蛋白质组学在肝癌研究中的应用

蛋白质组学以细胞组织或器官表达的所有蛋白质为研究对象,通过双向凝胶电泳生物质谱技术及生物信息学等方法,达到分离、鉴定、分析蛋白质的目的.在我国肝癌死亡率高,位居第二,预后差.以蛋白质组学的方法,通过比较肿瘤与正常肝组织之间蛋白质组的表达差异,发现新的肝癌肿瘤标志物,寻找与肝癌发生、发展、转移的相关蛋白,为肝癌治疗提供新的靶点.     

宫颈癌新辅助动脉化疗敏感性相关蛋白质组的研究

目的利用蛋白质组学的方法研究宫颈鳞癌新辅助动脉化疗前后的差异表达蛋白,以期得到与宫颈癌化疗敏感性相关的蛋白质。方法选取巨块型宫颈鳞癌经新辅助动脉化疗有效的患者18例。其中8例通过双向凝胶电泳技术分离化疗前后的宫颈鳞癌组织的差异蛋白点,然后用基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱鉴定差异表达的蛋白质。在另外10例患者中用Western blot方法验证兴趣蛋白质Peroxiredoxin 1和Galectin-1在化疗前后的表达差异。结果建立了宫颈鳞癌有效组化疗前后蛋白差异表达的双向凝胶电泳图谱,发现化疗前后存在3倍以上量差表达的蛋白点共有116个(P<0.05),其中31个差异蛋白点通过质谱分析和数据库的检索得到了鉴定,其中化疗后表达上调的蛋白点有15个,表达下调的蛋白点有16个。West-ern blot方法验证了两个兴趣蛋白在化疗前后的表达差异。结论利用蛋白质组学方法可寻找到宫颈鳞癌新辅助动脉化疗敏感性相关蛋白,从而实现在化疗前预测肿瘤对化疗药物的敏感性,使患者得到更加有效的个体化治疗。     

常见舌苔蛋白质组学与生物信息学研究

目的运用蛋白质组学技术探讨不同舌苔的差异表达蛋白质。方法将观察对象根据有无各系统器质性疾病及舌苔表现,分为正常薄苔组、病理薄苔组、厚苔组和剥苔组,以固相pH梯度等电聚焦为第一相、垂直SDS-PAGE为第二相进行双向电泳,银染显色,计算机扫描,Image Master2D Platinum软件分析;选择差异点胶内胰酶消化后,进行MALDL-TOF-MS蛋白质质谱鉴定和生物信息学分析。结果四组舌苔组织可检测的蛋白质斑点数分别为（1 082±105）个、（1 052±85）个、（1 129±98）个、（1 143±140）个。差异蛋白质点肽质指纹的质谱鉴定和分析生物信息学分析结果,鉴定出13个舌苔密切相关蛋白质,其中cystatin B、cytokeratin 13和GAL7 protein为首次发现的舌苔变化相关蛋白,与舌苔发生发展的关系密切;并发现了5个新的舌苔相关未知蛋白,在目前国际蛋白质数据库中无收载,有必要进一步深入研究。结论不同病理舌苔与正常舌苔的蛋白质表达谱存在明显差异。     

重症急性胰腺炎患者血清差异蛋白质的表达

目的：用蛋白质组学技术比较重症急性胰腺炎（SAP）与轻症急性胰腺炎（MAP）患者血清的差异蛋白,探讨SAP特异蛋白的表达。方法：血清标本取自10例急性胰腺炎（AP）患者,其中5例SAP,5例MAP,用双向凝胶电泳检测两类患者的蛋白表达,并将这些差异表达蛋白点进行质谱鉴定,Mascot数据库检索。结果：比较双向电泳图谱发现15个差异表达蛋白点,经质谱分析,成功鉴定出10种蛋白质,在SAP患者其中4种表达上调,6种表达下调。数据库查询结果,4个表达上调蛋白分别为补体4A、结合珠蛋白亚型2、结合珠蛋白和载脂蛋白L1;6个表达下调蛋白分别为四连接素、谷胱甘肽过氧化物酶3、丝氨酸蛋白酶抑制剂亚型F1、丛生蛋白亚型-1、转甲状腺素蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂A1亚型2。结论：SAP患者血清有差异蛋白质表达,这可能和SAP发病机制相关。     

