pcDNA3-TIMP-2的构建与表达

目的构建TIMP-2基因的真核表达载体pcDNA3-TIMP-2,并探讨其体外表达效果.方法应用已克隆得到的人TIMP-2基因和分子克隆技术构建pcDNA3-TIMP -2,酶切鉴定,并用体外培养人THP-1细胞,电穿孔转入pcDNA3-TIMP-2,RT PCR和Western blotting分别检测外源基因转染效果,Zymography检测培养上清MMPs活性.结果构建pcDNA3-TIMP-2经酶切和测序鉴定正确,电穿孔法导入体外培养人THP 1细胞后,TIMP-2 mRNA约增加2.8倍,TIMP 2 蛋白表达增加约2.7倍,MMP-2和MMP-9的活性分别约为对照组的32%和28%.结论成功构建了pcDNA3-TIMP-2,且证实有良好的体外转染和表达效果,为进行转移TIMPs基因抑制MMPs及探讨其与动脉粥样硬化等多种病理过程的关系奠定基础.     

转化生长因子β2真核表达载体pcDNA3.1(+)/TGF-β2的构建及其在骨髓基质细胞的表达

目的：构建人转化生长因子β2的真核表达载体pcDNA3.1( )/TGF-β2,检测其转染骨髓基质细胞后的表达。方法：用PCR方法从人胎盘cDNA文库DNA中扩增TGF-β2全长cDNA,该基因片段两端设计了Nhe I和Xho I限制性酶切位点。将所得片段连接到T载体上测序证实。利用重组DNA技术将TGF-β2的cDNA构建到真核表达载体pcDNA3.1( )上,酶切鉴定。通过脂质体介导的转染技术,将所构建的载体导入从骨髓中分离培养的基质细胞中,体外单层培养。分别于转染后24h和4周利用RT-PCR和Western-Blotting方法检测目的基因的表达情况。结果：经琼脂糖凝胶电泳及测序证实,PCR获得的片段与GenBank中登记的TGF-β2 cDNA序列完全相同。pcDNA3.1( )/TGF-β2酶切片段的长度与理论大小相符。转染后不同时期的骨髓基质细胞在mRNA和蛋白质水平均可检测到TGF-β2的表达。结论：pcDNA3.1( )/TGF-β2真核表达载体构建成功,在骨髓基质细胞内可获得短暂和长期表达。     

bcl—2基因克隆、转染及其在PC12细胞中的表达

目的：研究bcl-2基因（bcl-2)在PC12细胞中的表达。方法：构建真核表达载体pcDNA3-bcl-2，采用脂质体介导将重组质粒导入PC12细胞，Western blot和原位免疫组化检测外源基因表达。结果：本实验成功构建了真核表达载体pcDNA3-bcl-2，并用脂质体介导的方法获得了稳定表达bcl-2的细胞克隆。Western blot显示有26ku的蛋白质表达，bcl-2单克隆抗体免疫组化染色呈阳性反应。结论：重组质粒pcDNA3-bcl-2经转染能够在PC12细胞中有交表达，为进一步研究bcl-2对PC12细胞的生物学功能奠定了基础。     

pcDNA3.1- Bcl-2真核表达载体构建

目的 克隆大鼠Bcl-2基因（B cell lymphoma）全长cDNA,构建含大鼠Bcl-2基因的重组真核表达质粒。方法 采用RT-PCR的方法从大鼠脾脏组织中扩增全长Bcl-2cDNA,将扩增产物克隆至pMD18-T载体, 测序证实后,再克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了pcDNA3.1- Bcl-2重组质粒。结果: RT-PCR获得长度为720 bp的阳性产物,经T载体和pcDNA3. 1(+)真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后,证实真核表达质粒pcDNA3.1- Bcl-2构建成功。结论 成功克隆了Bcl-2基因,并构建了pcDNA3.1- Bcl-2重组质粒,为进一步研究Bcl-2基因的功能及应用Bcl-2进行基因治疗奠定基础。     

