BCR-ABL融合基因定性检测试剂盒的性能评价

目的 使用BCR-ABL参考品,评价BCR-ABL融合基因定性检测试剂盒的性能。方法 提取参考品的RNA,测定其浓度和纯度。使用白血病融合基因检测试剂盒（荧光PCR法）进行PCR扩增。使用不同平台的荧光定量PCR仪进行检测,并使用仪器软件进行分析,获得参考品的BCR-ABL融合基因结果。结果 阳性参考品在BCR-ABL反应通道扩增曲线有明显对数增长期且Ct值<试剂盒的阳性界值,为BCR-ABL融合突变阳性,BCR-ABL融合基因突变阴性和其他白血病融合基因突变的阴性参考品在BCR-ABL反应通道没有扩增曲线,为BCR-ABL融合突变阴性,不高于100拷贝/反应的检测限参考品在BCR-ABL反应通道扩增曲线有明显对数增长期且Ct值<阳性界值,为BCR-ABL融合突变阳性,重复性参考品的BCR-ABL反应通道Ct值的变异系数（CV,%）为0.4%～1.8%。结论 BCR-ABL融合基因定性检测试剂盒能够准确检出参考品的BCR-ABL融合基因突变,符合《断裂点簇集区-艾贝尔逊白血病病毒（BCR-ABL）融合基因检测试剂盒》标准中的阳性参考品符合率、阴性参考品符合率、检出限和重复性...     

荧光实时定量PCR在检测CML患者BCR-ABL融合基因中的应用

目的:探讨荧光实时定量PCR检测慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)患者BCR-ABL融合基因的可行性.方法:取10例CML患者(CML组)及3名正常体检者(对照组)的外周血,应用荧光实时定量PCR检测BCR-ABL融合基因,并与巢式PCR结果比较.结果:CML组10例巢式PCR均为( ),其中3例为( )、7例为( )/(-),对照组3名均为(--).CML组荧光实时定量PCR呈阳性6例.巢式PCR( )、( )/(-)和(--)的3组中用荧光实时定量PCR测定的BCR-ABL融合基因量依次减少.结论:荧光实时定量PCR可简便地检测BCR-ABL融合基因,结果可靠,且较巢式PCR更直观,具有较高临床应用价值.     

慢性髓性白血病BCR-ABL突变与二、三代TKI的疗效研究进展

随着第一代酪氨酸激酶抑制剂（TKI）的问世,慢性髓性白血病的治疗发生了革命性变化,但在治疗过程中出现了耐药性,由此研发了第二代（达沙替尼、尼洛替尼和博苏替尼）和第三代（普纳替尼）TKI。相比之前的治疗方案,选择特定的TKI能显著提高慢性髓性白血病的缓解率、总生存率,改善预后,仅少数BCR-ABL突变患者对二代TKI不敏感,建议针对有特定突变的患者选择二代TKI,对于其他突变和没有突变的患者,应根据患者的病史选择二代TKI,对二代TKI不敏感的突变可选择三代TKI,如T315I突变对第三代TKI普纳替尼敏感。由于不同BCR-ABL突变的患者对二、三代TKI的敏感性不同,本文将对二、三代TKI在BCR-ABL突变的慢性髓性白血病患者中疗效的最新研究进展作一综述。     

慢性髓性白血病患者BCR-ABL融合基因的规范化检测及临床应用

BCR-ABL融合基因(mRNA)是慢性髓性白血病(CML)的分子标志,靶向BCR-ABL的酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)是当前CML治疗的基本药物。BCR-ABL mRNA水平是TKI疗效评估的重要指标,ABL酪氨酸激酶区突变提示耐药机制、指导随后TKIs的选择等治疗策略。规范化的BCR-ABL检测是精准指导临床治疗的前提,是CML患者获得最佳疗效的保证。规范化体现在样本类型、检测内容、实验室检测方案、报告方式等方面,本文结合新近文献探讨了CML患者BCR-ABL定量和突变的规范化检测及临床应用。     

