姜黄素保护帕金森病多巴胺能神经元的机制研究

目的: 观察姜黄素对帕金森病细胞模型中多巴胺能神经元的保护作用并探讨其作用机制。方法: 人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞采用1-甲基-4-苯基-四氢吡啶离子（MPTP）处理建立帕金森病细胞模型,进一步设立姜黄素干预、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）干预以及姜黄素和3-MA同时干预组。各组细胞在药物处理48 h后分别进行酪氨酸羟化酶（TH）免疫荧光染色观察多巴胺能神经元存活数;蛋白质印迹法检测α-突触核蛋白（α-Syn）、转录因子EB（TFEB）、自噬相关蛋白多克隆抗溶酶体相关膜蛋白2A（LAMP2A）和微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）的蛋白表达;RT-PCR检测α-Syn的mRNA表达。结果: 与模型对照组比较,姜黄素组多巴胺能神经元存活数增加（P < 0.01）,α-Syn蛋白及mRNA表达减少（均P < 0.01）,TFEB以及自噬蛋白LAMP2A和LC3-Ⅱ表达上调（均P < 0.01）;3-MA和姜黄素同时干预组多巴胺能神经元存活数增加（P < 0.05）,α-Syn蛋白及mRNA表达减少（P < 0.05或P < 0.01）,TFEB、LAMP2A和LC3-Ⅱ蛋白表达上调（均P < 0.01）。与姜黄素组比较,姜黄素和3-MA同时干预组多巴胺能神经元存活数减少,LC3-Ⅱ和LAMP2A蛋白表达减少（均P < 0.05）。结论: 姜黄素可激活细胞自噬功能促进α-Syn自噬性清除,从而减轻MPTP所致的多巴胺能神经元损伤。     

多巴胺对鱼藤酮诱导α-突触核蛋白聚集的促进作用

目的:探讨多巴胺能细胞内多巴胺在鱼藤酮诱导α-突触核蛋白聚集过程中的作用。方法:采用鱼藤酮(1μmol/L)处理PC12细胞,流式细胞术检测双氢罗丹明123荧光强度;Western印迹法检测胞质内α-突触核蛋白表达;免疫荧光法观察α-突触核蛋白聚集体。并采用多巴胺耗竭剂——利血平预处理3h,观察上述指标。结果:鱼藤酮处理24h后,PC12细胞内过氧化物水平显著升高,而利血平(1μmol/L和5μmol/L)预处理后,细胞内过氧化物水平较鱼藤酮组显著下降(P<0.05)。鱼藤酮处理后,α-突触核蛋白表达水平显著升高,胞质内可见α-突触核蛋白免疫阳性的聚集体形成;采用利血平预处理后,α-突触核蛋白表达水平较鱼藤酮组显著下降(P<0.05),α-突触核蛋白聚集体面积减小。结论:在鱼藤酮作用过程中,多巴胺可促进α-突触核蛋白表达上调及其聚集体的形成。     

帕金森病相关唾液腺标志物及其早期诊断价值的研究进展

目前临床上对帕金森病的早期诊断,主要依靠病史资料及典型的症状体征,易与其他的帕金森综合征相混淆。多年来,国内外学者致力于寻找帕金森病早期诊断的可靠标志物。随着对帕金森病神经病理学和影像学的不断认识,研究者发现帕金森病患者的唾液腺相关标志物对疾病的早期诊断提供了一定帮助。本文将对该领域的研究进展进行综述。     

苯并[a]芘对脑内多巴胺能神经元和α-突触核蛋白的影响及其机制

目的 分析苯并[a]芘[benzo(a)pyrene,BaP]暴露对帕金森病病理特征多巴胺能神经元和α-突触核蛋白表达的影响,并探讨可能的机制。方法 8月龄人源SNCA转基因小鼠随机分为BaP染毒组和对照组,分别腹腔注射1.0 mg/kg体质量的BaP和玉米油溶剂,连续注射60 d。通过转轮实验观察小鼠运动功能障碍状况,通过免疫组织化学与免疫蛋白印迹实验观察BaP对多巴胺能神经元和α-突触核蛋白的影响,采用实时荧光定量PCR法检测相关mRNA的表达。研究中涉及的基因主要与神经递质转运蛋白、神经递质受体、细胞自噬和α-突触核蛋白聚集与降解相关。结果 BaP染毒后,转轮实验中小鼠运动时间显著降低(P<0.05),小鼠黑质多巴胺能神经元明显减少,为对照组的62%(P<0.05),中脑α-突触核蛋白表达增多,为对照组的1.36倍(P<0.05)。BaP染毒后,小鼠中脑14种mRNA表达显著下调(P均<0.05),主要涉及α-突触核蛋白降解与细胞自噬、神经元转运体、神经递质受体等功能;而Synphilin-1表达显著上调(P<0.01),与α-突触核蛋白合成有关。结论 BaP暴露抑制神经递质受体、多巴胺转运体蛋白功能和细胞自噬作用,阻碍α-突触核蛋白降解,从而诱导黑质多巴胺能神经元变性死亡和α-syn聚集体形成,增加帕金森病发病风险。     