重组体pcDNA3．1（＋）－tyr的构建及在小鼠NIH3T3细胞中的表达

【目的】克隆酪氨酸酶基因(tyr)，构建pcDNA3．1( )-tyr真核表达重组体，并导人NIH3T3细胞表达。【方法】用RT-PCR法从小鼠B16黑色素瘤细胞中克隆tyr全长cDNA片段，利用DNA重组技术将其定向插入真核表达质粒pcDNA3．1( )的T7启动子下游，并用脂质体法导入NIH3T3细胞，RT-PCR，酪氨酸酶活性测定及多巴染色法检测tyr的表达。【结果】成功克隆1．74kb的全长tyr cDNA片段，经测序证实与GenBank所报道的序列完全一致，tyr准确克隆人pcDNA3．1( )的多克隆位点，RT-PCR及酪氨酸酶活性测定等方法检测到转染了重组体的NIH3T3细胞中有tyr的表达。【结论】本实验成功构建了pcDNA3．1( )-tyr真核表达重组体，并成功导入NTH3T细胞中表达.     

人pcDNA3.1-TPX2真核表达载体的构建与表达

目的:构建TPX2的真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并观察其在食管癌EC9706细胞中的表达。方法:在pQE-70-TPX2原核表达载体基础上,根据GenBank上提供的TPX2基因序列及测序结果,采用Primer Premier 5.0软件设计扩增TPX2基因编码区的引物序列,经HindⅢ和BamHⅠ双酶切,与真核表达载体pcDNA3.1连接后转化感受态大肠杆菌JM109,并进行酶切分析和序列测定。将构建的质粒pcDNA3.1-TPX2体外转染EC9706细胞,进行稳定筛选。用Western blot鉴定基因的表达。结果:DNA测序和BLAST比对表明克隆的人TPX2基因序列正确,进一步酶切分析显示,成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并在EC9706细胞中获得稳定表达。结论:TPX2基因真核表达载体的成功构建为后续研究TPX2基因在肿瘤细胞中的功能奠定了基础。     

HEPC1和HEPC2真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的构建小鼠HEPC1和HEPC2基因的真核表达载体,并观察其分别稳定转染NIH3T3细胞后的表达情况.方法从小鼠肝组织中分离总RNA,采用RT-PCR获得小鼠HEPC1和HEPC2基因全长cDNA,分别将其克隆至真核表达载体pcDNA3上,酶切和测序鉴定后,用脂质体将重组子分别转染至NIH3T3细胞中,G418进行长期筛选,然后用RT-PCR和dot-ELISA检测HEPC1和HEPC2的表达.结果RT-PCR获得预期大小的片段,重组子pcDNA3-HEPC1和pcDNA3-HEPC2酶切正确,测序表明HEPC1有1个碱基与GenBank中报告的不同,但其位于密码子的第3位在此不改变编码的氨基酸,HEPC2则完全与GenBank中报道的一致,经RT-PCR和dot-ELISA检测HEPC1和HEPC2在其稳定转染的NIH3T3细胞中均有表达.结论成功构建了小鼠HEPC1和HEPC2基因的真核表达载体,HEPC1和HEPC2在其稳定转染的NIH3T3细胞中获得了表达,为下一步探讨HEPC1和HEPC2的功能及作用机制奠定了基础.     

pcDNA3.1(+)-CYP2J3真核表达载体的构建及在大鼠心肌细胞的表达

目的克隆大鼠CYP2J3基因,与pcDNA3.1(+)真核表达质粒载体连接,转染大鼠心肌细胞检测其表达。方法提取大鼠肝脏组织总RNA,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和重叠延伸聚合酶链式反应(OE-PCR)的方法扩增大鼠CYP2J3基因,与双酶切的pcDNA3.1(+)连接,构建pcDNA3.1(+)-CYP2J3真核表达载体。转染大鼠心肌细胞,用RT-PCR的方法鉴定其在大鼠心肌细胞的表达。结果得到CYP2J3基因全长序列和真核表达载体pcDNA3.1(+)-CYP2J3。RT-PCR结果显示,转染pcDNA3.1(+)-CYP2J3后的大鼠心肌细胞CYP2J3基因有稳定表达。结论克隆大鼠CYP2J3基因、pcDNA3.1(+)-CYP2J3真核表达载体构建及在大鼠心肌细胞的表达均获成功,为进一步研究CYP2J3基因在细胞中的功能奠定了基础。     

