长抑制率、凋亡率、caspase-3比活性分别为49．8％、28．0％、3．5，对照组3项指标分别为0％、4．3％、1，两组比较均有十分显著差异（P〈0．01）；PGZ组3项指标分别为2．7％、7．1％、1.3，与对照组比较，均无明显差异（P〉0．05）；（PGZ＋IL-1β＋IFN-γ）组的3项指标分别为18．6％、14．8％、1．5，与（IL-1β＋IFN-γ）组比较均有差异（P〈0．05），与对照组比较分别为P〉0．05，P〈0．05，P〈0．05。结论：NIT-1细胞表达Ppar-γ受体蛋白；联合IL—1β及IFN-γ明显诱导NIT-1细胞凋亡，PGZ显著抑制IL-1β及IFN-γ诱导的NIT-1细胞凋亡，其机制与降低caspase-3活性有关。     

谷氨酸脱羧酶抗体和血、尿C肽在糖尿病中的临床应用

目的：探讨谷氨酸脱羧酶抗体（GAD—Ab）和血、尿C肽是判断糖尿病患者胰岛B细胞功能和早期诊断1型糖尿病及成人隐匿性自身免疫性糖尿病（LADA）的重要临床指标。方法：采用酶联免疫法检测和观察126例糖尿病和28例正常人GAD—Ab水平和血糖、HbA1c、C肽水平及临床资料。结果：LADA患者除GAD—Ab阳性外，还有①发病年龄范围宽（25～73岁）；②消瘦或低体重；③空腹C肽值较低，胰岛素使用剂量较T2DM所用剂量大；④酮症酸中毒发生率较高。T1DM及LADA患者24h尿C肽、空腹和餐后各时相血C肽水平含量明显低于正常组（P〈0．01），峰值不明显，呈低平曲线；T1DM组C肽浓度降低比LADA更明显（P〈0．01）；T2DM患者空腹血C肽和24h尿C肽浓度略高于正常人，但反应缓慢，下降也缓慢。结论：GAD—Ab是诊断T1DM患者的胰岛B细胞自身抗体的免疫学指标，血、尿C肽是判断糖尿病患者的胰岛B细胞功能，二者联合检测有助于糖尿病的诊断分型了解胰岛B细胞功能，指导治疗和判断预后都有重要的临床意义。     

妊娠糖尿病患者GAD—Ab和ICA测定的临床意义

目的探讨谷氨酸脱羧酶抗体（GAD—Ab）、胰岛细胞抗体（ICA）在妊娠糖尿病（GDM）患者中的临床意义。方法选取GDM孕妇68例（GDM组）和糖耐量正常孕妇40例作对照组（NGT组）,检测GAD—Ab、ICA和胰岛素水平,以稳态模型HOMA—IR计算胰岛素抵抗指数及HBCI计算胰岛B细胞功能指数。结果68例GDM组中40．0％患者有一种以上抗体阳性,其中26．0％患者GAD—Ab阳性,24．0％患者ICA阳性,10．0％患者两种抗体均为阳性,与NGT组比较有统计学差异（P〈0．05-0．01）;胰岛自身抗体阳性的GDM孕妇空腹胰岛素（Fins）、HOMA—IR和HBCI均低于抗体阴性组,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论GDM孕妇中存在亚临床状态的1型糖尿病患者,胰岛自身抗体阳性是胰岛β细胞功能损伤的一个预测指标,也是GDM孕妇产后发展为1型糖尿病的一个重要预测因素。     