DADS诱导HL-60细胞分化的相关蛋白

目的研究二烯丙基二硫诱导人髓性白血病HL-60细胞分化过程中蛋白质组的差异表达。方法形态学观察和硝基四氮唑蓝还原反应鉴定DADS诱导HL-60细胞分化;运用蛋白质组学方法（双向凝胶电泳、质谱分析、生物信息学方法）分析鉴定差异表达的蛋白质。结果DADS诱导HL-60细胞分化后,形态发生明显变化,NBT还原能力明显增强。通过质谱分析和数据库搜索初步鉴定了18个差异表达的蛋白质点,其中galectin-10在处理组中表达上调,钙网硬蛋白前体则表达下调。结论galeetin-10表达上调、钙网硬蛋白前体表达下调与DADS诱导HL-60细胞分化有关。     

后纵韧带骨化症患者后纵韧带组织的蛋白质组学

[摘要]目的采用蛋白质组学方法分析、寻找后纵韧带骨化症(OPLL)的特异性蛋白标志。方法采用荧光差异双向电泳法研究OPLL患者及正常人韧带组织的双向电泳图像。采用飞行时间质谱进行鉴定并分析差异表达的蛋白质点。结果两组样本均得到约1 100个蛋白质点,50个点表达有改变。切胶获得45 个蛋白质点的肽段样本,质谱鉴定为21个蛋白质或肽段。其中15个血液蛋白,其余6个蛋白中4个表达下调;2个表达上调。RT-PCR检测表明烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖的激素脱氢酶, 伴肌动蛋白相关锚定蛋白及Ⅵ型胶原蛋白mRNA变化与电泳结果一致。结论这些差异表达蛋白可能是OPLL的特异表达蛋白。     

正常乳腺与乳腺癌核基质蛋白的双相电泳-飞行时间质谱研究

目的：应用比较蛋白质组学方法分析正常乳腺与乳腺癌组织的差异表达核基质蛋白,为人乳腺癌发病机制及其早期诊断的研究提供理论依据．方法：应用双相电泳（2-DE）每组分离4例乳腺组织核基质蛋白;应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）获得差异蛋白点的肽质量指纹图谱（PMF）;通过Mascot软件查询NCBI数据库鉴定蛋白质．结果：每张图谱约检测到900个蛋白质点,共发现27个差异表达蛋白,选择背景清晰、重复性及分辨率较好、蛋白表达差异明显的点进行质谱分析,结合表观分子质量及等电点,初步鉴定了12种蛋白质．结论：这些差异蛋白质部分有望成为乳腺癌诊断及治疗的分子标志物．     

蛋白质组学筛选抑癌基因CCDC19在鼻咽癌中的调控蛋白

目的本研究利用蛋白质组学筛选抑癌候选基因CCDC19在鼻咽癌中可能调控蛋白。方法提取CCDC19稳定高表达的鼻咽癌3D8和对照鼻咽癌C6细胞蛋白,并采用双向凝胶电泳(2D-PAGE)技术进行有效分离,图像扫描后获得高分辨率的2D-PAGE图谱。选用差异蛋白质组学技术筛选差异蛋白位点,然后用肽质量指纹谱(peptide mass fingerprinting,PMF)和数据库检索技术给予鉴定。荧光定量PCR和Western blot验证差异基因表达水平。结果质谱分析显示,FASN、CTSD和PGK1在CCDC19过表达的3D8细胞中表达下调,分别为-3.28、-1.64和-6.97倍。荧光定量PCR在mRNA水平验证了FASN、CTSD和PGK1以及Western blot在蛋白水平验证CTSD蛋白在3D8细胞中表达下调。结论 FASN、CTSD和PGK1可能是CCDC19在鼻咽癌中调控的靶基因。     