多重RT-PCR联合毛细管电泳法检测BCR-ABL融合基因

目的建立多重逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)联合毛细管电泳法检测BCR-ABL融合基因,以期应用于慢性粒细胞白血病(CML)辅助诊断。方法采用重叠延伸法构建BCR-ABL融合基因阳性模板,设计并优化检测BCR-ABL融合基因的多重RT-PCR联合毛细管电泳体系,对检测体系进行初步的性能评估。结果多重RT-PCR技术检测BCR-ABL融合基因(e1a2、e13a2和e14a2)的最低检测限在102~103拷贝/μL;50例临床确诊CML的患者应用该法检测BCR-ABL融合基因的阳性率为86.0%,其中e13a2型(20.0%),e14a2型(66.0%);本方法与骨髓细胞培养染色体核型分析相比,阳性符合率为97.6%,阴性符合率为75.0%,总符合率为94.0%,2种方法具有较高的一致性(Kappa=0.765,P0.05)。结论成功建立检测BCR-ABL融合基因的多重RTPCR联合毛细管电泳方法。该方法操作简单快捷、特异性好、灵敏度高,适合于临床上CML的辅助诊断和分子分型。     

一步法RT-PCR检测慢性粒细胞白血病BCR-ABL融合基因

目的：建立一步法RT-PCR检测CML患者BCR—ABL融合基因的实验方法。方法：Trizol试剂提取细胞RNA,用特异引物一步法RT—PCR检测BCR—ABL融合基因．并作灵敏度试验。结果：本方法的灵敏度可达到10pg水平。对25例CML患者检测BCR-ABL融合基因,阳性率为100％．并可检测出BCR—ABL融合基因各种融合方式。结论：一步法RT—PCR检测BCR-ABL融合基因有很好的灵敏度和特异性,操作简便、快速,特别适用于临床检测。     

实时定量荧光PCR检测白血病融合基因

本研究旨在建立实时定量荧光PCR的方法并检测CML、ALL、APL患者中融合基因的拷贝数,观察患者体内融合基因转录水平的变化。构建质粒标准品,制作标准曲线。检测49例患者的骨髓及外周血标本130份,对个别患者连续监测融合基因转录表达水平,结果表明：在82．4％（28／34）的CML患者中检测到BCR—ABL^p210阳性（BCR—ABLP210／ABL比值为0．01～3．19）,其中在1例CML急淋变患者检测到BCR—ABL^p210。和BCR—ABL^p190双阳性;在66．7％（4／6）的ALL患者中检测到BCR—ABL阳性,其中2例BCR—ABL^p210阳性,2例BCR—ABL^p190阳性;在77．8％（7／9）的APL患者中检测到PML—RARa融合基因阳性（PML—RARa／ABL比值为0．0014～3．199）,其中3例为长型,3例为短型,1例为变异型,检测结果为阴性的患者处于缓解期;连续监测患者融合基因转录表达水平与临床缓解和复发的变化情况相吻合。结论：实时定量荧光PCR技术成熟、操作简便,检测白血病融合基因结果准确稳定,对于临床明确诊断、具体分型、动态观测肿瘤负荷、选择治疗方案、评估治疗效果和预后都有较大价值,值得推广应用。     

bcr—abl融合基因及其检测

bcr-abl融合基因位于染色体t(9;22)(q34;q11),由位于9号染色体上的细胞原癌基因abl部分序列从其正常位置易位至22号染色体的BCR区而形成。在绝大多数病例中,断裂点集中在5.8 kb的M-BCR区,主要形成b2a2和b3a2二种形式的转录物及蛋白质,二者差异仅为75个碱基及25个氨基酸。bcr-abl融合基因及其表达的检测对CML有重要的诊断与预后价值。用Southern印迹杂交、间期或中期染色体原位杂交等方法检测DNA,发现Ph阴性或变异型Ph病人存在bcr-abl融合基因,检测到许多新的融合类型,并确认异基因BMT后白血病的复发是源于自身MRL。用优化的RT-PCR,定量RT-PCR或RNA原位杂交检测RNA,可精确定位罕见或混合的接合型,还发现正常人中bcr-abl基因有低量表达且有随年龄增长而增加的趋势。用Western印迹或酶联免疫反应检测,发现BCR-ABL蛋白与C-ABL蛋白之比在外周血与骨髓中相似且与Ph染色体重排率有线性关系,还发现如果P190继P210之后出现,则CML的预后很差。     

异基因造血干细胞移植治疗慢性髓系细胞白血病的研究现状及进展

酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的出现使慢性髓系细胞白血病(CML)的治疗进入一个崭新的时代,异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)在治疗CML中的地位受到了严重的挑战.但是,迄今为止,allo-HSCT仍是唯一根治CML的手段.现对CML患者接受allo-HSCT治疗的时机选择以及影响移植疗效的相关因素进行了探讨,尤其对TKI在移植中的应用价值进行了叙述.     

