反向重复序列法构建神经病靶标酯酶RNA干涉表达质粒

目的构建基于通用真核表达载体的人神经病靶标酯酶双链RNA的稳定表达载体。方法在正义和反义引物两端分别加上EcoRⅠ和BamHⅠ的识别位点扩增得到神经病靶标酯酶活力域序列,构建含有目标基因的倒置重复序列的双链RNA表达载体pcDNA.NTE.dsRNA,酶切分析鉴定重组载体。脂质体法转染到Hela细胞中瞬时表达重组载体,酶活力测定其对细胞内神经病靶标酯酶活力的影响。结果成功构建了NTE双链RNA稳定表达载体pcDNA.NTE.dsRNA,表达该载体细胞内NTE活力明显下降至对照细胞的20%左右。结论采用反向重复序列法将靶标基因的编码序列正反向插入到通用真核细胞表达载体中,是构建哺乳细胞基因双链RNA稳定表达载体的有效方法。     

真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-rmCGβ的构建和鉴定

目的构建恒河猴绒毛膜促性腺激素β亚基macacam ulattac horionicg onadotrophin β subunit,rmCGβ）基因真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-rmCGβ,并了解该质粒能否在真核细胞中表达。方法通过PCR扩增rmCGβ的全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的cDNA克隆至PGM-Teasy,测序后插入pcDNA3．1（＋）真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-rmCGβ,经限制内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体转染技术转染B16细胞,通过RT-PCR扩增出B16／pcDNA3．1（＋）-rmCGβ细胞株中rmCGβ全段基因cDNA。结果经4轮PCR,成功扩增出rmCGβ的cDNA全长基因,酶切和测序证明正确构建了真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-rmCGβ,通过RT-PCR方法证实该质粒能在B16真核细胞中正确表达。建立了稳定的细胞株B16／pcDNA3．1（＋）-rmCGβ。结论成功克隆和构建了rmCGβ的真核表达质粒载体pcDNA3．1（＋）-rmCGβ,为进一步研究rmCGβ的新功能和免疫治疗奠定了基础。     

抑制性消减杂交技术筛选干扰素α转染HepG2细胞中上调的表达基因

目的:应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术筛选干扰素α(IFN-α) 真核表达质粒转染HepG2细胞后差异表达上调的基因。方法:首先构建IFN-α真核表达载体pcDNA3．1(-) -IFN-α,并转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)转染的HepG2细胞为对照;制备转染后的细胞裂解液, 提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制多聚酶链反应(PCR),将产物与T／A载体连接,构建cDNA消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增鉴定,进行测序及同源性分析。结果:构建了pcDNA3．1(-)-IFN-α真核表达质粒,并成功构建了该质粒转染HepG2细胞后差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后得到200个白色克隆,随机挑取70个进行菌落PCR分析,结果显示均含有插入片段,将含有200-1000 bp插入片段的35个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得17种已知基因序列和1个染色体序列。结论:应用SSH技术成功构建了pcDNA3．1(-)-IFN-α转染的HepG2细胞中差异上调表达基因的cDNA消减文库。该文库的建立为进一步阐明IFN-α作用的分子生物学机制提供了重要的理论依据。     

人白细胞介素24真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的 构建人白细胞介素24(human interleukin-24,hIL-24)真核表达载体,并在HepG2细胞中稳定表达,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),从植物血凝素活化的人外周血单个核细胞中克隆得到hIL-24基因目的 片段.应用DNA重组技术将IL-24PCR产物双酶切后定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),转化大肠杆菌DHSα获得重组载体,进行PCR、酶切及测序鉴定.应用脂质体将鉴定正确的重组质粒转染至HepG2细胞,用G418筛选稳定转染细胞株.采用RT-PCR检测稳定转染细胞HepG2中IL-24 mRNA的表达.结果 通过RT-PCR获得与预期大小一致约600 bp的IL-24基因片段;重组载体pcDNA3.1(+)-IL-24经PCR、双酶切及测序证实,IL-24 eDNA片段已正确插入真核表达载体中;在稳定转染的HepG2细胞株中可见到IL-24 mRNA表达.结论 成功构建了hIL-24真核表达载体pcDNA3.1(+)-IL-24,并获得了稳定转染该重组质粒的HepG2细胞株.     