基于咳嗽模型小鼠相关差异蛋白表达探讨中医“肺与大肠相表里”研究

【目的】研究与分析"肺病及肠"——咳嗽模型小鼠结肠组织差异表达蛋白质,探讨肺与大肠病理上的相关性,以进一步提供中医"肺与大肠相表里"的物质基础。【方法】运用蛋白质组学技术,对正常对照组和咳嗽模型组小鼠结肠组织总蛋白质进行差异双向电泳(2D-DIGE),选择差异表达蛋白质斑点,进行MALDI-TOF/TOF质谱分析和生物信息学分析。【结果】筛选取出5个差异表达蛋白点,其中3个蛋白点在咳嗽组表达下调,2个蛋白点表达上调。经鉴定分别为肌动蛋白、血小板活化因子乙酰水解酶IBβ亚基、谷胱甘肽过氧化物酶1、5’(3’)-脱氧核糖核苷酸酶、过氧化物氧化还原化酶-6(Prdx-6)。【结论】肺病及肠咳嗽模型小鼠大肠组织可能存在氧化应激,Prdx-6基因或蛋白可能是肺与大肠之间沟通的"信号"。     

空间环境诱导褪色沙雷菌LCT-SM166的蛋白质组学分析

目的 分析和鉴定神舟八号飞船搭载褪色沙雷菌的差异表达蛋白质。方法 对神州八号飞船搭载的褪色沙雷LCTSM166及地面对照组LCT-SM213 进行分离并进行16sRNA 鉴定,采用同重同位素相对与绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ） 方法对褪色沙雷菌LCT-SM166 和LCT-SM213 进行蛋白质组质谱检测,分析两株菌的差异表达蛋白。结果 共鉴定到1 713 个蛋白质,LCT-SM166 与LCT-SM213 的差异蛋白组学分析发现了111 个蛋白质表达的改变,其中29 个蛋白表达上调,91 个蛋白表达下调。基因本体论（gene ontology,GO） 功能富集分析显示大多数差异蛋白质主要与能量代谢有关。结论 空间环境可影响褪色沙雷菌大量蛋白质的表达,差异表达蛋白主要分布在代谢相关过程。空间诱变菌株的蛋白质组学研究为后续贯穿组学的研究奠定基础。     

HepG2细胞蛋白质组双向电泳条件的优化与图谱的建立

目的：优化双向电泳的样品处理方法,建立HepG2细胞蛋白质双向电泳图谱。方法：用含10%胎牛血清的RPM11640培养液培养HepG2细胞,胰酶消化后收集细胞,加入细胞裂解液使细胞充分裂解,冰浴超声离心后取上清液进行双向凝胶电泳,电泳图谱经考马斯亮蓝染色及图像扫描与分析。结果：通过对HepG2细胞蛋白提取液进行双向电泳,在13 cm pH 3~10（L）IPG胶条上可分离到（297±23）个重复性及分辨率均较好的蛋白质点,蛋白斑点的匹配率为83%。结论：HepG2细胞蛋白质组双向电泳条件的优化及图谱的建立,为进一步研究肝癌蛋白质组学奠定了基础。     

Analysis of Proteomic Components of Sera from Patients with Uremia by Two Dimensional Electrophoresis and Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry

Summary： The different sera proteomic components between uremia patients and normal subjects were studied through two-dimensional gel electrophoresis technique. Immobilized pH gradient two- dimensional polyacrylamide gel electrophoresis （2DE）, silver staining, ImageMaster 2D 5.0 analysis software, matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry （MALDI-TOF-TOF-MS） and IPI human database searching were used to separate and identify the proteome of the sera from the patients with uremia. The results showed that satisfactory 2DE patterns of the serum proteins were obtained. Twenty-six protein spots showed significant difference in quantity in uremia patients, and 20 protein spots were identified by MALDI-TOF-TOF-MS. It was concluded that good reproducibility could be obtained by applying immobilized pH gradient 2DE to separate and identify the proteome in serum, which provided the foundation for the further study on uremia toxins oertaining to orotein.     

不同分化喉鳞状细胞癌蛋白质组差异表达的研究

目的 研究不同分化程度喉鳞状细胞癌黏膜组织蛋白质组的差异表达.方法 用固相pH梯度双向凝胶电泳分离不同分化程度喉癌黏膜组织总蛋白质,行考马斯亮蓝染色,Image Master 2D软件分析所获得的双向凝胶电泳图谱,找出差异表达的蛋白质点.结果 获得分辨率和重复性均较好的双向凝胶电泳图谱,发现13种蛋白质与喉癌分化密切相关.其中有7种蛋白质在高分化喉癌组织中表达上调,6种蛋白质表达明显下调.结论 利用固相pH梯度双向凝胶电泳技术分离不同分化喉鳞状细胞癌黏膜组织总蛋白质,建立了重复性较强的不同分化喉鳞状细胞癌黏膜组织蛋白质组表达图谱,且两者蛋白质的表达明显不同,可能与喉癌不同分化程度的发病机制有关.     

