人血管内皮细胞生长因子重组腺病毒载体的构建、鉴定及在骨髓间充质干细胞的表达

目的构建人血管内皮细胞生长因子(VEGF)165腺病毒表达载体,体外转染大鼠骨髓间充质干细胞研究其相关特性。方法利用细菌内同源重组技术快速构建Ad-VEGF165腺病毒重组质粒,经酶切及测序鉴定正确后转染人胚肾细胞HEK293包装成为重组Ad-VEGF165腺病毒,并进行电镜观察及滴度测定。感染大鼠骨髓间充质干细胞观察VEGF165基因的转录和表达。结果酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒含有hVEGF165cDNA,电镜显示包装细胞中有大量病毒颗粒存在,测定包装的病毒滴度为6.3×1010TCID50/ml。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组织化学及免疫印迹检测骨髓间充质干细胞内有VEGF165的转录和表达。结论构建的VEGF腺病毒表达载体可有效感染骨髓间充质干细胞,并在体外高效表达,为将表达VEGF基因的骨髓间充质干细胞用于基因治疗提供了实验依据。     

缺氧诱导因子-1α基因转染人间充质干细胞的体内促血管生成作用

目的研究将缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因转染人间充质干细胞（hMSCs）的体内促血管生成作用，为促进组织工程骨血管化提供新的方法和策略。方法构建pIRES3／HIF-1α逆转录病毒载体，制备含目的基因的重组逆转录病毒，感染hMSCs。用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）法检测转基因hMSCs表达HIF-1α的水平，用免疫组织化学法检测转基因hMSCs在缺氧和常氧条件下HIF-1α蛋白的存在情况。体内促血管生成的实验分为两组：实验组采用转基因hMSCs，对照组采用未转基因的hMSCs。两种细胞分别接种到13d的鸡胚绒毛尿囊膜（CAM），3d后将CAM制片，在显微镜下观察并摄像。用图像分析方法测量并分析血管面积。结果转基因hMSCs中HIF-1α mRNA表达较未转基因的hMSCs明显增高。转染HIF-1α基因的hMSCs，缺氧条件下细胞核内HIF-1α能稳定存在；常氧条件下细胞核内HIF-1α不能稳定存在。图像分析结果显示实验组CAM较对照组CAM血管面积明显增多，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论HIF-1α基因能稳定转染到hMSCs并得到强制表达。转染HIF-1α基因的hMSCs有明显的促血管生成作用，对于促进组织工程骨的血管化有重要作用。     

HMGB1分子A-BOX的表达纯化及其促分化功能鉴定的研究

目的克隆人HMGB1 A-box的cDNA,构建高效稳定的大肠杆菌(E.coli)表达菌株并对其诱导表达纯化,同时探讨其对间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSC)的促分化作用。方法根据优选合成的HMGB1基因序列设计引物,PCR扩增目的基因片段,插入克隆载体pGEM-T并进行序列测定。重组克隆载体经BamHⅠ和XhoⅠ酶切,琼脂糖凝胶电泳分离目的基因,插入含His标签的表达载体pET24a。将构建的质粒转染BL21大肠杆菌,经IPTG诱导后,SDS-PAGE观察表达量。HIS-link层析柱纯化重组人HMGB1 A-box,蛋白印迹鉴定重组蛋白。将重组蛋白加入hBMSC培养体系中培养一周后,碱性磷酸酶染色检测其促MSC成骨分化作用。结果经RT-PCR扩增得到了261 bp的DNA片段,经测序分析,与GenBank中报道的已知序列完全一致,构建了含融合蛋白的重组表达质粒。经诱导后细菌高表达A-box,表达量为总蛋白的45%。经层析柱纯化后,蛋白印迹证实目的蛋白为高纯度的A-box。将A-box加入MSC培养体系中培养后,细胞活性无明显改变,但细胞碱性磷酸酶表达明显增高。结论成功构建了重组人HMGB1 A Box的表达载体,纯化的重组蛋白能有效促进MSC向成骨细胞分化。     