重组表达质粒pcDNA3/HIF-1α的构建及其在人肝癌细胞株HepG2的稳定表达

目的:构建缺氧诱导因子(HIF-1α)基因的表达质粒,经脂质体转染人肝癌细胞株HepG2,建立稳定表达HIF-1α基因的细胞模型,为肝癌研究提供有效工具。方法:采用RT-PCR方法扩增肝癌细胞株HepG2内HIF-1α基因功能区片段,克隆至真核表达载体pcDNA3上,转染HepG2细胞后,经G418筛选,建立稳定表达HIF-1α基因的细胞株,免疫荧光染色和Western-blot分析HIF-1α蛋白的表达。结果:通过酶切鉴定,凝胶电泳分析,两条带大小分别位于5.3kb和2.55kb,与预期结果符合,序列测定证实HIF-1α与GeneBank公布的序列一致。经脂质体包裹转染HepG2后,免疫荧光染色和Western-blot分析证实HIF-1α蛋白的表达明显上调。结论:经脂质体途径成功构建稳定表达HIF-1α的细胞模型,为肝癌研究提供了一个有效的工具。     

CVB3VP1与IL-2基因双表达重组质粒的构建及免疫效果

目的 探讨白细胞介素-2(intefleukin-2，IL-2)基因佐剂对柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3，CVB3)基因疫苗的免疫增强作用。方法 从CVB3VP1基因的重组质粒peDNA3／VP1上扩增出带有完整表达构件的VP1基因，克隆至pcDNA3／IL-2，构建成CVB3VP1基因和IL-2基因双表达质粒pcDNA3／VP1-IL-2，转化DH5a大肠杆菌。将peDNA3／VP1-IL-2、peDNA3／IL-2 peDNA3／VP1、pcD．NA3／VP1、peDNA3／IL-2、空白质粒peDNA3和生理盐水分别肌肉注射BALB／C小鼠，每周注射1次，共注射3次，每次注射后的第6天，断尾取血，用微量中和试验方法检测血清中和抗体；第3次注射后的第7天，用800TCID50CVB3感染小鼠，观察各组小鼠的生存情况。结果pcDNA3／VP1-IL-2、pcDNA3／IL-2 pcDNA3／VP1和pcDNA3／VP1组小鼠能产生中和抗体，抗体滴度随免疫次数增加而提高，pcDNA3／VP1-IL-2和pcDNA3／IL-2 pcDNA3／VP1组抗体水平高于同期pcDNA3／VP1组抗体水平，但各组小鼠的生存率无明显差异。结论IL-2基因单独或与VP1基因共表达对pcDNA3／VP1诱导抗体产生均有一定免疫增强作用。     

基质金属蛋白酶组织抑制因子-1,-2在脑膜瘤中的表达及意义

目的研究基质金属蛋白酶组织抑制因子-1,-2(tissue inhibitor ofMMP,TIMP-1,-2)与脑膜瘤的关系.方法采用免疫组化S-P法(Streptavidin-Peroxidase)检测10例正常蛛网膜组织、28例良性脑膜瘤和32例恶性脑膜瘤组织中TIMP-1及TIMP-2的表达水平.结果 TIMP-1在正常蛛网膜组织、良性脑膜瘤和恶性脑膜瘤中的阳性表达率分别为100%(10/10)、89.3%(25/28)和12.5%(4/32),其表达强度经检验显示呈逐次降低趋势,各组间的差异有统计学意义(P＜0.05).TIMP-2在正常蛛网膜组织、良性脑膜瘤和恶性脑膜瘤中的阳性表达率分别为90.0%(9/10)、92.9%(26/28)和18.8%(6/32),其表达强度经检验显示呈逐次降低趋势,其中恶性脑膜瘤与良性脑膜瘤之间的差异有统计学意义(P＜0.01).结论 TIMP-1,TIMP-2在恶性脑膜瘤中的表达强度低于良性脑膜瘤和正常蛛网膜组织,表明TIMP-1和TIMP-2表达水平的下调在脑膜瘤的侵袭、恶变过程中起一定作用.     