GAD对NOD小鼠β细胞淋巴细胞性炎症的防护作用

目的：了解GAD对NOD小鼠的1型糖尿病是否具有预防作用并探讨其免疫作用机制。方法：用猪脑GAD50μg和不完全全弗氏佐剂（FIA）50μl混合后给4周龄雌性NOD小鼠腹腔注射（ip)(n=32),同时单独注射等量FIA作为对照组（n=19),8周龄时环磷酰胺（CY）250mg/kg ip以加速糖尿病。每周测定体重、血糖20周龄处死小鼠后测定血清C－肽、观察胰腺病理和超微结构变化。结果：20周龄时，FIA对照组的糖尿病总发病率为73．58％，而GAD组仅有6．25％小鼠发生糖尿病（P＜0．01），发病时间也明显延缓，GAD组的胰岛炎症分数较FIA组明显降低，且炎症程度减轻（P＜0．05）；GAD组的C-p水平也明显高于对照组（P＜0．05）；FIA组残存胰岛的β细胞数目稀少，有核膜和内浆网扩张、核糖体脱颗粒、分泌颗粒空泡样变等超微结构异常，而GAD组胰岛β细胞数显著多于对照组（P＜0．05），且无上述超微异常。结论：独脑GAD可预防NOD小鼠胰岛炎发生，且有保护其岛β细胞超微结构的作用。     

y-氨基丁酸对炎性因子致胰岛细胞凋亡的保护作用

【目的】探讨1-氨基丁酸（gamma-aminobutyricacid,GABA）对炎性因子所诱导的胰岛细胞凋亡的保护作用,初步研究其作用机制。【方法】将胶原酶v：通过总胆管灌注到大鼠内,分离纯化大鼠胰岛细胞,并通过DTZ染色鉴定胰岛纯度。将新鲜分离的胰岛分为3组：正常对照组、通过白介素-1B（IL-1B）-y干扰素（IFN-7）建立胰岛细胞炎症模型（IL-1β＋IFN-1诱导组）、GABA干预组（GABA＋IL-1β＋IFN-1）。观察（IL-1β＋IFN-1）与GABA预孵育胰岛细胞的凋亡;二醋酸酯荧光素,碘化丙啶染色、流式细胞术及糖刺激实验检测胰岛细胞活性。凋亡率和功能,免疫荧光检测凋亡细胞Caspase-3蛋白表达。【结果】（IL-18＋IFN-7）组作用24h对胰岛细胞活性、凋亡率和糖刺激指数分别为20％、（32．7±5.3）％和（1．62±0．13）,对照组3项指标分别为90％、（5．5±2．8）％和（2．37±0．11）,两组比较差异显著（P〈0．01）;（GABA＋IL-1β＋IFN-y）组3项指标分别为70％、（18．0±6．3）％和（1．97±0．12）,与（IL-1β＋IFN-1）组比较,均有明显差异（P〈0．01）。（IL-1β＋IFN-1）组胰岛的Caspase-3蛋白表达明显增加,而（GABA＋IL-1β＋IFN-1）组胰岛的Caspase-3蛋白表达明显受到抑制。【结论】联合IL-1β及IFN-y明显诱导胰岛细胞凋亡,GABA显著抑制IL-1β及IFN-1诱导的胰岛细胞凋亡,其机制可能与降低Caspase-3蛋白的表达有关。     

IL-2和IL-7对优化检测1型糖尿病患者谷氨酸脱羧酶65 特异性T细胞反应的比较

目的：探讨何种细胞因子(IL-2或IL-7)及其最佳浓度能够最有效地改善酶联免疫斑点法(enzyme-linked immunospot，ELISPOT)检测1型糖尿病患者谷氨酸脱羧酶65(glutamic acid decarboxylase 65，GAD65)特异性T细胞反 应的效率。方法：选取20例1型糖尿病患者(A组)及年龄和性别均匹配的16例正常对照者(B组)；Ficoll法分离外周血 单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，以人GAD65、内对照、巴斯德五合一疫苗为抗原，加入不 同浓度的IL-2[0 U/mL(1组)、0.5 U/mL(2组)、2.5 U/mL(3组)和12.5 U/mL(4组)]，ELISPOT检测上述各浓度组分泌干 扰素- γ (interferon-gamma，IFN-γ)的CD4+T细胞，比较各浓度组的GAD65孔(信号)、内对照孔(背景)的斑点数、斑点 净值以及刺激指数(即信噪比，stimulating index，SI)；另选取21例1型糖尿病患者(C组)及12例正常对照者(D组)，检 测针对GAD65抗原的特异性T细胞反应，比较联合IL-2(2.5 U/mL，上述实验已证明其为最优浓度，5组)与联合IL-7 (0.5 ng/mL，6组)所产的斑点数和SI。结果：1)A组在加入IL-2刺激后，各浓度组中GAD65反应性T细胞数均较A1组增 高，而各浓度下的内对照孔的斑点数亦呈比例升高。各浓度组斑点净值比较显示：A4组与A3组差异无统计学意义 (P>0.05)，而SI的比较则提示A3组最高；且仅A3组的SI(2.8)高于B3组(1.5)，差异有统计学意义(P<0.05)。2)C6组及D6 组的GAD65孔斑点数均分别略高于C5组及D5组，且C6组及D6组的斑点数增幅也分别高于C5组及D5组，但差异均无 统计学意义(P>0.05)。C5组的斑点净值(5.5)和SI(2.8)均显著高于C6组的斑点净值(4.3)和SI(1.8)，差异均有统计学意义 (均P<0.05)。结论：2.5 U/mL为ELISPOT检测1型糖尿病患者GAD65特异性T细胞反应的IL-2最佳浓度；IL-2较IL-7更有 利于改善ELISPOT检测的SI。     