BCR-ABL融合基因核酸检测试剂的研发及临床应用

目的研发同时检测多种BCR-ABL融合基因类型的试剂并建立相对应的荧光定量检测方法,同时进行临床标本检测。方法检索GeneBank等生物信息数据库,获得BCR-ABL基因可能的融合亚型,对亚型之间的序列进行比对并设计BCR-ABL融合基因特异性引物,从而应用质粒建立新的荧光定量体系。收集武汉大学人民医院2014年1月1日～11月31日住院部确诊为初发白血病患者30例,其中慢性髓细胞白血病15例,急性淋巴细胞白血病15例,另同时收集体检中心健康对照20例。应用新建立体系、商品试剂盒及直接测序法进行BCR-ABL融合基因的检测。结果新建荧光定量PCR体系准确度验证结果阳性符合率为100%,阴性符合率为100%;特异性验证结果各干扰项检测均为阴性;可检测11种融合基因类型。对BCR-ABL融合基因亚型e13a2,e14a2和e1a2的检测新方法阳性符合率为100%(10/10),阴性符合率为100%(5/5)。对稀有融合基因亚型e19a2检测新方法检测阳性率100%(2/2),商品试剂盒检测阳性率为0%(0/2)。新方法与直接测序法相比阳性符合率为100%(16/16),阴性符合率为100%(14/14)。结论以研发的BCR-ABL融合基因检测试剂而建立的荧光定量方法检测BCR-ABL融合基因与测序结果符合率为100%,是一种快速、可靠的检测方法,可应用于临床。     

BCR-ABL激酶区突变在酪氨酸激酶抑制剂耐药慢性髓性白血病患者中的分布及其影响因素

目的分析酪氨酸激酶抑制剂(TKI)耐药的慢性髓性白血病(CML)患者BCR-ABL激酶区突变状况、类型和影响因素。方法回顾性分析2001年6月至2019年9月就诊于北京大学人民医院并发生TKI耐药的CML患者的BCR-ABL激酶区突变状况。采用Sanger测序法检测BCR-ABL激酶区突变,二元Logistic回归模型进行多因素分析。结果共纳入804例CML患者,发生1 093例次TKI耐药,其中对伊马替尼、尼洛替尼、达沙替尼耐药分别为576(52.7%)、238(21.8%)、279(25.5%)例次。伊马替尼、尼洛替尼和达沙替尼耐药患者BCR-ABL突变检出率分别为50.5%、63.9%和57.3%,T315I突变检出率均最高,分别为12.3%、27.3%和34.1%。此外,检出率≥5%的突变类型在伊马替尼耐药患者中为Y253F/H(7.5%)和F359V/C/I(5.6%),在尼洛替尼耐药患者中为F359V/C/I(12.2%)、Y253F/H(11.8%)和E255K/V(10.5%),在达沙替尼耐药患者中为F317L/V/I/C(11.5%)和E255K/V(5.4%)。多因...     

用实时定量PCR检测慢性髓系白血病患者的bcr/ablP210融合基因转录本

目的　建立实时定量PCR(RQ PCR)检测慢性髓系白血病(CML)bcr/ablP210融合基因转录本,评价其在CML诊断和微小残留病(MRD)监测中的意义。方法　设计TaqMan探针和引物,建立RQ PCR法对b3a2和ABL阳性模板进行扩增,并检测22例CML患者bcr/ablP210转录本含量。结果　RQ PCR法最低可检测到 10个拷贝 /μl的阳性模板,但重复性较差,而 108 ~102 拷贝 /μl的重复性良好,正常对照无扩增信号。19例初诊CML患者bcr/ablP210转录本绝对含量为 1. 42×102 ~2. 24×105拷贝 /50ng(中位数量 3. 06×104 拷贝 /50ng),ABL纠正后的相对含量为 3% ~687% (中位数 147% )。2例患者骨髓移植后bcr/ablP210转录本下降, 1例患者由慢性期进展为加速期时含量显著增高。结论　RQ PCR方法敏感、可靠,可用于CML患者的诊断和MRD随访监测。     