染矽尘大鼠肺组织中MMP-2/9和TIMP-1/2蛋白的表达

目的探讨肺组织中基质金属蛋白酶(MMP-2/9)和其抑制物基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP-1/2)在SiO2致矽肺纤维化中的表达及意义。方法清洁级Wistar大鼠64只,随机分为对照组和染尘组。采用暴露式气管内注入法染尘,染尘组每只大鼠注入1 ml SiO2混悬液,对照组注入1 ml灭菌生理盐水。染尘后3,7,14和28 d处死取其肺组织,光镜观察其病理切片;通过ELISA法,测定大鼠肺组织中MMP-2、MMP-9和TIMP1、TIMP-2蛋白的表达。结果与正常对照组比较,染尘组大鼠染毒后3 d肺组织发生局灶性病变,肺泡间隔增厚,间质细胞明显肿胀,局部可见肺泡腔形成细胞性结节,28 d时染尘组大鼠肺泡结构破坏或消失,肺组织以胶原沉积、肺纤维化改变为主,可见巨大纤维性结节;染尘组肺组织内MMP-2,MMP-9,TIMP-1和TIMP-2表达均较对照组增高,结果经秩和检验差异具有统计学意义(P<0.05)。结论矽肺组织内MMP-2/9和TIMP-1/2的高表达,说明其参与了矽肺纤维化的形成。     

胃管状腺癌组织中基质金属蛋白酶-2、组织金属蛋白酶抑制因子-2的表达

目的 :探讨胃管状腺癌组织中基质金属蛋白酶 - 2 (MMP - 2 )和基质金属蛋白酶抑制因子 - 2 (TIMP - 2 )的表达。方法 :采用免疫组化S -P法对 4 7例管状腺癌进行MMP - 2和TIMP - 2的检测。结果 :MMP - 2和TIMP -2均在胃癌细胞浆内呈阳性表达 ,阳性表达率分别为 2 1 .3%和 78.7% ;MMP - 2和TIMP - 2表达与胃管状腺癌淋巴结转移 (P <0 .0 5 )及浆膜浸润相关 (P <0 .0 5 )。结论 :MMP - 2和TIMP - 2表达可作为判断胃癌恶性行为重要生物学标志。     

ET-1、MMP-3、TIMP-1在人肾小球中的表达及意义

目的　研究内皮素 1(Endothelin 1,ET 1)、基质金属蛋白酶 3 (Matrixmetalloprotevnase 3 ,MMP 3 )、金属蛋白酶组织抑制剂 1(Tissueinhibitorofmelalloproteinase ,TIMP 1)在人肾小球中的表达变化及意义。方法　应用免疫组化技术检测3 2例原发性系膜增生性肾炎患者及 5例对照组肾小球中ET 1、MMP 3、TIMP 1、LN蛋白的表达。结果　在中、重度系膜增生性肾炎患者的肾小球中 ,ET 1、MMP 3、TIMP 1、LN蛋白表达增强 ,MMP 3 /TIMP 1比值下降 (P <0 0 5 ,P <0 0 1) ;ET 1的表达与MMP 3 /TIMP 1比值负相关 (r =-0 70 3 ,P <0 0 1) ,与LN表达正相关 (r =0 880 ,P <0 0 1) ;MMP 3 /TIMP 1比值与LN表达负相关 (r=-0 62 3 ,P <0 0 1)。结论　ET 1可能是肾小球MMP 3 /TIMP 1下降的原因之一 ,这与肾小球细胞外基质 (Exlracellularmatrix ,ECM)降解受抑密切相关。     

大鼠金属蛋白酶组织抑制物-1反义基因片段TA克隆载体的构建

目的：构建含大鼠金属蛋白酶组织抑制物-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)反义基因片段TA克性载体，为进一步研究TIMP-1在肾组织纤维化中的作用奠定基础。方法：本实验利用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR），从提取的大鼠肾组织总RNA中特异地扩增含313bp的TIMP-1cDNA片段，并将其克隆到TA载体。结果：用限制性内切酶鉴定313bp的TIMP-1cDNA片段插入方向，测序结果证实扩增片段为目的片段。结论：成功地构建了含大鼠TIMP-1反应基因片段TA克隆载体。     