pEGFP-C1/Akt体外转染骨髓间充质干细胞后对血管内皮生长因子表达的影响

目的 克隆构建绿色荧光蛋白(GFP)-Akt表达载体,观察其在鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)中的表达和定位及其对(VEGF)mRNA和蛋白表达的影响.方法 采用酶切法将Akt重组于GFP表达载体pEGFP-C1中,经酶切序列鉴定后,将该重组质粒GFP-Akt及GFP空质粒通过脂质体法转染骨髓MSCs.荧光显微镜观察其转染率及在细胞中分布.分别采用用Western blot和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测pEGFP-C1和pEGFP-C1/Akt转染MSCs后蛋白和VEGF mRNA的表达.结果 GFP-Akt基因表达载体经酶切鉴定和测序分析确认构建成功,并在鼠MSCs中表达.荧光显微镜下pEGFP-C1转染后,绿色荧光均匀分布于细胞中,而pEGFP-C1/Akt转染后,绿色荧光分布于胞质中;与未转染组比较,pEGFP-C1转染组Akt mRNA和蛋白及VEGF mRNA和蛋白表达差异无统计学意义(P＞0.05);而pEGFP-C1/Akt转染组Akt mRNA和蛋白及VEGF mRNA和蛋白表达显著增加(P＜0.05).结论 成功构建GFP-Akt融合基因表达载体在鼠MSCs中表达;并可诱导AktmRNA及蛋白和VEGF mRNA和蛋白的表达.     

人血管内皮细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞对脂肪颗粒移植存活率的影响

目的 检测大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)经人血管内皮细胞生长因子(VEGF165)基因转染后,对脂肪颗粒移植存活率的影响.方法　利用FuGENE HD介导VEGF165基因体外转染SD大鼠BMSCs,与取自SD大鼠的脂肪组织混合后移植于大鼠背部,类似方法设立未转染组及DMEM液空白对照组.检测脂肪组织存活率及再生血管密度.结果　转染组存在外源性基因和蛋白的表达,脂肪组织存活率及再生血管密度高于未转染组,且两者均高于对照组.结论　转染VEGF165基因的BMSCs具有更强的促血管再生作用,可提高游离移植脂肪的存活率.     

携带人血管内皮细胞生长因子基因细菌内重组腺病毒转染兔骨髓基质干细胞的表达

目的应用高效细菌内同源重组系统pAd-Easy,制备含人血管内皮细胞生长因子121 (VEGF121)基因的重组腺病毒,感染兔骨髓基质干细胞(BMSCs),并检测外源基因的表达,为其进一步应用于血管化组织工程骨组织的构建打下基础。方法自pCDNA-VEGF121质粒中切取VEGF121基因,将VEGF基因克隆到穿梭质粒,在BJ5183细菌内重组,在293细胞中构建携带VEGF基因的重组腺病毒,将腺病毒感染BMSCs,利用ELISA、免疫组织化学的方法检测VEGF121在BMSCs中的表达。结果通过pAd-Easy系统成功构建高滴度的携带VEGF121基因重组腺病毒pAd-VEGF,ELISA检测显示经转染的BMSCs中VEGF121的表达均明显增强,随着感染病毒MOI值的增高,VEGF121的表达量相应增高,差异有统计学意义(P<0．01),免疫组化法显示经基因转染的BMSCs中有强阳性信号,未转染组出现阴性结果。结论Ad-VEGF转染BMSCs后能稳定提高VEGF蛋白的表达。     

高迁移率族蛋白1对人脐静脉内皮细胞骨架蛋白及通透性的影响

高迁移率族蛋白1（high mobility gmup box 1 pmtein, HMGB1）是一种重要的晚期炎症因子,参与急性胰腺炎的全身炎症反应,而急性胰腺炎患者血管内皮通透性增加是导致全身毛细血管渗漏、液体正平衡的直接原因。本研究观察了高迁移率族蛋白1（high mobility group box 1 protein, HMGB1）对体外培养的单层人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）细胞骨架和通透性的影响,现报告如下。     

