铜绿假单胞菌主动外排表型及OprM基因检测

目的对淮北地区铜绿假单胞菌主动外排表型及OprM基因存在情况进行分析,探讨铜绿假单胞菌多重耐药的主动外排分子机制。方法采用外排泵抑制剂碳酰氰基-对-氯苯腙(CCCP)对铜绿假单胞菌环丙沙星(CIP)敏感性的逆转试验,筛选铜绿假单胞菌主动外排表型阳性菌;采用PCR法扩增主动外排表型阳性菌的OprM基因。结果在CCCP作用下,36株铜绿假单胞菌中有24株菌对CIP的敏感性提高4倍以上,主动外排表型阳性率为66.7%(24/36);在OprM基因的PCR扩增试验中,有16株(44.4%,16/36)扩增出848 bp的OprM基因片段。结论主动外排表型在临床铜绿假单胞菌中广泛存在;OprM基因在铜绿假单胞菌主动外排菌中最常见。     

铜绿假单胞菌药物外排泵研究进展

感染性疾病目前仍然是威胁全球人类健康的第二大杀手，发达国家的第三大杀手。欧美和中国的多项病原菌流行病学监测资料中，铜绿假单胞菌（P—seudomonas aeruginosa，PA）均高居榜首，尤其是获得性免疫缺陷综合征（AIDS）等严重免疫缺陷性患者，一旦感染PA往往是致命性的。此外，PA也是囊性纤维化患者最重要的死亡原因。资料表明，PA的耐药状况十分严重，美国1998～2002年间多重耐药PA增加了32％。铜绿假单胞菌常对多种常用抗生素耐药，所涉及耐药机制复杂，包括：外膜低渗透、抗生素修饰酶的生成（如β-内酰胺酶）、外膜孔蛋白缺失、生物膜形成、青霉素结合蛋白改变和主动外排泵系统。对PA耐药机制的研究有助于抗生素的合理应用。近年来多药外排泵被认为是导致PA多重耐药的重要原因。     

siRNA靶向抑制铜绿假单胞菌oprM基因表达

目的：探讨siRNA能否抑制铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, PA）主动外排系统oprM基因的表达。方法针对oprM基因序列设计合成3对siRNA片段,分别转化耐药PA ,采用抗菌素药物敏感试验筛选出能抑制PA耐药的siRNA片段及其最佳转化剂量,再构建siRNA质粒表达载体,转化PA标准菌株,应用western blot技术检测OprM蛋白表达量的变化。结果筛选出一对能抑制PA耐药的siRNA片段,确定其最佳转化剂量为25μL（20μm／L）／100μL PA 菌液。成功构建了靶向oprM基因的siRNA质粒表达载体。Western Blot检测结果显示,转化siRNA质粒载体的PA其OprM蛋白的表达量明显降低。结论靶向oprM基因的siRNA能够抑制PA oprM基因的表达。     

铜绿假单胞菌外膜蛋白OprM原核表达及抗体制备

目的制备铜绿假单胞菌（PA）主动外排系统外膜蛋白OprM及抗OprM多克隆抗体,为深入研究主动外排系统奠定基础。方法从PA基因组中克隆oprM基因,构建pET28 a-c-OprM表达载体,在大肠埃希菌中经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达并用免疫转印试验（W estern b lot）验证,建立重组OprM纯化方案,免疫动物制备多克隆抗体。结果扩增出带有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点及保护碱基的oprM基因序列,构建了pET28 a-c-OprM表达载体,诱导表达的重组OprM蛋白为带有H is标签的不可溶包涵体,建立并优化了重组OprM的纯化方法,免疫小鼠获得抗OprM蛋白的多克隆抗体。结论成功制备了OprM蛋白和抗OprM多克隆抗体,为深入研究该蛋白及相关的主动外排系统提供了有效手段。     

铜绿假单胞菌多药主动外排系统研究进展

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA），是一种重要的医院感染病原菌，主要感染医院内免疫力低下患者。PA对多种临床常用抗生素呈现明显的固有与获得性多重耐药（multidrug resistance，MDR），一旦感染，临床治疗十分困难。自Geroge等提出主动外排是细菌耐药的一个基本机制后，外排机制得到了广泛而深入的研究，新的药物外排系统不断发现，而且随着分子生物学技术的应用，该领域的研究更加深入；随着主动外排在临床主要病原菌耐药中的重要作用不断被揭示和认同，主动外排系统越来越引起人们重视，也是目前细菌耐药机制研究中的新热点。本文将对近年PA中各类外排泵的研究情况和进展做一综述。     