苯并[a]芘对脑内多巴胺能神经元和α-突触核蛋白的影响及其机制

目的 分析苯并[a]芘[benzo(a)pyrene,BaP]暴露对帕金森病病理特征多巴胺能神经元和α-突触核蛋白表达的影响,并探讨可能的机制。方法 8月龄人源SNCA转基因小鼠随机分为BaP染毒组和对照组,分别腹腔注射1.0 mg/kg体质量的BaP和玉米油溶剂,连续注射60 d。通过转轮实验观察小鼠运动功能障碍状况,通过免疫组织化学与免疫蛋白印迹实验观察BaP对多巴胺能神经元和α-突触核蛋白的影响,采用实时荧光定量PCR法检测相关mRNA的表达。研究中涉及的基因主要与神经递质转运蛋白、神经递质受体、细胞自噬和α-突触核蛋白聚集与降解相关。结果 BaP染毒后,转轮实验中小鼠运动时间显著降低(P<0.05),小鼠黑质多巴胺能神经元明显减少,为对照组的62%(P<0.05),中脑α-突触核蛋白表达增多,为对照组的1.36倍(P<0.05)。BaP染毒后,小鼠中脑14种mRNA表达显著下调(P均<0.05),主要涉及α-突触核蛋白降解与细胞自噬、神经元转运体、神经递质受体等功能;而Synphilin-1表达显著上调(P<0.01),与α-突触核蛋白合成有关。结论 BaP暴露抑制神经递质受体、多巴胺转运体蛋白功能和细胞自噬作用,阻碍α-突触核蛋白降解,从而诱导黑质多巴胺能神经元变性死亡和α-syn聚集体形成,增加帕金森病发病风险。     

α-突触核蛋白促进过氧化氢诱导的多巴胺能神经细胞凋亡

目的研究α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)在过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)诱导的多巴胺能神经细胞凋亡中的作用。方法通过瞬时转染重组质粒pEGFP-α-syn和pcDNA-α-syn到MES23.5多巴胺能神经细胞建立过表达α-syn细胞模型。细胞外添加H2O2(200μmol/L)处理细胞。Hoechst 33258荧光标记细胞核及AO/PI(吖啶橙/碘化丙啶)双染检测细胞凋亡。Mitotracker线粒体探针标记线粒体。结果 H2O2可增加α-syn向线粒体和细胞核的转运;H2O2可单独引起细胞凋亡,但过表达α-syn细胞的凋亡率显著高于空载质粒转染细胞(P<0.05)。结论α-Syn增强了H2O2诱导的多巴胺能神经细胞凋亡。     

α-synuclein对多巴胺能神经元凋亡和氧化损伤影响

目的 探讨α-共核蛋白(α-synuclein)对多巴胺能神经元凋亡、氧化损伤和炎症的调节作用.方法用H2 O2诱导MES23.5细胞的氧化损伤,并在MES23.5细胞中过表达α-synuclein.用谷胱甘肽(GSH)来抵抗MES23.5细胞氧化损伤.采用流式细胞术检测细胞凋亡,分别采用相关试剂盒检测活性氧(ROS)...     

hα-syn蛋白核酸疫苗pVAX1-hαS1-140的构建及其表达

目的 构建含人α-突触核蛋白(human α-synuclein,hα-syn)编码基因的真核重组载体,并在COS-7细胞中表达,为帕金森病的核酸疫苗开发奠定基础.方法 通过PCR方法扩增hα-syn基因的CDS全长片段,舍酶切位点KpnⅠ、XbaⅠ和Kozak序列.扩增产物和真核表达载体pVAX1经双酶切、纯化、连接,转化感受态细胞E.coli TOP10,筛选含目的基因的重组载体pVAX1-hαS1-140,并在COS-7细胞中表达,用RT-PCR法和western blot法检测其表达产物.结果 经单、双酶切证实插入的基因片段大小一致,基因测序证实其序列和方向完全正确.用RT-PCR法和Westem blot法检测表明,重组质粒pVAx1-hαS1-140在COS-7细胞中能表迭目的蛋白,而且具有生物活性.结论 成功构建了核酸疫苗pVAX1-hαS1-140,并在COS-7细胞中表达,为帕金森病的核酸疫苗治疗研究奠定了良好的基础.     