血清HMGB1和TGF-β1在脊柱骨折脊髓损伤的意义

[目的]探讨血清高迁移率族蛋白1(HMGB1)、转化生长因子-β1(TGF-β1)在脊柱骨折脊髓损伤的参与机制和意义.[方法]2017年1月～2019年6月,60例脊柱骨折伴脊髓损伤患者作为复合损伤组,60例单纯脊柱骨折患者作为单纯骨折组,50例健康人为健康对照组,采用ASIA评级评价复合损伤组脊髓功能,检测血清HMG...     

高迁移率族蛋白1通过PINK1/Parkin介导的线粒体自噬促进骨髓干细胞的趋化及成骨分化

目的 探讨高迁移率族蛋白1（HMGB1）通过PTEN诱导假定激酶1（PINK1）/帕金蛋白(Parkin)介导的线粒体自噬对骨髓干细胞的趋化及成骨分化的影响。方法 将人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）分为7组：control组、siRNA-NC组、siRNA-HMGB1组、pcDNA-NC组、pcDNA-HMGB1组、pcDNA-HMGB1+siRNA-NC组、pcDNA-HMGB1+siRNA-PINK1组。采用Transwell检测细胞迁移能力;茜素红染色检测各组细胞中钙结节数目;ELISA检测骨桥蛋白（OPN）、碱性磷酸酶（ALP）的含量;RT-qPCR检测各组细胞中成骨细胞特异性转录因子（Osterix）、HMGB1及Runt相关转录因子2（RUNX2）、转录因子CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBPα）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）水平;透射电镜检测线粒体自噬小体数目;Western Blot检测hBMSCs中Parkin及微管相关蛋白1A/1B-轻链3（LC3Ⅱ/Ⅰ）、选择性自噬接头蛋白62（P62）和自噬关键分子酵母Atg6同系物（Beclin1）等线粒体自噬相关蛋白的表达。结果 HMGB1通过PINK1/Parkin介导的线粒体自噬对hBMSCs的趋化作用研究表明：与pcDNA-NC组相比,pcDNA-HMGB1组HMGB1表达、细胞迁移率、线粒体自噬数目及自噬相关蛋白Beclin-1、LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表达增加,Parkin、P62等蛋白的表达降低（P＜0.05）;与siRNA-NC组相比,siRNA-HMGB1组HMGB1表达、细胞迁移率、线粒体自噬数目及Beclin-1、LC3B-Ⅱ/Ⅰ等表达降低,Parkin、P62表达增高（P＜0.01）。HMGB1通过PINK1/Parkin介导的线粒体自噬对hBMSCs的成骨分化作用研究结果显示：与pcDNA-NC组相比,pcDNA-HMGB1组钙结节数量、Osterix及RUNX2含量、ALP及OPN的表达升高（P＜0.01）,PPARγ、C/EBPα的表达降低（P＜0.05）;与pcDNA-HMGB1+siRNA-NC组相比,pcDNA HMGB1+siRNA-PINK1组钙结节数量、Osterix及RUNX2含量、ALP及OPN的表达降低（P＜0.05）,PPARγ、C/EBPα的表达升高（P＜0.05）。结论 HMGB1高表达能通过PINK1/Parkin介导的线粒体自噬促进hBMSCs的趋化、成骨细胞分化及抑制成脂细胞分化,可能是骨质疏松症的潜在治疗靶点。     