肺癌患者肺组织MMP-2、MMP-7和TIMP-2表达及意义

目的探讨肺癌组织中基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、基质金属蛋白酶-7(matrix metalloproteinase-7,MMP-7)和组织金属蛋白酶-2(tissne inhibitor of matalloproteinase-2,TIMP-2)的表达及其意义.方法采用免疫组化(S-P)法检测74例肺癌组织、20例癌旁正常肺组织中MMP-2、MMP-7和TIMP-2的表达及其与肺癌类型及预后的关系.结果癌组织中MMP-2和MMP-7表达均显著高于癌旁正常肺组织(P＜0.01,P＜0.05).MMP-2表达在有淋巴结转移者高于无淋巴结转移者(P＜0.01),MMP-7表达与有无淋巴结转移无明显关系(P＞0.05).肺癌TIMP-2表达在有淋巴结转移者低于无淋巴结转移者(P＜0.05).肺癌MMP-2和TIMP-2的表达呈负相关(P＜0.05).单变量分析显示MMP-2表达阳性者生存率低于MMP-2阴性者(P＜0.01),TIMP-2阳性者生存率高于TIMP-2阴性者(P＜0.01).结论 MMP-2和TIMP-2表达与肺癌侵袭转移密切相关,可作为判断肺癌预后的有用指标,MMP-7表达在肺癌侵袭转移中作用不显著.     

MMP-3和TIMP-3在宫颈癌中的表达及其意义

目的探讨MMP-3和TIMP-3与宫颈癌侵袭和转移的关系.方法用光镜和免疫组化方法对41例宫颈癌组织中的MMP-3及TIMP-3表达进行检测.结果晚期宫颈癌组织中MMP-3表达阳性率明显高于早期(P＜0.05),而晚期宫颈癌组织中TIMP-3的表达则比早期减少(P＜0.05),MMP-3/TIMP-3的比值晚期高于早期(P＜0.05).结论 MMP-3和TIMP-3的表达程度及MMP-3/TIMP-3的比值与宫颈癌的临床分期密切相关,可作为判断宫颈癌侵袭转移和预后的指标.     

幽门螺杆菌感染与胃癌侵袭转移及MMP-2，TIMP-2表达的关系

目的：探讨H.pylori感染与胃癌侵袭转移及MMP-2，TIMP-2表达的关系。方法：采用Warthin-starry组织染色法、快速尿素酶试验及14C-UBT检测H.pylori感染，免疫组织化学法检测22例H.pylori感染胃癌与22例无H.pylori感染胃癌组织MMP-2，TIMP-2表达。结果：H.pylori感染胃癌组浆膜侵袭率与淋巴结转移率分别为81.8%与72.7%，高于无H.pylori感染胃癌组（P<0.05）。胃癌浆膜侵袭组、淋巴结转移组MMP-2表达阳性率分别为96.6%与100.0%，高于无浆膜侵袭组、无淋巴结转移组（分别为40.0%与50.0%）；TIMP-2表达阳性率分别为48.3%与45.8%，低于无浆膜侵袭组、无淋巴结转移组（分别为86.7%与80.0%）；MMP-2／TIMP-2值分别为6.86与7.94，高于无浆膜侵袭组、无淋巴结转移组（分别为0.87与1.07）。H.pylori感染胃癌组MMP-2表达阳性率为90.9%，高于无H.pylori感染胃癌组（63.6%）；TIMP-2表达阳性率为36.4%，低于无H.pylori感染胃癌组（P<0.01）；MMP-2/TIMP-2值为7.73，高于无H.pylori感染胃癌组（P<0.01）。结论：H.pylori感染胃癌浆膜侵袭和淋巴结转移增多，与MMP-2表达增加、TIMP-2表达减少、MMP-2/TIMP-2值升高有关。     

Construction of Eukaryotic Expression Plasmid of Human PRX3 and Its Expression in HEK-293FT Cells

To construct the eukaryotic expression plasmid of human PRX3 and measure its expression in the HEK-293FT cells, the full-length coding region of human PRX3 was cloned by PCR and inserted into the eukaryotic expression vector pcDNA4-Xpress (A). HEK-293FT cells were transiently transfected with the recombinant plasmid. Western blot and immuofluorescence were used to detect the expression of the fusion protein. In the experiment, restriction analysis identified the construction of the recombinant plasmid and the inserted sequence was identical with that published on GenBank. Western blot and immunofluorescence confirmed the expression of the recombinant protein in transfected HEK-293FT cells. It was concluded that the eukaryotic expression plasmid of human PRX3 was constructed successfully and the recombinant could he expressed efficiently in HEK-293FT cells, which provides a sound basis for the further study on human PRX3.