ha-syn蛋白核酸疫苗pVAX1-hαSH1-140的构建及其表达

目的构建含人α-突触核蛋白（human α-synuclein,hα-syn）编码基因的真核重组载体,并在COS-7细胞中表达,为帕金森病的核酸疫苗开发奠定基础。方法通过PCR方法扩增hα—syn基因的CDS全长片段,含酶切位点KpnⅠ、XbaⅠ和Kozak序列。扩增产物和真核表达载体pVAX1经双酶切、纯化、连接,转化感受态细胞E．coli TOP10,筛选含目的基因的重组载体pVAX1-hαS1-140,并在COS-7细胞中表达,用RT—PCR法和Western blot法检测其表达产物。结果经单、双酶切证实插入的基因片段大小一致,基因测序证实其序列和方向完全正确。用RT—PCR法和Western blot法检测表明,重组质粒pVAX1-hαS1-140在COS-7细胞中能表达目的蛋白,而且具有生物活性。结论成功构建了核酸疫苗pVAX1-hαS1-140,并在COS-7细胞中表达,为帕金森病的核酸疫苗治疗研究奠定了良好的基础。     

姜黄素对帕金森病多巴胺能神经元保护作用的实验研究

 本研究通过动物实验证实,姜黄素可抑制炎症通路蛋白TNFα的产生使激活的星形胶质细胞减少,从而缓解了多巴胺能神经元的损伤。     

纹状体组织提取液诱导人胚胎神经干细胞向多巴胺能神经元分化的实验研究

目的体外培养人胚胎神经干细胞并诱导其向多巴胺能神经元分化。方法从临床引产的人胚胎（胎龄8～16周）海马组织中分离、培养人胚胎神经干细胞, 对其进行诱导分化。诱导剂采用来源于20周胎龄胚胎的纹状体的组织提取液。实验分为2组：对照组无诱导剂,培养基为撤除生长因子的基础培养基;实验组培养基中加入纹状体组织提取液50μL/mL;于诱导分化的第7天终止诱导分化,采用标记TH的免疫荧光染色方法检测TH阳性细胞量,用RT-PCR方法检测TH-mRNA的表达情况。结果抗TH的免疫荧光染色结果为：对照组与实验组的TH阳性细胞率分别为(0.53±0.17)%和(7.38±0.84)%,两组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。RT-PCR结果显示：对照组TH-mRNA表达不明显,实验组明显表达TH-mRNA,实验组与对照组的TH-mRNA表达差异亦有统计学意义（P＜0.05）。结论纹状体组织提取液具有促进人胚胎神经干细胞向多巴胺能神经元分化的作用。     

蛋白酶体抑制剂乳胞素对大鼠黑质多巴胺能神经元氧化损伤的作用

观察蛋白酶体抑制剂乳胞素对大鼠黑质多巴胺能神经元死亡和氧化损伤的作用,并探讨氧化损伤在蛋白酶体抑制剂诱导多巴胺能神经元死亡中的作用。     

LPS-induced Degeneration of Dopaminergic Neurons of Substantia Nigra in Rats

In order to investigate the neurotoxieity of lipopolysaccharide (LPS) on the dopaminergic neurons of substantia nigra and the pathogenesis of Parkinson disease, LPS was stereotaxically infused into substantia nigra (SN). At different dosages and different time points with 5μg LPS, the damage of the dopaminergic neurons in SN was observed by using tyrosine-hydroxylase (TH) immunohistochemical staining. The results showed that 14 days after injection of 0.1μg to 10μg LPS into the rat SN, TH-positive (TH ) neurons in the SN were decreased by 5%, 15%, 20%, 45%, 96% and 99% respectively. After injection of 5μg LPS, as compared with the control groups, TH^ neurons began to decrease at 3rd day and obviously decrease at 14^th day, only 5% of total cells, and almost disappeared 30 days later. The results suggested that LPS could induce the degeneration of dopaminergic neurons in the SN in a dose- and time-dependent manner.     