临床剂量浓度透明质酸对骨髓间充质干细胞旁分泌及过表达VEGF165作用影响的实验研究

[目的]观察临床剂量浓度透明质酸干预骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)后对其生长、旁分泌和过表达VEGF165蛋白水平的影响。[方法]将细胞生长曲线测定与细胞分泌VEGF165水平测定均分为4组:A组(DMEM/F12),B组(HA),C组(HA+Ad-VEGF165),D组(Ad-VEGF165),每组6个复孔。采用密度梯度离心法分离BMSCs和流式细胞术并进行细胞表型鉴定。取第3代BMSCs做为实验对象,AdVEGF165转染BMSCs后和或与HA复合培养6 h,然后观察细胞形态、生长曲线、VEGF165分泌水平变化。[结果]各组细胞形态未见明显差异和变化;C组与D组细胞生长曲线OD值在第1⁵ d均高于A组与B组;A组(34.52±2.13)与B组(34.90±1.78)均有较低水平的旁分泌VEGF165蛋白,而Ad-VEGF165转然后的C组(1 487.29±36.08)与D组(1 474.48±49.13)VEGF165分泌水平明显增高,但两组差异无统计学意义,而与A组、B组相比较差异均有统计学意义。[结论]治疗剂量透明质酸钠对BMSCs生长、增殖、旁分泌及过表达VEGF165蛋白无明显影响。     

SDF-1/CXCR4调控Tip内皮细胞成血管效应的研究进展

基质细胞衍生因子－1 (stromal cell derived factor,SDF-1)是新近发现的一种趋化因子,SDF-1和趋化因子受体4 (CXC chemokine receptor 4,CXCR4)共同构成了特异性的SDF-1/CXCR4.血管内皮尖端细胞(endothelial tip cell)在新生血管的数量、分支及导向中发挥着重要作用.研究表明,SDF- 1/CXCR4轴对tip内皮细胞的行为和促血管形成起一定作用.本文就SDF- 1/CXCR4轴与Tip内皮细胞的关系及其促血管生成的机制做一综述.     

P311对人微血管内皮细胞1体外血管形成能力的影响及其分子机制

目的:探讨P311对人微血管内皮细胞1（HMEC-1）血管形成能力的影响及其可能的分子机制。方法:采用实验研究方法。取HMEC-1,按随机数字表法（分组方法下同）分为P311腺病毒组和空载腺病毒组,分别进行48 h相应转染后,采用细胞计数试剂盒8法检测培养1、3、5 d细胞增殖活性;划痕试验检测细胞划痕后6、11 h剩...     

联合转染人VEGF165和ANG-1双基因对大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的影响

[目的]研究联合转染入血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)和血管紧张素-1(ANG-1)双基因对大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)成骨分化潜能的影响.[方法]将本室构建的编码人VEGF165和ANG-1双基因腺病毒质粒pAd-VIA在QBI-293A细胞内进行包装和扩增,获得腺病毒载体pAd-VIA,将其体外转染大鼠BMSCs,应用诱导培养液定向诱导向成骨细胞分化.实验分为4组:A.腺病毒载体pAd-VIA转染BMSCs并诱导组;B.BMSCs诱导组;C.腺病毒载体pAd-VIA转染BMSCs组;D.单纯BMSCs组.通过碱性磷酸酶(ALP)染色和活性的测定、Ⅰ型胶原免疫荧光染色、茜素红染色来评价联合转染双基因对BMSCs成骨分化潜能的影响.[结果]重组腺病毒质粒pAdVIA在QBI-293A细胞内成功包装和扩增,有大量的绿色荧光蛋白表达,体外转染大鼠BMSCs后,A、B组的ALP染色、Ⅰ型胶原免疫荧光染色、茜素红染色为阳性,而C组和D组为阴性.ALP活性表达具有时间相关性,3 d开始表达,7 d到达高峰,在7、14 d,A、B组与C、D组之间ALP表达均具有统计学差异(P＜0.01),A组和B组之间,在各个时间点均无统计学差异(P＞0.05).[结论]腺病毒载体pAd-VIA转染大鼠BMSCs后,未明显影响其体外成骨分化潜能.     

