细胞色素P-450 4F新基因分离与序列分析

已发现人类细胞色素Ｐ４５０氧化酶４Ｆ的两个基因。现报道从人类肝脏中分离出的新基因。１．材料与方法：应用ＰＣＲ从Ｃｌｏｎ－ｔｅｃｈ公司的ＭａｒａｔｈｏｎＲｅａｄｙｃＤＮＡ中分离出人胎肝一个ｃＤＮＡ克隆，用ＡＢＩ３７７型测序仪对ｃＤＮＡ进行双方向测序。从已知序列中合成一对特异引物，以成人肝组织总ＲＮＡ为模板行逆转录ＰＣＲ，同时用该引物对成人肝脏。ＤＮＡ文库进行筛选。将ｃＤＮＡ重组于ＥＳＰ酵母表达载体中。在ＥＭＭ酵母培养液中合成ＧＳＴ溶合蛋白，纯化后经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ胶电泳、染色。２．结果：ｃＤＮＡ全…     

自发性高血压大鼠胸腺中胰岛素-I基因的表达降低

目的为了研究自发性高血压大鼠（ＳＨＲ）胸腺功能异常的分子机制,我们用ｃＤＮＡ代表性差异分析ｃＤＮＡｒｅｐｒｅｓｅｎ－ｔａｔｉｏｎａｌｄｉｆｅｒｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ（ＲＤＡ）技术比较了ＳＨＲ与其正常血压对照（ＷＫＹ）大鼠二者胸腺基因表达的差异。方法用ｃＤＮＡ代表性差异分析技术比较了ＳＨＲ和ＷＫＹ大鼠胸腺基因表达的差异。差异表达的ｃＤＮＡ接入Ｔ—载体进一步进行差异筛选。挑选阳性克隆进行测序并用ＢＬＡＳＴ软件进行同源性分析。最后用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交分析验证差异筛选的结果。结果挑选了４个差异筛选的阳性克隆进行测序,序列同源性分析表明它们均与胰岛素－Ｉ基因序列高度一致。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交结果证实了胰岛素－Ｉ基因在ＳＨＲ胸腺中表达降低。结论运用ｃＤＮＡ代表性差异分析技术,结合差异筛选方法,本文观察到ＳＨＲ胸腺中胰岛素－Ｉ基因表达降低,提示局部微环境中的胰岛素缺乏在ＳＨＲ胸腺细胞的发育异常中可能起一定的作用。     

自发性高血压大鼠胸腺中胰岛素—Ⅰ基因的表达降低

目的 为了研究自发性高血压大鼠（ＳＨＲ）胸腺功能异常的分子机制，我们用ＣＤＮＡ代表性差异分析ＣＤＮＡｒｅｐｒｅｓｅｎ－ｔａｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ（ＲＤＡ）技术比较了ＳＨＲ与其正常血压对照（ＷＫＹ）大鼠二者胸腺基因表达的差异。方法 用ＣＤＮＡ代表性差异分析技术比较了ＳＨＲ和ＷＫＹ大鼠胸腺基因表达的差异。差异表达的ＣＤＮＡ接入了一载体进一步进行差异筛选。挑选阳性克隆进行测     

鼠人肝再生增强因子的cDNA克隆及序列分析

目的克隆大鼠及人肝再生增强因子的ｃＤＮＡ．方法按文献报道大鼠及人肝再生增强因子核苷酸序列设计合成引物．利用ｍＲＮＡ抽提试剂盒分别从乳鼠及人胎肝组织中提取ｍＲＮＡ，再逆转录聚合酶链反应扩增出需要的ｃＤＮＡ片段，经克隆入ｐＧＥＭＴ质粒后以Ｔ７ＤＮＡ聚合酶序列分析试剂盒测定ｃＤＮＡ的序列．结果经ＲＴＰＣＲ反应顺利扩增到４７０ｂｐ的鼠肝再生增加因子ｃＤＮＡ及３８４ｂｐ的人肝再生增强因子．结论所得到的ｃＤＮＡ序列与文献报道一致     