大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌外排泵转录水平与耐药的关系

目的调查细菌耐药性与其主动外排泵系统的作用关系,并探讨大肠埃希菌外排泵调控基因对其外排泵结构基因表达水平的影响,分析其耐药机制。方法收集大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌共59株,根据头孢他啶耐药情况分为实验组（耐药）与对照组（敏感）,多重聚合酶链反应（PCR）扩增外排泵调控基因acrR并测序,实时定量逆转录（RT）-PCR检测外排泵及调控基因marA的相对转表达水平,三维试验检测AmpC酶。结果实验组大肠埃希菌46.7%（7株）acrAB基因转录水平增高,肺炎克雷伯菌中51.9%（14株）acrAkp基因转录水平增高,敏感组外排泵基因均未见增高。实验组大肠埃希菌中,3株acrR发现突变,9株marA基因转录水平增高。59株菌株中39株（66.1%）AmpC阳性。结论主动外排泵系统是细菌耐药机制之一,常与其他耐药机制共同存在。acrR突变与marA表达增高均可引起大肠埃希菌acrAB表达增加。     

大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌外排泵转录水平与耐药的关系

目的调查细菌耐药性与其主动外排泵系统的作用关系,并探讨大肠埃希菌外排泵调控基因对其外排泵结构基因表达水平的影响,分析其耐药机制。方法收集大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌共59株,根据头孢他啶耐药情况分为实验组(耐药)与对照组(敏感),多重聚合酶链反应(PCR)扩增外排泵调控基因acrR并测序,实时定量逆转录(RT)-PCR检测外排泵及调控基因marA的相对转表达水平,三维试验检测AmpC酶。结果实验组大肠埃希菌46.7%(7株)acrAB基因转录水平增高,肺炎克雷伯菌中51.9%(14株)acrAkp基因转录水平增高,敏感组外排泵基因均未见增高。实验组大肠埃希菌中,3株acrR发现突变,9株marA基因转录水平增高。59株菌株中39株(66.1%)AmpC阳性。结论主动外排泵系统是细菌耐药机制之一,常与其他耐药机制共同存在。acrR突变与marA表达增高均可引起大肠埃希菌acrAB表达增加。     

MexAB—OprM主动外排系统在全耐药铜绿假单胞菌耐药中的作用及机制

目的探讨MexAB—OprM主动外排系统（外排泵）在全耐药铜绿假单胞菌耐药机制中的作用及其过度表达的机制。方法联合L-酚丙氨基-L-氨基酰-β-萘胺（MC-207,110）和环丙沙星（CIP）,测定26株全耐药铜绿假单胞菌的MIC;用RT—PCR法扩增MexAB—OprM内膜转运蛋白MexB的结构基因mexB和内参照基因16SrDNA片段,根据mexB与16SrDNA扩增产物的电泳扫描比值,分析mexB mRNA的表达水平,判断MexAB—OprM的表达情况;用PCR法扩增MexAB—OprM调控基因mexR并对其产物测序,用Blast软件在GenBank中与已知序列比对。结果联合MC-207,110后有20株（76．9％）CIP的MIC值下降4倍及以上;26株全耐药铜绿假单胞菌中有22株MexAB-OprM高表达,其中有15株mexR基因发生变异,13株发生点突变,出现氪基酸替换．2株发生插入突变,导致氨基酸插入;点突变位点是336G—A、603G—A、660G—A、584C—G、653T—A,后两者导致氨基酸替换103Ala—Gly、126Val—Glu,插入突变是在470和474核苷酸间插入碱基GGC,导致66和68氨基酸间插入Ala。结论MexAB—OprM主动外排系统的高表达对铜绿假单胞菌的耐药性起重要作用,调控基因mexR的突变是其高表达的原因之一。     

主动外排系统与阴沟肠杆菌多重耐药关系的研究

目的观察泵抑制剂氰氯苯腙对阴沟肠杆菌耐药水平的降低作用,并扩增外排基因,以探讨主动外排系统的基因分布及与阴沟肠杆菌多重耐药的关系。方法采用琼脂稀释法测定氰氯苯腙应用前后83株阴沟肠杆菌对头孢他啶、阿米卡星、阿奇霉素、左氧氟沙星、四环素的最小抑菌浓度变化,PCR扩增外排系统基因acrA、acrB、toiC,PCR产物连接转化后采用sanger末端终止法进行测序。结果以上述5种抗生素为底物,分别有30、36、19、32、28株显示外排表型阳性。PCR扩增结果显示,分别有55、57、62株菌检测得到acrA、acrB、toiC,并通过测序证实。结论主动外排泵抑制剂可降低阴沟肠杆菌对抗生素的耐药水平,相对于非多重耐药株,外排泵对多重耐药株的影响较大。主动外排系统是阴沟肠杆菌多重耐药的重要机制之一。     