重症肌无力患者胸腺AChR特异反应性IL-4,IL-10和IFN-γ分泌细胞数的检测

目的：探讨重症肌无力（MG）患者的乙酰胆碱受体（AChR）特异性T细胞免疫应答。方法：利用酶联免疫斑点技术（Elispot）检测32例MG患者胸腺AchR特异反应性白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-10（IL-10）和干扰素-γ（IFN-γ）分泌细胞数。结果：MG患者胸腺AchR特异反应性IL-4，IL-10和IFN-γ分泌细胞数均增高，其中胸腺增生组AChR特异反应性IL-4，IL-10和IFN-γ分泌细胞数明显高于胸腺瘤组。结论：MG胸腺Th1和Th2细胞存在免疫功能紊乱，胸腺AChR特异反应性IL-4，IL-10和IFN-γ分泌细胞数可作为判断胸腺Th细胞免疫功能紊乱的指标。     

LADA的IFN-γ、IL-4、IL-10水平及其与胰岛β细胞功能的关系

目的探讨成人隐匿性自身免疫糖尿病（LADA）患者IFN-γ、IL-4、IL-10水平变化及其与胰岛β细胞功能的关系。方法 ELISA法检测20例1型糖尿病患者、20例LADA患者、20例2型糖尿病患者、20例正常对照外周血血清中IFN-γ、IL-4、IL-10水平,放免法测定C-肽和胰岛素的空腹及餐后2h水平,评价胰岛β细胞功能。结果与对照组相比,3组IFN-γ、IL-4、IL-10水平均有显著升高。IFN-γ测定结果显示LADA组低于T1DM组,高于T2DM组;IL-4和IL-10测定结果显示LADA组低于T2DM组,高于T1DM组。T1DM组和LADA组空腹及餐后2hC-肽和胰岛素显著降低,T2DM组和对照组空腹C-肽和胰岛素无显著差异,餐后2hC-肽和胰岛素均显著增高。结论 LADA患者细胞因子水平紊乱,导致细胞免疫功能失衡,可能是其胰岛β细胞功能损害的因素之一。     

细胞色素P4501A1、谷胱甘肽转硫酶基因多态性与儿童急性淋巴细胞白血病的相关性研究

目的 探讨生物代谢酶细胞色素P4501A1、谷胱甘肽转硫酶M1、T1基因多态性与儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）的相关性。方法采用病例对照研究方法,应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术对89例儿童ALL患儿以及90名健康对照者的CYP1A1MspI多态（T264C）、GSTMI和GSTT1等基因的多态分布进行分析。结果儿童ALL组的CYP1A1基因MspI多态纯合子突变型（C型）的频率与对照组差异有统计学意义（P〈0．05）,携带纯合子突变型的儿童患ALL的危险度比杂合子突变型（B型）与野生型（A型）儿童的高（OR=1．997,95％CI：1．024—3．896）。GSTM1缺失型分布频率与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．05,OR=2．709,95％CI：1．427-5．146）,GSTT1缺失型分布频率与对照组相比差异无统计学意义（P〉0．05）。同时携带CYPIA1C型、GSTM1、GSTT1缺失型的联合基因型儿童患ALL的风险增加（DR=2．235,95％CI：1．111-4．497）。结论CYP1A1基因MspI多态纯合子突变型（c型）、GSTM1缺失型与儿童ALL的易感性可能相关,GSTT1缺失型与儿童ALL易感性可能不相关;同时携带CYP1A1C型与GSTM1、GSTT1缺失基因型可能是儿童ALL发病的易感因素之一。     