酪氨酸激酶抑制剂 Herbimycin A 联合化疗药物对 K562 细胞凋亡的影响

目的：探讨慢性髓细胞白血病（ＣＭＬ）细胞抗凋亡机制和诱导ＣＭＬ细胞凋亡的有效方法。方法：采用Ｋ５６２细胞培养，观察酪氨酸激酶抑制剂ＨｅｒｂｉｍｙｃｉｎＡ（ＨＭＡ）联合化疗药物对ＣＭＬ细胞凋亡的影响，探讨ＨＭＡ对ＣＭＬ细胞的作用。结果：ＨＭＡ或化疗药物单独应用可抑制Ｋ５６２细胞增殖，但不能明显诱导其凋亡。ＨＭＡ能明显增强化疗药诱导Ｋ５６２细胞凋亡。加入外源性巯基化合物阻断ＨＭＡ与酪氨酸激酶的结合可完全取消这种作用。结论：ＨＭＡ通过抑制ＣＭＬ细胞内酪氨酸激酶活性促进细胞凋亡而增加对化疗药物的敏感性，表明酪氨酸激酶抑制剂作为治疗ＣＭＬ药物具有潜在的应用价值。     

筑巢式RT—PCR对急性早幼粒细胞白血病融合基因的初步检测与分析

应用筑巢式ＲＴ－ＰＣＲ检测了３０例急性早幼粒细胞白血病（ＡＰＬ）中因染色体易位ｔ（１５：１７）所形成的早幼粒白血病维甲酸受体α（ＰＭＬ－ＲＡＲα）融合基因转录本,结果发现：１００％的Ｍ患者均有ＰＭＬ／ＲＡＲα;两种亚型Ｍ３ａ和Ｍ３ｂ其ＰＭＬ／ＲＡＲα的转录本不同,Ｍ３ａ９４％为Ｌ型,Ｍ３ｂ８４％为Ｓ型。结论：ＲＴ－ＰＣＲ检测融合基因是一种特异性强、灵敏度高的新诊断手段,还可用于预后判断和病情随访。     

荧光原位杂交法检测慢性粒细胞白血病bcr基因重排

目的：检测慢性粒细胞白血病ｂｃｒ基因重排。方法：应用荧光原位杂交技术，以自行筛选和制备的酵母人工染色体为探针进行荧光原位杂交，检测慢性粒细胞白血病ｂｃｒ基因的重排。结果：用２２号染色体ｂｃｒ基因附近的ＹＡＣ７６５Ｅ３，在９例慢性粒细胞白血病中，发现５例慢性期患者，２例急变期患者和１例经α干扰素治疗后的患者存在ｂｃｒ基因重排，１例自体骨髓移植后患者的核型呈嵌合状态，即同时存在正常的和具有ｂｃｒ基因重排的核型。结论：ＹＡＣ７６５Ｅ３是一个有用的检测ｂｃｒ基因重排的探针，荧光原位杂交技术可能成为白血病治疗效果的监测和微量残留病检出的一种重要手段。     

数字PCR法检测血液EGFR基因T790M突变的评价

目的 使用血浆循环肿瘤DNA基因突变检测国家参考品,对EGFR基因T790M突变检测试剂盒（数字PCR法）的准确性、特异性和检测限的性能进行评价。方法 提取国家参考品的血浆游离DNA,并测定浓度。取不同浓度的EGFR基因T790M突变的游离DNA样本,加入装有ddPCR和ddPCR MIX3的PCR预混液的PCR管中,混匀后使用全自动样本处理系统进行微滴制备。将微滴转入96孔板内后,使用微滴式数字PCR系统的封膜仪和PCR仪进行封膜和PCR扩增。取PCR扩增样本,加至芯片中,使用生物芯片阅读仪读取结果。结果 对国家参考品中不同突变频率的EGFR基因T790M突变样本,试剂盒能够准确检出T790M突变。对国家参考品中EGFR基因其他突变的样本,试剂盒未检出T790M突变。试剂盒能够准确检测0.05%突变频率的国家检测限参考品。结论 EGFR基因T790M突变检测试剂盒（数字PCR法）具有很好的检测准确性、特异性和灵敏度,国家参考品具有很好的检测方法适用性。     