HOGG1特异性锤头状核酶真核表达载体的构建及鉴定

目的　设计并合成人8 羟基鸟嘌呤 DNA糖苷酶(HOGG1)特异性的锤头状核酶(hammerheadribozyme)基因并构建其真核表达载体。鉴定含有核酶靶基因HOGG1cDNA保守序列的真核表达载体。方法　运用计算机软件人工设计并合成核酶基因(RZ) ,将核酶基因克隆到真核表达载体pcDNA 3 1中,重组子由BamHI和EcoRI酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定及DNA测序证实。含有HOGG1基因cDNA保守序列的真核表达载体经BamHI和EcoRI酶切电泳鉴定。结果　RZ人工合成后与pcDNA 3 1连接,酶切电泳及DNA测序证实合成的核酶基因序列正确并已被准确克隆入pcDNA 3 1的BamHI和EcoRI位点之间,命名为pcDNA 3 1 RZ。1 3kb的HOGG1基因cDNA保守序列准确克隆于pcDNA 3 1的BamHI和EcoRI酶切位点之间,命名为pcDNA 3 1 HOGG1。结论　成功合成HOGG1特异性的锤头状核酶基因并构建了该基因的真核表达载体,以及核酶靶基因的真核表达载体。     

大鼠脑源性神经营养因子基因克隆及其真核表达载体的构建

目的 克隆大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)基因的表达序列,构建大鼠BDNF基因真核表达载体.方法 以RT-PCR从大鼠脑组织总RNA中扩增BDNF cDNA,将其克隆到真核表达载体pcDNA3中构建重组质粒pcDNA3-BN,以限制酶酶切鉴定和DNA序列分析鉴定重组质粒.结果 RT-PCR产物为783bp特异片段,重组质粒酶切后产生783bp和5.2 kb的片段,DNA测序证实783bp片段的碱基序列与大鼠BDNF基因序列完全一致.结论 成功克隆大鼠BDNF基因表达序列并构建了BDNF基因真核表达栽体pcDNA3-BN.     

组蛋白去乙酰化酶3真核表达载体的构建和鉴定

目的利用pEGFP-N1真核表达载体构建组蛋白去乙酰化酶3真核表达载体pEGFP-Hdac3,并鉴定其在大鼠肝癌细胞系CBRH-7919中的表达。方法利用大鼠肝脏cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)获取目的基因Hdac3;用HindⅢ、BamH I双酶切真核表达载体pEGFP-N1和目的基因Hdac3,用T4 DNA连接酶连接纯化后的酶切产物;连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞并挑选阳性克隆,并通过PCR、双酶切、DNA测序鉴定构建的重组质粒。利用测序正确的重组体转染CBRH-7919细胞,检测Hdac3和PPAR-γ的mRNA表达。结果利用基因克隆技术获得组蛋白去乙酰化酶3的真核表达载体pEGFP-Hdac3重组质粒。PCR,双酶切,DNA测序证实目的基因H-dac3已成功插入pEGFP载体中。用重组质粒转染大鼠肝癌细胞系CBRH-7919后Hdac3 mRNA表达显著升高、而PPAR-γmRNA表达明显降低。结论本研究成功构建了蛋白去乙酰化酶3的真核表达载体pEGFP-Hdac3。     

天然内生抗菌多肽elafin真核表达载体的构建及在真核细胞的表达

采用RT-PCR法提取天然内生抗菌多肽elafin的基因，通过测序确认后亚克隆构建真核表达载体pEGFP-N1-elafin，再转染至肺上皮细胞A549，荧光显微镜观察pEGFP-N1-elafin在细胞中表达及定位，采用Northern杂交、ELISA检测法分别从转录及蛋白质水平分析表达情况，最后通过酶切电泳鉴定证实真核表达载体pEGFP-N1-elafin构建成功，其转染细胞中有elafin的基因表达，且细胞上清液中elafin含量证实其主要是分泌性表达。Elafin基因cDNA真核表达载体的成功构建以及主要呈分泌性表达的特点显示了极具意义的潜在应用价值。     

乙酰肝素酶系列表达载体的构建

构建了人乙酰肝素酶基因系列真核表达载体，并在NIH3T3细胞中表达，以研究乙酰肝素酶的结构与功能的关系。采用PCR及GeneSOE的方法从人乙酰肝素酶cDNA中扩增得到hpaFL(Met^1-Iles^543)，hpal09(Met^1-Glu^109)及hpasp50(pro，Met^1-Ala^35 Lys^158-Iles^543)，然后插入真核表达载体pcDNA3．1中。采用脂质体介导法将其转染NIH3T3细胞，48h后RT-PCR检测转染细胞中外源乙酰肝素酶基因的转录。结果：酶切鉴定、测序结果以及RT-PCR分析结果表明成功构建了重组表达载体pcDNA-hpaFL，pcDNA-hpa109及pcDNA-hpasp50，并在NIH3T3细胞中有效转录。构建成功的乙酰肝素酶系列表达载体可为乙酰肝素酶结构与功能关系的研究奠定基础。     