吗啡耐受大鼠脊髓蛋白质组双向电泳图谱的建立与差异蛋白鉴定

目的：建立吗啡耐受大鼠腰段脊髓组织蛋白质组双向凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)图 谱,比较分析吗啡耐受大鼠腰段脊髓组织中蛋白质组的变化和差异表达,鉴定出差异表达的蛋白质点并进行验证。 方法：将16只鞘内置管雄性SD大鼠随机分为吗啡耐受组(MT组,n=8)和生理盐水组(NS组,n=8),取其腰段脊髓组织 蛋白以固相pH梯度等电聚焦(immobilized pH gradients isoelectric focusing,IPGIEF)为第一向,十二烷基硫酸钠-聚丙烯 酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electroporesis,SDS-PAGE)为第二向进行2-DE,应用PDQuest分析 软件对考马斯亮蓝染色的2-DE图谱进行图像分析,对差异蛋白质点进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrixassisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)分析,并利用Mascot查询软件搜索Swiss- Prot数据库进行生物信息学分析。采用蛋白质印迹法验证部分差异蛋白。结果：MT组和NS组大鼠脊髓组织2-DE图谱 中各分离出约1 000个清晰的蛋白质点,其中明显差异表达的蛋白有36个。采用MALDI-TOF-MS分析,并利用Mascot查 询软件搜索Swiss-Prot数据库,共搜索到14个蛋白质,与NS组比较,MT组中表达下调的蛋白质点有2个,表达上调的 蛋白点有12个。采用蛋白质印迹法对其中的NADH脱氢酶及伽玛烯醇化酶蛋白质点进行验证,结果与蛋白质组学结 果一致。结论：初步建立了吗啡耐受大鼠脊髓组织蛋白质组双向电泳图谱,证明吗啡耐受可以引起脊髓中多种蛋白 质的表达改变。     

海洛因成瘾和正常大鼠前额叶皮质差异蛋白的分离与鉴定

目的 建立和比较海洛因成瘾与正常大鼠前额叶皮质(PFC)蛋白质双向电泳图谱,寻找和鉴定海洛因成瘾大鼠PFC中的差异蛋白表达谱.方法 以固相pH梯度等电聚焦为第一向和垂直SDS-PAGE为第二向,分别对正常对照大鼠和海洛因成瘾大鼠的PFC蛋白质样品进行二维分离,2-D图谱经ImageMaster 2D 5.0软件分析,选取7个差异蛋白点用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱/串联质谱进行鉴定.结果 经肽指纹图谱和串联质谱分析,并在NCBInr数据库检索,选取的7个蛋白点被成功鉴定为5种蛋白:成瘾组特有的是葡萄糖调节蛋白58和26 s蛋白酶复合体亚基p40.5;成瘾组含量下调的蛋白是ATP合酶D链;Ndufa10和α-烯醇化酶在两组中发生相对分子质量和(或)等电点迁移.结论 双向电泳结合质谱分析初步鉴定了大鼠前额叶皮质中与海洛因成瘾和神经毒性相关的差异蛋白,为进一步深入研究其病理机制奠定了基础.     