人反义igf-Ⅱ基因真核表达载体pIGF-ⅡAs的构建

目的人反义ｉｇｆⅡ基因真核表达载体的构建．方法ＰＣ／ｇｅｎｅ软件分析并设计人ＩＧＦⅡｃＤＮＡＢ区域，化学合成并得到人ＩＧＦⅡｃＤＮＡ克隆于原核载体ｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋），将之反向连接到逆转病毒表达载体ｐｃＤＮＡ３．经定向设计，将ＩＧＦⅡ反义基因插入真核载体，ｐｃＤＮＡ３中．结果经ＤＮＡ双链测序证明，克隆的人ＩＧＦⅡｃＤＮＡ序列与设计完全一致，构建所得反义ＩＧＦⅡ真核载体ｐＩＧＦⅡＡｓ，经Ｄｏｔｂｌｏｔ，ＰＣＲ鉴定结果正确．结论为小片断的基因合成与克隆提供了简捷可靠的方法，得到了反义ｉｇｆⅡ基因真核表达载体，为肝癌的反义基因治疗提供了基础     

肾脏特异性基因与谷胱甘肽-s-转移酶融合蛋白的制备

器官的形成发育受特异性基因表达产物的控制 ,尽管近年来对这些基因的研究取得了一定成果 ,但仍有许多参与这种过程的特异性基因未知。鼠肾脏特异性基因 (ｋｉｄｎｅｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃｇｅｎｅ ,ＫＳｇｅｎｅ)于 1998年被克隆 ,ＫＳ基因仅在成熟肾组织中表达 ,ｃＤＮＡ为2 4 2 6ｂｐ ,包含一个编码 572个氨基酸的开放阅读框 ,研究表明 ,ＫＳ基因编码产物氨基酸序列与高血压相关ＳＡ基因编码产物的相似性为 70 % [1] 。有学者推测ＫＳ和ＳＡ基因属至今功能尚未知的哺乳动物ＡＭＰ 结合酶家族[2 ] 。本研究拟获得成年大鼠部分ＫＳ基因序列和…     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因在大肠杆菌中的表达

自 196 1年Ｊｅｖｏｎｓ首次报道了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (ＭｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎＲｅｓｉｓｔａｎｔＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓＡｕｒｅｕｓ ,ＭＲＳＡ)以来 ,ＭＲＳＡ在世界许多国家和地区相继出现 ,特别是近几年 ,其所致的感染迅速上升[1] 。ＭＲＳＡ的耐药机制虽未完全阐明 ,但已证实与细菌产生的一种新的青霉素结合蛋白2ａ(ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ 2ａ ,ＰＢＰ2ａ)密切相关。ＰＢＰ2ａ是由染色体ｍｅｃＡ基因编码 ,目前已获得了该基因的克隆 ,其序列也已发表[2 ] 。本研究应用聚合酶链反应及基因重…     

弓形虫P30基因MBP融合蛋白的表达

目的　构建弓形虫主要表面抗原Ｐ３０ 基因的原核表达载体并在Ｅ－ｃｏｌｉ 中表达。方法　根据已发表的弓形虫Ｐ３０基因序列,自行设计合成一对引物并在引物５’端分别引入限制性内切酶ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ酶切位点,用ＰＣＲ技术从弓形虫ＲＨ 株基因组ＤＮＡ中扩增Ｐ３０ 基因片段,插入ｐＭＡＬＰ２ 质粒转化大肠杆菌ＤＨ５ａα感受态细胞,于氨苄ＬＢ培养平板上筛选阳性克隆,经过酶切及ＰＣＲ扩增鉴定重组子。将阳性重组子经ＩＰＴＧ诱导表达,ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ及免疫印迹分析。结果　从弓形虫ＲＨ 株ＤＮＡ中扩增出９７６ｂｐ 的Ｐ３０ 基因,构建成功ｐＭＡＬＰ２ － Ｐ３０ 重组质粒;ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ电泳及Ｗｅｓｔｅｒｎ － ｂｌｏｔ 显示ＭＢＰ／Ｐ３０ 融合蛋白条带的分子量约为７７－５ｋＤ,减去ＭＢＰ的分子量４３ｋＤ,得出Ｐ３０ 蛋白分子量为３４－５ｋＤ,且能被弓形虫高免鼠血清识别。结论　从弓形虫基因组ＤＮＡ中获取Ｐ３０ 基因,并成功构建ｐＭＡＬＰ２ － Ｐ３０ 重组质粒,诱导表达了Ｐ３０ 的融合蛋白。为进一步Ｐ３０ 蛋白的分离纯化及其对动物的免疫原性研究作好准备。     