β-半乳糖苷结合凝集素-9真核表达载体的构建和鉴定

目的:构建β-半乳糖苷结合凝集素-9的真核表达载体并鉴定。方法:通过DNA重组技术和PCR方法从人外周血单个核细胞克隆β-半乳糖苷结合凝集素-9基因,插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,通过PCR、酶切及测序鉴定重组载体的正确性。结果:DNA测序和酶切鉴定证明β-半乳糖苷结合凝集素-9基因正确克隆至pcDNA3.1(+)的多克隆位点。结论:成功构建β-半乳糖苷结合凝集素-9的真核表达载体pGal-9。     

人肥大细胞羧肽酶分泌型真核表达载体的构建

目的:构建人肥大细胞羧肽酶(hMC-CP)分泌型真核表达载体pcDNA3.1/CP.方法:用免疫球蛋白k链的信号肽序列置换hMC-CP自身的信号肽序列,设计并合成引物,以hMC-CP基因为模板,扩增带有分泌信号肽的hMC-CP基因,DNA测序鉴定正确后,将PCR扩增产物定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1,通过酶切和DNA测序进行鉴定.结果:琼脂糖凝胶电泳显示PCR扩增出一条特异条带,酶切鉴定和序列测定结果表明大小为1269bp的DNA片段插入表达载体.结论:成功构建了hMC-CP分泌型真核表达载体,为进一步制备真核表达的重组hMC-CP奠定了基础.     

Molecular cloning and expression of chicken neuropathy target esterase activity domain

Neuropathy target esterase (NTE) is recognized as the initial target during the process of organophosphate-induced delayed neuropathy (OPIDN). Adult hens are usually used as the animal model for experimental studies of OPIDN. However, the molecular cloning and characteristics of chicken NTE is unknown. On the basis of the predicted chicken NTE gene middle sequence and its 3'-end cDNA sequence, we cloned the gene sequence of chicken NTE activity domain (cNEST). The cloned cNEST gene is 1740 base pairs and encodes 579 amino acids, showing high identity with human and mouse NEST at amino acid level. The serine hydrolase signature motif GXSXG and the patatin domain were found in the cNEST sequence. Over-expression of cNEST tagged with enhanced green fluorescence protein (EGFP) in monkey kidney COS7 cells increased NTE activity significantly. The increased extent is similar to that in over-expression of hNEST cells. Moreover, over-expression of cNEST led to an accumulation of partial cNEST on the cytoplasmic surface of the endoplasmic reticulum. Partial cNEST located in the cytoplasm by comparing the distribution of cNEST and hNEST. After inhibition with different concentrations of mipafox for 60min, the calculated I(50) value was 4.95microM for COS7 cells over-expressing cNEST. These results firstly confirmed that the protein sequence, enzymatic activity, and cellular location of cNEST are very similar to that of hNEST at molecular level. The inhibition curve of mipafox on NTE activity of cNEST in mammalian cells was also reported here.     

含MGMT及增强荧光蛋白真核表达载体的构建

目的 克隆O^6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）基因,测序鉴定正确后构建含增强荧光蛋白（EGFP）的真核表达载体.方法 利用RT-PCR从人正常肝细胞中克隆MGMT并与克隆载体pGEM-T载体相连接.经PCR、酶切及测序鉴定证明克隆成功后用限制性内切酶切下MG-MT片段,同时酶切载体pIRES2-EGFP.凝胶纯化回收后重组构建真核表达载体并鉴定.结果 测序结果显示所克隆的编码序列与GeneBank公布MGMT cDNA序列一致.真核表达载体的PCR及酶切鉴定结果与预期结果一致.结论 成功克隆了耐药基因MGMT并构建了含EGFP编码序列的真核表达载体pIRES2-MGMT-EGFP,为MGMT的进一步相关研究奠定了坚实基础.     