铜绿假单胞菌MexAB-OprM、MexXY-OprM主动外排系统的耐药作用

目的探讨MexAB-OprM、MexXY-OprM主动外排系统(外排泵)在多重耐药铜绿假单胞菌耐药机制中的作用。方法选取36株临床分离的多重耐药铜绿假单胞菌,采用琼脂二倍稀释法,测定环丙沙星对铜绿假单胞菌的MIC及进行泵抑制剂碳酰氰基-对-氯苯腙(CCCP)存在情况下的干预试验;用实时定量RT-PCR测定结构基因mexA、mexX的mRNA表达水平来判断MexAB-OprM、MexXY-OprM外排泵表达情况;用PCR法分别扩增其调控基因mexR、mexZ,并对其产物测序,用Blast软件在GenBank与已知序列比较,研究其过度表达的机制。结果在CCCP作用下,36株铜绿假单胞菌中24株菌对环丙沙星的敏感性(MIC)由20～320 mg/L提高到2.5～40 mg/L,主动外排表型阳性率为66.7%(24/36),15株菌高表达Mex-AB-OprM外排系统(41.7%),21株高表达MexXY-OprM外排系统(58.3%)。15株高表达MexAB-OprM外排系统铜绿假单胞菌同时表达MexXY-OprM外排系统;12株干预试验阴性的铜绿假单胞菌均无mexA、mexX高表达;随机选择mexA、mexX高表达的4株细菌均发生mexR、mexZ基因突变,出现氨基酸替代。结论主动外排系统MexAB-OprM、MexXY-OprM在多重耐药铜绿假单胞菌中过度表达是铜绿假单胞菌多重耐药的机制之一;外排泵MexAB-OprM、MexXY-OprM高表达分别与调控基因mexR、mexZ发生变异有关。     

建议治疗绿脓杆菌感染慎用泰能

绿脓杆菌（铜绿假单胞菌,PA）的主要耐药机制是产生哥内酰胺酶、菌细胞的外膜通透性降低及菌体蛋白结构与功能的变化。产生多种β-内酰胺酶,包括质粒介质的头孢菌素酶（AmpC）和金属酶等。产金属酶不仅能水解多种β-内酰胺类抗生素,对碳青霉烯类也不例外。近来还认为其耐药与改变青霉素结合蛋白靶位、低亲和力的青霉素结合蛋白（PBP）、细菌膜孔蛋白通道狭窄、生物被膜形成、主动外排（泵出系统）等有关。其外膜通透性降低,显示其对多种药物低敏感性,主动外排（泵出系统）是多重耐药的主要机制。     

铜绿假单胞菌主动外排系统与多重耐药性

铜绿假单胞菌(PA)是假单胞菌中常见的院内感染条件致病菌,其对多种不同性质的抗生素高度耐药。复杂的主动排出系统在铜绿假单胞菌多重耐药性中起着极其重要的作用。通过检测已发现铜绿假单胞菌中的7种主动外排系统,包括MeXAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM、MexJK-OprM、MexGHI-OpmD和MexVW-OprM。不同类型的外排系统在作用底物和调控机制等方面有着各自的特点。     

碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌外排泵表达研究

目的了解临床分离的碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌多药外排泵及膜孔蛋白表达情况。方法用SYBR Green I实时定量RT-PCR法检测多药外排泵MexAB-OprM，MexCD-OprJ，MexEF-OprN，MexXY-OprM及膜孔蛋白O-prD的mRNA表达水平。结果在40株碳青霉烯类耐药的铜绿假单胞菌中，13株有耐药泵基因表达异常；12株oprD表达异常。结论外排泵和膜孔蛋白的表达异常是钢绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药的重要原因，探索耐药机制对新药研制及控制医院内感染的播散是十分重要的。     

基层医院与三级医院耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药表型及耐药机制研究

目的分析北京地区基层医院与三级医院耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药表型及其耐药机制,为临床的合理用药提供依据。方法采用K-B法检测两所医院耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药表型,应用PCR方法对耐亚胺培南铜绿假单胞菌相关基因(金属酶基因IMP、VIM;主动外排系统基因OprM、mexA、mexB;外膜蛋白Opr D2基因)进行检测。结果两所医院耐亚胺培南铜绿假单胞菌对阿米卡星、庆大霉素、哌拉西林/他唑巴坦敏感性均排在前三位;检出基因IMP(11.4%、5.0%)、OprM(90.9%、97.5%)、mexA(100.0%、100.0%)、mexB(100.0%、100.0%)和OprD2(52.3%、60.0%),VIM基因均未检出。结论外排泵系统和外膜蛋白OprD2基因缺失是两个医院介导铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的主要机制,具有流行病学意义。     