日本血吸虫中国大陆株重组脂肪酸结合蛋白(sj-FABPc)的特性和抗原表位的分析

目的 了解重组的日本血吸虫中国大陆株脂肪酸结合蛋白（ｒＳｊ－ＦＡＢＰｃ）的特性及预测其抗原表位。方法 以ＰＣＲ方法从Ｓｊ－ｃＤＮＡ文库中扩增Ｓｊ－ＦＡＢＰｃ基因片段,并亚克隆于载体ｐＧＥＭ－Ｔ,对其核苷酸序列进行测定。以ＧＯＬＤＫＥＹ软件和Ｓｗｉｓｓ－Ｍｏｄｅｌ数据库分析Ｓｊ－ＦＡＢＰｃ的核苷酸序列和其编码的蛋白质特性,预测重组抗原的表位。结果 核酸序列分析证明,克隆基因确为Ｓｊ－ＦＡＢＰｃ,并由     

人类心包心钠素基因转录和表达

心包的功能是保护心脏和减少心脏搏动时的摩擦，是否还有内分泌功能。为此我们实验以ｐＢＲ３２２为血浆心钠素（ＡＮＦ）质粒载体，将７５０ｂｐ的ｒ－ＡＮＦｃＤＮＡ克隆到ＰｓｔＩ位点上，制备ｒ－ＡＮＦｃＤ－ＮＡ，经异硫酸氰胍制备法提取大鼠心房和人心包总ＲＮＡ。应用分子杂交技术，将α－３２Ｐ标记的大鼠心房ｃＤＮＡ与ＲＮＡ进行分子杂交。本实验证明，人类心包存在ＡＮＦ基因转录和表达，心包组织也存在ＡＮＦ。提示人类心包除已知功能外，尚具有重要的肽类激素内分泌功能。     

错配修复基因hMSH2与突变p53在散发性消化道肿瘤中的表达

人类ＤＮＡ错配修复系统 (ｍｉｓｍａｔｃｈｒｅｐａｉｒｓｙｓｔｅｍ ,ＭＭＲ )是由一系列特异性修复ＤＮＡ碱基错配的酶分子组成 ,此系统的存在 ,能避免遗传物质产生突变 ,保证ＤＮＡ复制的高保真度[1] 。ｈＭＳＨ2是目前研究较广泛的ＤＮＡ错配修复基因 ,它的失活可导致ＤＮＡ错配修复能力的降低 ,引起微卫星不稳定性 (ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ,ＭＳＩ) ,可使癌基因激活或抑癌基因失活 ,诱发细胞癌变[2 ] 。我们对 30例散发性消化道肿瘤ＤＮＡ上ｈＭＳＨ2基因与肿瘤组织中突变ｐ5 3的表达进行研究 ,以探讨ｈ…     

中国幽门螺杆菌vacA基因的等位变异

目的 明确中国幽门螺杆菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ,Ｈｐ）全长ｖａｃＡ基因的等位变异及其与西方主要菌株基因序列的差异。方法 从５例胃病患者胃黏膜粘栓组织中分离培养２２个单个Ｈｐ克隆,以Ｗｅｓｔｅｒｍ ｂｌｏｔ确定ｖａｃＡ表型特点,以体外细胞毒性试验研究其活性。然后选择５株有代表性的克隆进行基因组ＤＮＡ抽提、ＰＣＲ扩增及ｖａｃＡ基因全序列测定、分析。结果 ５株中４株ｖａｃＡ表达阳性。只     

中国人极低密度脂蛋白受体基因的克隆及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

为了研究极低密度脂蛋白受体结构与功能的关系,本文利用反转录聚合酶链反应技术从中国人心肌组织中克隆出极低密度脂蛋白受体的全长ｃＤＮＡ后,将其插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３获得重组体ｐＣＤ－ＶＲ。测序结果发现,这一源于中国人的极低密度脂蛋白受体基因ｃＤＮＡ的碱基序列与文献报道基本相符,反转录聚合酶链反应检测证实,转染ｐＣＤ－ＶＲ的中国仓鼠卵巢细胞可有效表达极低密度脂蛋白受体ｍＲＮＡ。脂蛋白结合实验结果发     