松果菊苷对鱼藤酮诱导的大鼠帕金森病模型黑质多巴胺能神经元的选择性保护作用（英文）

目的：观察鱼藤酮对大鼠中脑纹状体多巴胺能神经系统、肝、肾等组织的损伤及松果菊苷的干预作用。方法：雄性健康Sprague-Dawley大鼠被随机分为对照组,模型组和低、中、高剂量松果菊苷干预组。运用鱼藤酮2.75mg/（kg·d）腹腔注射4周的方法制作大鼠帕金森病模型;对照组腹腔每日注射同等体积不含鱼藤酮的溶解液;干预组除注射鱼藤酮外,分别给予松果菊苷20、40、80mg/（kg·d）灌胃处理。运用改良神经功能缺损评分（modified neurological severity score,mNSS）测量大鼠的神经行为改变,采用试剂盒检测其肝、肾损伤的指标,酪氨酸羟化酶免疫染色观察中脑黑质多巴胺能神经元的数目,比色法测定纹状体多巴胺的含量。结果：与正常对照组比较,鱼藤酮模型组肝、肾损伤的指标明显上升（P〈0.05）,mNSS升高（P〈0.01）,黑质多巴胺能神经元数目显著减少（P〈0.05）,纹状体多巴胺含量降低（P〈0.05）;与模型组相比,松果菊苷低、中、高剂量组肝、肾功能没有显著改善（P〉0.05）,但mNSS显著降低（P〈0.05）,黑质多巴胺能神经元数增加（P〈0.05）,纹状体多巴胺含量也增加（P〈0.05）,以上保护效应呈现剂量依赖性。结论：鱼藤酮能引起大鼠严重的黑质-纹状体多巴胺能神经系统以及肝、肾等组织的损伤,松果菊苷可以选择性地改善其神经损伤。     

米诺环素抑制促炎因子生成保护多巴胺能神经元

目的 探讨米诺环素对炎症介导的中脑多巴胺能神经元损伤的影响.方法 应用脂多糖处理中脑原代神经元/胶质细胞培养体系建立SD大鼠多巴胺能神经元损伤的炎症机制模型,于脂多糖处理该培养体系前或后加入米诺环素,免疫细胞化学法检测酪氨酸羟化酶阳性神经元的数目,液闪测定法测定多巴胺摄取力,并检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(ELISA法)、白介素-1β(IL-1β)(ELISA法)、一氧化氮(NO)(Griess法)和超氧阴离子(细胞色素C还原法)等促炎因子的变化.结果 米诺环素(2～10 μmol/L)前处理对脂多糖(J～ 100 ng/mL)诱导的中脑多巴胺能神经元损伤具有显著的保护作用.呈剂量依赖性;米诺环素( 10μmol/L)后处理对脂多糖(10 ng/mL)诱导的中脑多巴胺能神经元损伤也具有显著的保护作用;米诺环素显著降低促炎因子TNF-α、IL-1β、NO和超氧阴离子的生成.结论 米诺环素在脂多糖处理的中脑神经元/胶质细胞培养体系中可能通过抑制促炎因子生成保护多巴胺能神经元.     

丙炔苯丙胺对多巴胺能神经细胞的保护机制

目的探讨丙炔苯丙胺对多巴胺能神经细胞的保护机制。方法采用神经生长因子(NGF)将大鼠嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞)诱导分化成多巴胺能神经元的细胞模型,经鱼藤酮处理后给予不同浓度的丙炔苯丙胺,观察细胞形态的改变,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞活性及代谢状态,2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)检测细胞内活性氧(ROS)、还原型谷胱甘肽((GSH)含量及蛋白酶体功能。结果与鱼藤酮组比较, 50μmol／L浓度的丙炔苯丙胺作用24 h后,细胞恢复活力,570 nm处光密度值为0．39±0．01。与未处理组比较,鱼藤酮组ROS水平显著升高(P<0．01),丙炔苯丙胺组较鱼藤酮组显著降低(P<0．01)。鱼藤酮组的GSH含量为(104.76±0．88)μmol／L,显著低于丙炔苯丙胺组的(130．21±0．84)μmol／L(P<0．01)。与未处理组比较,鱼藤酮组的细胞蛋白酶体活性明显降低(P<0．01),丙炔苯丙胺组蛋白酶体活性恢复。结论丙炔苯丙胺能够明显减少鱼藤酮诱导的PC12细胞死亡,其机制可能是抑制氧化应激及保护蛋白酶体。     