成人隐匿性自身免疫糖尿病患者存在GAD65反应性T细胞免疫异常

目的 探讨成人隐匿性自身免疫糖尿病(LADA)患者细胞水平的免疫发病机制.方法 湖南省1型糖尿病协作中心2005年1至6月就诊的LADA患者17例,2004年3月至2006年1月就诊的2型糖尿病(T2DM)患者28例,健康者(对照)16名;放射配体法检测胰岛自身抗体;连续密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞;酶联免疫斑点法检测谷氨酸脱羧酶(GAD65)反应性、Th1、Th2细胞,两者比值示为Th1/Th2平衡.结果 LADA组较T2DM、对照组具有更多Th1细胞,LADA、T2DM及对照组的Th1细胞数分别为4.0,2.0及1.0个,差异有统计学意义(P<0.01);3组的Th2细胞分别为2.0,3.3及1.0个(P>0.05);3组的Th1/Th2比值分别为3.0.0.4及0.3,差异有统计学意义(P<0.05);T2DM组的Th1细胞及Th1/Th2比值均与对照组差异无统计学意义,3组对植物血凝素非特异性刺激的Th1、Th2细胞数差异无统计学意义(均P>0.05).结论 LADA患者体内存在高频率的Th1细胞以及Th1/Th2平衡向Th1偏移是其细胞水平的免疫发病机制.     

自身免疫糖尿病患者谷氨酸脱羧酶抗体表位的研究

自身免疫糖尿病患者体内存在胰岛自身抗体,其中谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)被广泛应用于自身免疫糖尿病的诊断及预测。GADA表位变化与自身免疫糖尿病的发生和发展密切相关,新诊断的1型糖尿病患者血清中GADA倾向于与谷氨酸脱羧酶(GAD)65 M段和C端结合,而与N端罕见结合。GAD65-CAb阳性的成人隐匿性自身免疫糖尿病患者其胰岛功能较差,而GAD65-NAb阳性者与2型糖尿病相似。对GADA表位的研究不仅能为临床提供更多的信息,而且对于阐明自身免疫糖尿病的发病机制有重要的意义。     

ELISPOT检测羧基肽酶H阳性成人隐匿性自身免疫性糖尿病患者羧基肽酶H反应性T细胞

目的:探讨羧基肽酶H抗体(CPH-Ab)阳性的成人隐匿性自身免疫性糖尿病(LADA)患者外周血T细胞免疫的特点。方法:选取CPH-Ab+ LADA患者42例,2型糖尿病组(T2DM)患者20例和健康对照22例,分离外周血单个核细胞;自制人CPH蛋白,应用酶联免疫斑点(ELISPOT)技术检测并比较各组在CPH诱导下分泌IFN-γ的Th1和分泌IL-4的Th2细胞数,计算Th1与Th2比值(Th1/Th2)。结果:与健康对照和T2DM比较,CPH-Ab+ LADA患者的IFN-γ-T和IL-4-T细胞数无异常增多,Th1/Th2亦无统计学差异(P>0.05);但22例短病程(<3年)CPH-Ab+患者的CPH-IL-4-Th2细胞数较T2DM患者和正常对照均显著升高(1.8 vs. 0.2 和0.3, 均P<0.05),但未发现任何因素与该斑点数相关。各组间的T细胞针对植物血凝素的反应均无统计学差异。结论:CPH未直接诱导LADA的细胞免疫破坏反应,CPH反应性T细胞标志的可能是一进展相对缓慢的、胰岛&bgr;细胞的自身免疫过程。     