稳定表达bcr-abl融合基因片段的鼠SP2/0细胞系的建立

为了建立稳定表达bcr-abl融合基因片段的SP2/0细胞系,从重组克隆载体pGEMbcr-abl中酶切出bcr-abl融合基因片段,并将其亚克隆进逆转录病毒载体pLXSN中。脂质体介导重组逆转录病毒载体pLXSNbcr-abl转染包装细胞PT67,采用G418筛选后获得稳定产病毒的包装细胞。收集病毒感染NIH/3T3细胞,加G418筛选后进行逆转录病毒滴度的测定,计算病毒效价为2×107CFU/ml。结果表明,收集病毒上清感染SP2/0细胞(H-2d),经G418筛选获得了稳定表达bcr-abl融合基因片段的SP2/0细胞株。经特异性PCR扩增和RT-PCR反应扩增,从基因组整合和基因表达水平证实获得了能稳定表达bcr-abl融合基因片段的鼠SP2/0细胞系。结论:成功建立了表达bcr-abl融合基因的鼠SP2/0细胞系,这一肿瘤细胞模型可作为研究bcr-abl基因疫苗的有效实验工具,为检验bcr-abl基因疫苗激发小鼠CTL应答的研究奠定物质基础。     

慢性粒细胞白血病断裂点簇集区－abl融合基因的检测

应用改良的一步法ＲＮＡ提取方法分离慢性粒细胞白血病（慢粒）患者外周血或骨髓标本总ＲＮＡ，以慢粒急性红白血病变细胞株为阳性对照，急件早幼粒细胞性白血病细胞株为阴性对照，建立逆转录／套式聚合酶链反应（ＲＴ，套式ＰＣＲ）检测断裂点簇集区一ａｂｌ融合基因。第一次ＰＣＲ的灵敏度为１：１０￣４水平，第二次ＰＣＲ后灵敏度提高至１：１０￣５水平。特异性扩增产物经用地高辛素标记寡核苷酸探针Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交得到证实。     

急性髓细胞白血病M_（2b）型AML_1－ETO融合基因转录本的检测

急性髓细胞白血病（ＡＭＬ）－Ｍ＿（２ｂ）患者约９０％有ｔ（８；２１）。已经证明它导致ＡＭＬ＿１－ＥＴＯ融合基因。我们应用逆转录酶／聚合酶链反应（ＲＴ／ＰＣＲ）检测了２２例ＡＭＬ＿１－Ｍ＿（２ｂ）其中ｔ（８；２１）阳性１６例，阴性２例，不能确定有无ｔ（８；２１）的４例，发现全部２２例患者均可检出ＡＭＬ＿１－ＥＴＯ融合基因转录本。同时在５例ｔ（８；２１）阴性的ＡＭＬ中，包括Ｍ＿（２ａ）２例，Ｍ＿４２例，Ｍ＿３１例，均未检出上述融合基因转录本。我们的初步结果提示ＡＭＬ＿１－ＥＴＯ融合基因可以作为ＡＭＬ－Ｍ＿（２ｂ）的基因标志。     

ETV6-ABL融合基因在骨髓增殖性肿瘤造血细胞群中分布的研究

目的:探讨ETV6-ABL融合基因在不同细胞群体中的表达情况,以及酪氨酸激酶抑制剂对该融合基因的治疗效果.方法:报道了 1例42岁的患者,表现为粒细胞增多和慢性粒细胞白血病样骨髓象.使用real-time PCR方法检测融合基因,并测序确认.通过流式分选和real-time PCR方法,对分选后的外周血细胞各个细胞群中...