真核表达载体pEGFP-C3-MASH-1的构建

目的构建含小鼠MASH1基因的绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-MASH1，为进一步研究MASH1在间充质干细胞神经分化中的作用打下基础。方法应用RT-PCR方法从小鼠13．5d胚胎组织中扩增出两端带有HindⅢ和EcoRI酶切位点的MASH1cDNA编码片段，经回收、纯化、酶切后，依次连接到质粒pGEM-T和pEGFP-C3上。结果酶切及测序结果表明：重组质粒PEGFP-C3含有MASH-Ⅰ片段，方向及大小正确。结论成功构建了小鼠真核表达载体PEGFP-C3-MASH-Ⅰ。     

Flag-p107真核表达载体的构建及其在ECA109细胞表达及鉴定

目的 构建N端含flag标签的p107的真核表达载体,及其在EC109细胞表达的鉴定.方法 设计引物在p107蛋白N端增加flag标签,通过PCR扩增获得3×flag-p107 cDNA片段,将此片段插入真核表达质粒CMV-MCS-SV40-Neomycin中;再与质粒CMV-MCS-SV40-Neomycin连接,将所得的融合基因进行PCR、酶切及DNA测序验证正确后,利用电转染将其转染至ECA109细胞中;利用Western-Blotting检测融合蛋白CMV-MCS-3flag-p107-SV40-Neomycin的表达情况.结果 重组真核表达载体构建正确,该重组质粒能在ECA109细胞中表达.结论 成功构建真核表达载体CMV-MCS-3flag-p107-SV40-Neomycin并建立了其在ECA109细胞的表达.     

DSB修复基因hKu70反义RNA真核表达载体构建

目的 构建人DNA双链断裂（DSB）修复基因hKu70反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-K，为以后的hKu70基因功能和毒理学研究提供实验材料。方法 提取人胚肺成纤维细胞（HLF）总RNA，逆转录酶-多聚酶链式反应（RT-PCR）扩增hKu70基因cDNA保守序列，经与pGEM-T载体连接，筛选，克隆，抽提质粒和双酶切后，将纯化的hKu70基因cDNA保守序列反向插入绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1中，筛选，克隆，抽提质粒，从而构建hKu70基因反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-K。结果 经RT-PCR获得467bp含限制性内切酶位点的DNA片段，T载体克隆后经双酶切，测序，确定该片段为hKu70基因cDNA，进而构建反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-K，并双酶切，测序确证。结论 成功构建hKu70基因反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-K，为建立该基因低表达细胞株，DNA双链断裂修复缺陷和有关毒理学研究提供工具。     

hMSH2反义核糖核酸表达质粒的构建

利用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）, 特异地扩增HeLa细胞中hMSH2 cDNA的最保守区域, 并将其克隆到TA载体, 从重组质粒两端进行序列分析, 证实为目的片段. 将该目的片段反向克隆到哺乳动物表达载体pREP9的 BamHⅠ和KpnⅠ位点之间, 筛选后得pREP9-hMSH2反义表达重组质粒. 用磷酸钙-DNA共沉淀法将重组质粒DNA及载体DNA分别导入HeLa细胞, 经G418筛选, 扩大培养. 凝胶阻滞实验证实转染有pREP9-hMSH2重组质粒的HeLa-MSH2细胞抽提物中G·T和A·C错配结合蛋白质表达明显降低, 为研究hMSH2基因功能提供了一有效细胞系.     

SLPI基因真核表达质粒的构建和鉴定

目的构建并鉴定含分泌型白细胞蛋白酶抑制蛋白(SLPI)基因的重组真核表达质粒。方法以HeLa细胞的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出SLPI基因cDNA,将产物克隆进真核载体pcDNA3.1(+)内,构建含SLPI基因的重组真核表达质粒。将pcDNA-SLPI重组质粒和空载体pcDNA分别转染HeLa细胞,Western blot检测SLPI蛋白表达。结果核酸序列分析及双酶切鉴定SLPI已成功插入pcDNA3.1(+)载体中,转染pcDNA-SLPI的HeLa细胞中检测到高表达的SLPI蛋白。结论成功构建了含SLPI基因的重组真核表达质粒。     

真核表达载体介导的ICOSIg基因在大鼠脂肪间充质干细胞中表达的实验研究#br#

目的　构建含可诱导共刺激分子（ICOS）融合蛋白（ICOSIg）基因的真核表达载体,探讨其能否在大鼠脂肪间充质干细胞（ADSCs）中表达。方法　克隆编码大鼠ICOS的胞外片段,将其与编码人免疫球蛋白IgG Fc段的基因融合,构建ICOSIg融合基因及其分泌型真核表达载体pcDNA3.1（+）/ICOSIg。经测序鉴定后转染ADSCs,Western blot法检测ICOSIg在ADSCs中的表达。结果　经测序鉴定验证pcDNA3.1（+）/ICOSIg质粒构建成功,且能在ADSCs中成功表达。结论　ICOSIg在ADSCs中成功表达,为进一步研究免疫耐受机制提供了实验基础。