T1期声门区喉癌差异蛋白质组学的初步分析

目的采用差异蛋白质组学分析声门区T1期喉癌患者术前与术后血清蛋白质组,寻找靶标蛋白。方法提取声门区T1期喉癌患者术前与术后血清蛋白质,二维凝胶电泳分离后,利用ImageMaster软件寻找差异蛋白点,通过质谱鉴定差异表达蛋白质,Western Blot检测其结果的表达。Elisa试剂盒检测患者及对照组血清丙二醛(MDA)和超氧化物岐化酶(SOD)表达水平。结果共鉴定T1期声门区喉癌患者术前与术后差异蛋白质12个,其中6个蛋白质在术前样本组上调表达,而与术后组差异无统计学意义(P>0.05)。术前组MDA表达水平高于对照组与术后组(P<0.01),SOD表达水平低于对照组(P<0.05)。结论氧化应激和免疫反应相关蛋白质在T1期声门区喉癌检测与治疗中具有潜在重要作用,差异蛋白质对于反应T1期声门区喉癌病理进程具有一定的研究意义。     

Establishment and Preliminary Application of Two dimensional Electrophoresis and Mass Spectrometry in Ovary Study

Objective To apply two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry in the ovary proteome research Methods Protein extractions from mouse ovaries were run in IPGphor isoelectric focus system with 11 cm and 24 cm IPG strips respectively (pH 3～10, 0.3 mm thick), then the protein spots were identified by mass spectrometry. Results The ovary protein exactions separated by two-dimensional electrophoresis have got high resolution, and identifing protein by mass spectrometry was highly efficient and facilitly. These two techniques should facilitate further investigation of female reproduction proteome research. Conclusion These two rapid high resolutions and efficient techniques have a variety of applications foreground in female reproduction proteome pattern research.     

应用激光捕获显微切割技术纯化的鼻咽癌蛋白质表达谱的建立

目的：建立鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)蛋白质表达谱,为NPC蛋白质组学研究奠定基础。方法：应用激光捕获显微切割（laser capture microdissection,LCM）技术从NPC组织纯化NPC细胞,应用二维凝胶电泳（2-DE）分离LCM 纯化NPC细胞的蛋白质,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定蛋白质,利用生物信息学资源构建NPC的2-DE蛋白质组数据库。 结果：建立了NPC蛋白质2-DE参考图谱,2-DE图谱共显示（1 312±30）个蛋白质点,共鉴定了427个蛋白质点,包括241个非冗余蛋白质,并构建了NPC的2-DE蛋白质组数据库,这些数据可从本实验室网站(http://www.xyproteomics.org)上进行查询。结论：首次建立了LCM纯化NPC细胞2-DE蛋白质表达谱,为NPC蛋白质组学研究提供了重要的信息和资料。     

尿蛋白组学在儿童微小病变型肾病综合征中的初步研究

目的研究儿童微小病变型肾病综合征尿蛋白组分析所需的固相pH梯度等电聚焦双向电泳及相关技术。方法冷丙酮萃取肾病综合征患儿尿蛋白，去除白蛋白等高丰度蛋白，以固相IPG pH梯度等电聚焦为第一向，SDS均一胶（10．00％）的垂直电泳为第二向，银染后PDQuest软件进行分析，质谱分析。结果成功地得到儿童微小病变型肾病综合征尿蛋白双向电泳图谱。PDQuest7．3软件进行图像分析，检测到400个蛋白点。正常尿蛋白检测到112个蛋白点。肾病综合征与正常尿蛋白图谱相比差异蛋白表达明显的有20个，质谱鉴定出5个蛋白，分别是Alpha-1-antitrypsin、PITPNB、Zn-alpha-2-glycoprotein、Haptoglobin和Alpha-1B-glycoprotein。结论用尿蛋白组学对儿童微小病变型肾病综合征的尿液进行研究是可行的。     

肺癌组织蛋白质组双向凝胶电泳方法的建立和优化

目的建立和优化肺癌组织蛋白质组双向凝胶电泳(2-DE)技术,获取高分辨率、重复性好的蛋白质2-DE图谱。方法提取肺癌组织蛋白,以固相pH梯度胶条做第一向等电聚焦电泳,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)为第二向,在上述过程中分别对蛋白提取、等电聚焦电泳和凝胶染色进行控制和优化,利用ImageMaster 2Dplatinum 6.0分析软件获得二维凝胶图像。结果实验重复3次,共获15幅二维凝胶图像,平均蛋白质点数为1 137±57;随机选取1例标本的2幅图像,利用软件对2幅图像中蛋白点进行匹配,匹配率为90.4%。结论优化肺癌组织蛋白质组2-DE技术可获得高分辨率、重复性好的蛋白质2-DE图谱,为开展肺癌组织蛋白质组学研究打下基础。