肠球菌的多重耐药外排泵研究进展

肠球菌是最常见的医院感染病原菌之一，近年来肠球菌的耐药性变得越来越严重，尤其表现为多重耐药性。在肠球菌中已经发现多种耐药基因，有些耐药基因能够编码多重耐药外排泵，介导肠球菌对多种药物的耐药，即多重耐药性。外排系统抑制剂能够抑制肠球菌对抗菌药物的泵出。因此，外排系统抑制剂的研究和开发将是一条解决多重耐药性的重要途径。     

铜绿假单胞菌耐药机制研究进展

铜绿假单胞菌是临床常见的条件致病菌.随着抗生素广泛应用和不合理使用导致细菌抗生素耐药性增加,临床已分离到大量多重耐药菌株,给临床治疗带来极大的困难.铜绿假单胞菌耐药机制十分复杂,该文就外膜通透性障碍、作用靶位改变、产生灭活酶、形成生物膜和主动外排泵系统等耐药机制做一综述.     

大肠埃希菌外排泵研究进展

随着抗生素的广泛应用,临床上产生一些多重耐药菌株。多重耐药菌株的产生使常规抗生素在临床细菌性感染治疗中失效。细菌主动外排是耐药菌株产生多重耐药的主要机制之一。目前所知的外排泵共约250多种转运体家族,可归人数个超家族中^[1]：主要易化子超家族（major facilitator superfamily,MFS）、耐药结节分化超家族（resistance -nodulation -division superfamily,RND）、药物代谢物转运体家族（drug／metabolite transportors,DMT）[包括小多耐药蛋白（small muhidrug resistant protein,SMR）家族]、多药及毒物外排家族（multidrug and toxic compound ext rusion family,MATE）和ATP耦联盒超家族（ATP -binding cassere,ABC）等。     

碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌外排泵和外膜孔蛋白表达水平的研究

目的探讨我国临床分离的碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌外排泵MexAB—OprM和外膜孔蛋白OprD2表达水平及其与碳青霉烯类抗生素耐药性之间的关系。方法收集我国15个省市28所医院临床分离的铜绿假单胞菌655株，琼脂稀释法测定该菌加入外排泵抑制剂羟基氰氯苯腙（CCCP）前后对亚胺培南和美罗培南的MIC；RTPCR检测外排泵MexAB-OprM和孔蛋白OprD2的表达水平；十二烷基硫酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳（SD-PAGE）和蛋白印迹（Western blot）检测外膜孔蛋白OprD2。结果收集到的655株铜绿假单胞菌菌株对亚胺培南和美罗培南敏感率分别为52．5％和59．2％，加入CCCP前后其对亚胺培南和美罗培南的敏感率无明显变化；52．0％（51／9B）美罗培南耐药株MexAB-OprM显著高表达（P〈0．05），43．7％（59／135）亚胺培南耐药株OprD2显著低表达（P〈0．05），14．8％（20／135）亚胺培南耐药株OprD2表达缺失；SDS-PAGE和Western—blot显示与标准菌株PAO1相比，OprD2表达水平减低菌株ZZ20显影减低，表达缺失菌株BJ1不显影。结论MexAB-OprM表达升高和OprD2表达降低甚至缺失是我国铜绿假单胞菌对美罗培南和亚胺培南耐药的重要机制。     

铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药机制探讨

目的探讨铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药机制。方法取铜绿假单胞菌55株。采用外膜蛋白图谱,紫外吸收法测定外膜微孔蛋白OprD2基因含量;采用纸片协同试验检测β-金属酶;采用Etest试验观察氰氯苯腙对亚胺培南最低抑菌浓度(M IC)的影响。结果铜绿假单胞菌耐药株OprD2基因相对含量明显低于敏感株(P<0.01),且检出产β-金属酶4株,有17.4%菌株存在主动外排泵出机制。结论OprD2基因的减少,产生β-金属酶及存在主动外排泵出机制是唐山地区铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的主要原因。     

肺炎克雷伯菌外排泵基因研究与耐药性的关系

目的分析肺炎克雷伯菌外排泵基因研究与耐药性的关系,为细菌耐药管理提供依据。方法选取2016年1月至2018月12月在该院住院的儿科患儿,从粪便、痰液、血液、组织液等标本中分离获得鉴定肺炎克雷伯菌144株,对其进行耐药性分析、基因分析及相关性分析。结果耐药性分析结果显示,肺炎克雷伯菌对氨苄青霉素耐药率最高,对亚胺培南、美罗培南的敏感性较高。肺炎克雷伯菌的外排泵基因检出率为0.0%～86.8%,阳性率最高为AcrAB-TolC,最低为qepA。检出外排泵基因3～6个,检出耐药药物品种1～10个,耐药药物品种数与外排泵基因存在正相关性(r=0.412,P0.05),qacE△1-sull的耐药药物品种数高于其他类型的基因,差异有统计学意义(P0.05)。结论肺炎克雷伯菌外排泵基因与耐药性存在相关性,外排泵类型、数量都会增加耐药风险。