重组血管内皮抑素对人食管癌细胞株抑制及对乏氧诱导因子-1α和血管内皮生长因子表达的影响

目的 观察重组血管内皮抑素(Endostar)对人食管癌细胞株EC9706细胞体外生长及对乏氧诱导因子-1 α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.方法 采用噻唑蓝(MTT)法检测不同浓度(12.5、25.0、50.0、100.0、200.0μg/L)Endostar对EC9706细胞增殖24、48、72 h的抑制率;免疫细胞化学和反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)实验分为不同浓度(25、50、100 μg/L)实验组和对照组,分别作用48 h后,检测Endostar作用后HIF-1α、VEGF蛋白和基因表达量的变化.结果 Endostar抑制EC9706细胞增殖,呈时间和浓度依赖性,200 μg/L Endostar作用72 h,其抑制率为46.78％;免疫细胞化学检测不同浓度(25.0、50.0、100.0 μg/L)实验组HIF-1α的平均吸光度值分别为0.115 ±0.009、0.089士0.011、0.056±0.009,VGFR的平均吸光度值分别为0.137±0.007、0.102±0.008、0.063±0.007,两者实验各组与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.01);RT-PCR检测不同浓度(25.0、50.0、100.0 μg/L)实验组HIF-1αmRNA的相对表达量分别为0.469±0.530、0.233±0.280、0.171±0.220,VEGF mRNA的相对表达量分别为0.304±0.410、0.199±0.520、0.071±0.310,两者与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05);Spearman相关分析显示HIF-1α和VEGF蛋白表达与其相应mRNA呈正相关(P＜0.05).结论 Endostar能够抑制EC9706增殖,其作用机制可能与进一步下调了HIF-1α和VEGF的表达有关.     

低氧诱导因子-1α对脊髓损伤后血管内皮生长因子表达的调控作用

目的　研究腺病毒 (Ad)介导的低氧诱导因子 1α(HIF 1α)基因对脊髓损伤后血管内皮细胞生长因子 (VEGF)蛋白表达的影响 ,为HIF 1α基因治疗脊髓损伤提供依据。方法　改良Allen’s法制作大鼠脊髓损伤模型。SD大鼠随机分为 4组 :假手术组 (Sham )、单纯脊髓损伤对照组(SCI)、空载体对照组 (Ad Blank)、基因治疗组 (Ad HIF 1α)。分别在第 1、3、7、14、2 8天 5个时间点取组织切片 ,HE染色观察大鼠脊髓细胞形态 ,免疫组织化学法检测HIF 1α和VEGF蛋白的表达。结果　 (1)HE染色显示 ,Ad HIF 1α组出血、坏死等损伤性改变比SCI及Ad Blank组轻 ,细胞残留数目相对增多 ,形态大致正常。 (2 )Ad HIF 1α组的HIF 1α、VEGF免疫阳性细胞吸光度值较SCI及Ad Blank组增加明显 (P <0 .0 5 ) ,表达时间延长。结论　腺病毒介导的HIF 1α基因转移可在体内有效表达。HIF 1α基因可促进脊髓损伤后VEGF蛋白的表达。转HIF 1α基因可减少大鼠脊髓损伤后细胞的死亡。     

重组pcDNA3.1-hBMP-2转染人骨髓基质干细胞和对其增殖及血管内皮生长因子表达的影响

目的构建人骨形成蛋白-2(hBMP-2)真核表达载体pcDNA3.1-hBMP-2,转染人骨髓基质干细胞(MSCs),探讨基因转染对其增殖和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响. 方法利用重组DNA和基因克隆技术构建重组载体pcDNA3.1-hBMP-2;细胞培养和基因转染技术体外转染人MSCs;免疫细胞化学、原位杂交和蛋白印迹法检测细胞BMP-2的表达;通过流式细胞仪和VEGF探针原位杂交分析其对细胞增殖和VEGF表达的影响. 结果转染后细胞在mRNA水平和蛋白质水平均表达BMP-2;转染后S期细胞比例增多,提示细胞DNA的合成增加;BMP-2基因转染上调细胞VEGF的表达. 结论在脂质体介导下,pcDNA3.1-hBMP-2转染MSCs获得成功.基因转染后能促进细胞增殖并将通过使VEGF的表达增加促进血管再生,为进一步骨缺损的基因治疗及构建组织工程骨奠定了实验基础.     