脑梗塞患者载脂蛋白B基因3′端小卫星区的多态性研究

采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）对８４ 例动脉粥样硬化性脑梗塞（ＡＣＩ）患者（ＡＣＩ组）的载脂蛋白Ｂ（ａｐｏＢ）基因３′端小卫星区（ＭＳＲ）的ＤＮＡ多态性进行研究,并与１０７ 例正常人（对照组）进行比较。结果两组ａｐｏＢ基因３′端等位基因分布频率均以ＭＳＲ３７ 和ＭＳＲ３９ 最高,ＡＣＩ组分别为０．４８、０．１９,对照组分别为０．５０、０．１７,且ＡＣＩ组的大拷贝等位基因（ＭＳＲＢ）分布频率增高。组内及组间分析显示,ＭＳＲＢ与血清ａｐｏＢ以及ＬＤＬ－ｃｈ 增高有关;３′端ＭＳＲ等位基因是已知ａｐｏＢ基因的有用标记;大片段ＭＳＲ等位基因与ＡＣＩ有相关性,支持不同拷贝数目的基因多态性可影响血脂水平代谢;位于ａｐｏＢ３′端的ＭＳＲ等位基因的多态性,可能是动脉粥样硬化多源性病因的一部分,其可能涉及病理过程中胶原暴露及内皮损伤,并共同参与ＡＣＩ的发病。     

转染血管紧张素Ⅱ受体（AT1）反义核苷酸对血管平滑肌细胞增殖的 …

目的：评价转染ＡＴ１我核菩酸（ＡＴ１Ａ）对血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣｓ）血管紧张Ⅱ（ＡｎｇⅡ）受体亚型ｍＲＮＡ表达、蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）、丝裂素活化蛋白激酶Ｐ＾３８（Ｐ＾３８ＭＡＰＫ）蛋白表达,及蛋白核酸合成的作用。方法：ＲＴ－ＰＣＲ克隆ＡＴ１ ｃＤＮＡ序列（４７６ｂｐ）,将克隆的ＡＴ１ ｃＤＮＡ反向插入ＰｃＤＮＡ３．１,构建一完整的含ＡＴ１Ａ的质粒（ＰＡＴ１Ａ）,测序鉴定。转染培养的大鼠ＶＳＭＣｓ     

腺病毒介导血管紧张素Ⅱ2型受体基因转染表达抑制血管平滑肌细胞迁移

血管平滑肌细胞 (ＶＳＭＣ)内膜下迁移是血管成形术后再狭窄主要成因之一 ,血管紧张素Ⅱ 2型受体 (ＡＴ2Ｒ)可能介导抑制ＶＳＭＣ迁移的作用。本研究用腺病毒介导方法使ＶＳＭＣ转染表达ＡＴ2Ｒ ,并研究ＶＳＭＣ迁移所受到的影响。一、材料与方法1 ＡＴ2ＲｃＤＮＡ的腺病毒载体采用同源重组的方法构建。ＡＴ2ＲｃＤＮＡ(1 0 9ｋｂ)与穿梭质粒载体ｐＡＣＣＭＶｐＬｐＡ连接构成重组子ｐＡＣＣＭＶ ＡＴ2Ｒ ,用脂质体介导其与ｐＪＭ17一起转染 2 93细胞 ,进行同源重组产生带有ＡＴ2Ｒ基因的重组腺病毒载体 (ＡｄＣＭＶ ＡＴ2Ｒ) ,用该载体再转…     