1型糖尿病患者谷氨酸脱羧酶反应性T淋巴细胞的测定

目的 探讨糖尿病患者血清中谷酸脱闳酶反应性Ｔ淋巴细胞的阳性反应及临床意义。方法 应用对硝基苯２酰氨基已糖（ＮＡＧ）微量酶反应比色法反映细胞增殖,检测３７例１型糖尿病（ＤＭ）患者外周血单核细胞对谷氨酸脱羧酶（ＧＡＤ）的反应性,并以２型ＤＭ、其他自身免疫性疾病患者及正常人各３０例对照。结果 １型ＤＭ ＧＡＤ反应性Ｔ细胞的阳性率为３５．１％（１３／３０）,其他自身免疫性疾病１０％（３／１０）,而２型ＤＭ     

暴发性1型糖尿病的免疫学特征探讨

目的 探讨暴发性1型糖尿病患者的免疫学特征及其病因学意义.方法 筛选暴发性1型糖尿病患者20例及其年龄、性别匹配的经典1型糖尿病患者40例.采用放射配体法检测谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)、蛋白酪氨酸磷酸酶抗体(IA2A)和锌转运蛋白8抗体(ZnT8A);酶联免疫斑点法检测GAD反应性T细胞;直接测序法检测人类白细胞相关抗原(HLA)DQ基因型.结果 本组暴发性1型糖尿病患者8/20胰岛自身抗体阳性,其中7例GADA阳性,4例ZnT8A阳性,3例为GADA与ZnT8均阳性.3例起病初期GADA阳性者,于2年及3年后复查抗体转阴各1例,另1例3年后复查抗体滴度增高(0.34～1.46).在6例暴发性1型糖尿病患者中3例有GAD反应性T细胞.暴发性1型糖尿病患者HIA-DQA1*0102-DQB1*0601和DQA1*03-DQB1*0401单体型频率较经典1型患者增高(P=0.005,P=0.035).结论 部分暴发性1型糖尿病患者存在体液或细胞免疫反应及HLA-DQ易感基因型,提示自身免疫反应可能参与暴发性1型糖尿病的发病过程.     

T波与ST段改变的2型糖尿病患者冠脉造影比较

目的观察心电图ST段改变与单纯T波改变的2型糖尿病患者的冠状动脉造影结果,探讨2型糖尿病患者的心电图诊断价值。方法按照病人的心电图ST段压低或抬高和单纯T波改变者分为A、B两组,行冠脉造影。结果心电图ST段改变和单纯T波改变病人的冠脉造影结果无显著性差异(P>0.05)。结论合并2型糖尿病的冠心病患者的体表心电图缺乏特异性改变。     

Effects of chimeric molecule of recombinant Dsg3EC1-2 with toxin PE40 on T and B lymphocytes in Pemphigus Vulgaris

Objective:To observe the effects of the recombinant chimeric toxin Dsg3EC1-2PE40 on T and B lymphocytes isolated from Pemphigus Vulgaris (PV) patients to further study its biological therapeutic function for PV. Methods :Recombinant chimeric toxin Dsg3EC1-2PE40 was first identified, expressed and purified, and then its effects on T and B lymphocytes of PV patients in vitro were detected and quantified by ELISPOT assay and MTT assay. Results :The purity of the expressed protein Dsg3EC1-2PE40 was up to 80%. In ELISPOT assay, with Dsg3EC1-2PE40, the overall number of B cells that produce anti-Dsg3 antibodies among PV patients was only about 60% of the comparable number with Dsg3EC1-2. The proliferation of T cells of PV patients was inhibited markedly by Dsg3EC1-2PE40. There was significant difference between the different groups with Dsg3EC1-2PE40 and Dsg3EC1-2. Conclusion:The recombinant chimeric toxin Dsg3EC1-2PE40 decrease the number of B cells that produce anti-Dsg3 antibodies in PV patients and can inhibit or kill T cells of PV patients in vitro.