GH/IGF-1系统在BMSCs成脂分化过程中作用机制的实验研究

目的 研究温肾健脾、活血化瘀含药血清对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成脂分化作用过程中生长激素(GH)/胰岛素样生长因子1(IGF-1)系统的调节机制。方法 将40只SPF级雄性SD大鼠用随机数字表法分成4组,依次为正常组、成脂诱导组、温肾健脾组、活血化瘀组。对大鼠进行7 d灌胃,制备含药血清,按一定比例将含药血清与完全培养基进行配比用以BMSCs成脂分化的培养。油红O染色观察BMSCs成脂分化情况后,用ELISA法测定脂肪细胞中GH、IGF-1的蛋白水平。结果 GH蛋白表达水平结果：与正常组比较,成脂诱导组低于正常组,差异不具有统计学意义(P>0.05)。与成脂诱导组相比,温肾健脾组、活血化瘀组结果均优于成脂诱导组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。温肾健脾组与活血化瘀组相比,活血化瘀组结果优于温肾健脾组。(2)IGF-1蛋白表达水平结果：与正常组相比,成脂诱导组结果高于正常组,且差异具有统计学意义(P<0.05)。与成脂诱导组相比,温肾健脾组、活血化瘀组结果均低于成脂诱导组,且差异均具有统计学意义(P<0.05)。温肾健脾组、活血化瘀组相比,活血化瘀组结...     

HMGB1/Caspase-1/GSDMD信号轴介导肝细胞焦亡在肝脏缺血-再灌注损伤中的作用

目的  探讨高迁移率族蛋白1（HMGB1）/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-1/Gasdermin D（GSDMD）信号轴介导肝细胞焦亡在肝脏缺血-再灌注损伤（IRI）中的作用。方法  将C57BL/6小鼠随机分为假手术组（Sham组）、IRI 2 h组、IRI 6 h组、IRI 12 h组、甘草酸（GA）+Sham组和GA+IRI 12 h组（每组8只）;将AML12细胞大致均匀地分为Sham组、IRI 12 h组、GA+Sham组和GA+IRI 12 h组。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测各组小鼠血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、白细胞介素（IL）-1β和IL-6的水平;采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测肝组织中IL-1β和IL-6信使核糖核酸（mRNA）水平;比较各组小鼠肝脏缺血病理学评分和细胞凋亡情况;采用免疫组织化学（免疫组化）法检测各组小鼠肝组织中HMGB1的表达情况;采用蛋白质印迹法检测小鼠肝组织和AML12细胞中HMGB1、Caspase-1、GSDMD蛋白的表达水平。结果  与Sham组比较,IRI后各组小鼠血清中ALT、AST、IL-1β、IL-6水平,以及小鼠肝组织中的IL-1β、IL-6 mRNA相对表达量均升高（均为P < 0.05）,且随着再灌注时间的延长呈明显的时间依赖性。与Sham组比较,IRI后各组小鼠肝脏缺血病理学评分和肝细胞凋亡率均升高（均为P < 0.05）。免疫组化结果显示,IRI后HMGB1在肝组织中的表达明显增多,且在2~12 h内随着时间延长而增多。蛋白质印迹法结果显示,在体内和在体外,与Sham组比较,IRI 12 h组HMGB1、Caspase-1和GSDMD蛋白相对表达量均升高;与IRI 12 h组比较,GA+IRI 12 h组HMGB1蛋白相对表达量升高,Caspase-1和GSDMD蛋白相对表达量均降低,差异均有统计学意义（均为P < 0.05）。结论  肝细胞可能通过释放HMGB1激活Caspase-1/GSDMD通路,从而触发肝细胞发生焦亡,导致肝脏IRI,而通过GA抑制HMGB1的胞外释放可减轻肝脏IRI。