毒蕈样乙酰胆碱受体基因在大鼠胃粘膜表达的检测

目的：检测了毒蕈样乙酰胆碱Ⅰ（ＭＲ１）和Ⅲ型受体（ＭＲ３）基因在大鼠胃粘膜的表达情况。方法：ｐＳＰ７３和ｐＳＰ７２质粒分别含有ＭＲ１和ＭＲ３ｃＤＮＡ，其用ＥｃｏＲⅠ或ＨｉｎｄⅢ线性化后，加入逆转录反应体系中制备地高辛标记的ｃＲＮＡ受体探针。胃粘膜ＭＲ１和ＭＲ３ｍＲＮＡ的定位检测采用原位杂交免疫组织化学方法。结果：ＭＲ１和ＭＲ３ｍＲＮＡ仅在大鼠胃粘膜固有层细胞表达，粘膜上皮细胞（腺体细胞）上无阳性的ＭＲ１和ＭＲ３ｍＲＮＡ杂交信号表达。结论：提示，胃粘膜上皮细胞（包括壁细胞和主细胞）可能缺乏乙酰胆碱受体，乙酰胆碱对胃酸分泌的刺激调节作用，可能是通过粘膜固有层的免疫细胞（淋巴细胞）介导的     

猪囊尾蚴cDNA表达文库构建及抗原基因筛选

采用Ｑｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ ｍ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ 试剂盒提取猪囊尾蚴ｍ ＲＮＡ;Ｔｉｍ ｅ－ Ｓａｖｅｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ试剂盒反转录合成双链ｃＤＮＡ,并在末端加上ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩａｄａｐｔｏｒ,修饰后的ｃＤＮＡ 与λｇｔｌｌＥｃｏＲＩ臂连接,体外包装为λ噬菌体颗粒;感染Ｅ．ｃｏｌｉＹ１０９０ 构建成功库容量为２×１０６、重组率为８０％ 的ｃＤＮＡ表达文库。利用兔抗猪囊尾蚴虫体抗原和囊液抗原血清分别对一部分文库进行免疫印迹筛选,分别获得８ 个阳性克隆。提取阳性克隆ＤＮＡ,利用ＰＣＲ法从重组噬菌体ＤＮＡ中扩增出ｃＤＮＡ片段,长度自４００—９００ｂｐ。本文工作为研制猪囊尾蚴核酸疫苗打下了基础。     

自发性高血压大鼠肌肉注射心钠素基因的降压作用

目的：研究骨骼肌注射重组的人心钠素（ＡＮＦ）基因对高血压动物的降压效应及机制。方法：用反转录酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）从人胚胎脑组织克隆出全长人ＡＮＦ互补脱氧核糖核酸（ｃＤＮＡ），并将其重组进质粒ｐｃＤＮＡ３，形成重组质粒ｐｃＤＮＡ３／ＡＮＦ。给５周龄（幼年）和１１周龄（成年）卒中易感型自发性高血压大鼠（ＳＨＲｓｐ）的股四头肌分别注入２００μｇ和６５０μｇｐｃＤＮＡ３／ＡＮＦ，并用放射免疫分析、ＲＴ－ＰＣＲ、Ｗｅｓｔｅｒｎ杂交和免疫组化技术检测人ＡＮＦｃＤＮＡ在体内的表达。每周测血压１次。最后在麻醉下收集尿和血，测定某些生化参数。结果：一次肌肉注射人ＡＮＦｃＤＮＡ可明显延缓幼年ＳＨＲｓｐ的血压升高；能降低成年ＳＨＲｓｐ的血压达２．７～４．０ｋＰａ（２０～３０ｍｍＨｇ），并伴有血浆ＡＮＦ浓度的明显升高及尿量、尿钠排泄的增加，局部肌肉组织的信使核糖核酸（ｍＲＮＡ）和ＡＮＦ表达阳性。结论：肌肉注射人ＡＮＦ基因可引起ＳＨＲｓｐ的持续性血压下降，显示了人ＡＮＦ基因对高血压患者降压治疗的可能性。     

乙型病毒S基因单独和与白细胞介素—12基因联合免疫小鼠诱生的体液免疫应

以ＰＣＲ技术扩增得到乙肝病毒表面抗原的编码基因,构建Ｓ基因真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－Ｓ。以ＰＣＲ方法扩增得到小鼠白细胞介素－１２的全长ｃＤＮＡ序列,构建真核表达载体ｐｃＤＮＡ３－ＩＬ－１２（以下简称ＩＬ－１２）。以Ｓ和Ｓ＋ＩＬ－１２经肌肉注射免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠,以空载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋为阴性对照,血源ＨＢｓＡｇ蛋白为阳性对照,用ＥＬＩＳＡ方法检测下同时间免疫小鼠血清中的抗０－ＨＢｓ