尼古丁对帕金森病大鼠多巴胺能神经元的保护作用

目的：观察尼古丁（NIC）对脂多糖（LPS）诱导的帕金森病大鼠多巴胺能神经元的保护作用。方法：60只大鼠随机分为4组,每组15只。LPS组（L组）、NIC组（N组）和NIC＋α7型烟碱乙酰胆碱受体（nAChR-α7）阻断剂α-银环蛇毒素组（α-BTX）（M组）分别腹腔注射PBS、NIC和NIC与α-BTX,连续4周,并于2周末一次性黑质内注射LPS。对照组（C组）均给予PBS。4周末进行阿朴吗啡诱导的旋转试验,并用免疫组化方法观测黑质酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经元数量及离子钙结合蛋白1（Iba1）阳性细胞的形态。结果：4组大鼠旋转实验阳性率及30min内旋转圈数差异有统计学意义（χ2=10.179,P=0.006;F=54.681,P〈0.001）,TH免疫阳性神经元数差异有统计学意义（F=861.541,P〈0.001）。与N组相比,L组及M组旋转实验阳性率降低,旋转圈数减少（P〈0.05）,TH免疫阳性神经元数减少（P〈0.05）。N组Iba1阳性细胞多呈静止期的形态;L组与M组细胞形态相似,大多呈活化期的形态。结论：NIC可能通过nAChR-α7抑制小胶质细胞的活化,对LPS诱导的帕金森病大鼠多巴胺能神经元起保护作用。     

依达拉奉对帕金森病模型小鼠多巴胺能神经元的保护作用

目的探讨依达拉奉(edaravone)对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的C57BL/6J帕金森病模型小鼠的保护作用及相关机制。方法 90只雄性C57BL/6J小鼠随机分为依达拉奉组(ED组)、帕金森病模型组(PD组)和生理盐水对照组(NS组),每组30只。ED组和PD组小鼠给予皮下注射MPTP建立PD模型后,ED组给予依达拉奉(3mg/kg)治疗。用滚轴实验检测小鼠的旋转次数,用免疫组织化学实验检测小鼠黑质酪氨酸羟化酶(TH)的表达,用RT-PCR和免疫印迹实验分别检测小鼠黑质脑源性神经营养因子(BDNF)mRNA与蛋白的表达。结果与NS组比较,ED组、PD组小鼠在滚轴实验中的旋转次数下降(P<0.05,P<0.01),黑质TH表达减少(P<0.05,P<0.01),黑质BDNF的mRNA(P均<0.01)和蛋白(P均<0.05)表达降低;与PD组比较,ED组小鼠在滚轴实验中的旋转次数增加(P<0.05),黑质TH表达增加(P<0.05),黑质BDNF的mRNA(P<0.01)和蛋白(P<0.05)表达升高。结论依达拉奉可增加C57BL/6JPD模型小鼠黑质区BDNF的mRNA及蛋白表达,降低MPTP对小鼠黑质的损伤,对多巴胺能神经元有保护作用。     

诱导型一氧化氮合酶在脂多糖诱导多巴胺能神经元变性时的变化研究

目的探讨诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达上调是否参与脂多糖(LPS)诱导的多巴胺(DA)能神经元变性。方法脑立体定位注射5μgLPS至大鼠脑黑质,观察不同时间点(6、12h,1、3、7d),iNOSmRNA及蛋白表达的动态变化;化学比色法检测黑质NO释放量以及iNOS活性改变。结果iNOSmRNA和蛋白的动态变化为6h开始出现增高,1d达高峰,3d开始下降,7d后基本消失。1d时iNOS阳性细胞数(45.30±4.63)显著高于PBS对照侧iNOS阳性细胞数(0.11±0.04)(P<0.01)、RT-PCR、Western印迹法显示1d组iNOSmRNA和iNOS蛋白表达明显多于正常对照组和PBS对照侧;同时发现iNOSmRNA和蛋白过度表达,并促进NO释放,iNOS活性升高。结论iNOS上调可能是LPS诱导DA能神经元变性机制中重要的因素之一。     

帕金森病大鼠中脑腹侧被盖区多巴胺能神经元的改北

目的：探讨帕金森病（PD）大鼠中脑腹侧被盖区（VTA）多巴胺（DA）能神经元的改变.方法：20只3月龄Wistar雄性大鼠,随机分为模型组和对照组,每组10只.6-羟基多巴胺（6-OHDA）注射右侧黑质致密区（SNC）制作PD大鼠模型,腹腔注射阿朴吗啡后进行行为学观察;尼氏染色观察左侧中脑VTA神经元、酪氨酸羟化酶（TH）的改变;免疫组织化学ABC法观察其DA能神经元的改变并进行图像分析.结果：阿朴吗啡诱发PD大鼠模型异常旋转行为,尼氏染色见PD大鼠左侧中脑VTA有神经细胞肿胀、坏死等变化;VTA TH阳性神经元形态学改变,数量减少,与对照组相比,差异有统计学意义.结论：中脑VTA DA能神经参与PD模型大鼠的改变.