HL-60细胞早期凋亡中端粒酶hTERT基因表达的变化

端粒酶活性在正常体细胞(生殖细胞和造血细胞除外)受到严格的抑制,而在98%的永生化细胞系和约90%的包括造血组织肿瘤在内的恶性肿瘤细胞中重新活化,其催化亚基的编码基因为ｈＴＥＲＴ[1,2]。近年来有关端粒酶的研究虽然已经较为深入,但关于药物诱导细胞凋亡过程中端粒酶催化亚基ｈＴＥＲＴ基因表达的研究尚未见报道。我们采用定量逆转录聚合酶链反应(ＲＴＰＣＲ)技术,对足叶乙甙(Ｖｐ16)诱导ＨＬ60细胞出现早期凋亡前后的端粒酶催化亚基ｈＴＥＲＴ的ｍＲＮＡ表达变化进行了探讨。材料和方法1　细胞株　ＨＬ60细胞株源自中国科学院上海细胞生…     

hTERT反义寡核苷酸对HL-60细胞增殖及端粒酶活性的抑制作用

为了研究hTERT基因反义寡核苷酸(ASODN)对HL-60细胞增殖及端粒酶活性的抑制作用,并探讨HL-60细胞端粒酶活性与hTERT基因表达的关系,应用反义寡核苷酸封闭HL-60细胞hTERT基因的表达,RT-PCR方法检测该基因表达抑制情况,倒置显微镜观察细胞形态变化,MTT法检测细胞增殖状态,应用TRAP-ELISA、TRAP-PAGE方法检测HL-60细胞端粒酶活性。结果发现反义硫代寡核苷酸作用于HL-60细胞72小时后,hTERT基因表达明显受抑,细胞生长受抑,增殖能力减弱,其抑制作用具有序列特异性及浓度、时间依赖性。端粒酶活性检测显示反义寡核苷酸10、20和30μmol/L作用组OD450-690值分别为1.504±0.47、1.223±0.39,0.944±0.16,与未作用组(2.648±0.42)比较,差异有显著性(P<0.05);正义寡核苷酸20μmol/L作用组(OD450-690值为2.376±0·65)与未作用组比较,差异无显著性(P>0.05)。TRAP-PAGE检测表明hTERTASODN作用组较SODN作用组端粒酶条带明显减少,以30μmol/L作用组条带最少。结论hTERT基因反义寡核苷酸能够通过封闭hTERT基因的表达而抑制HL-60细胞增殖,下调端粒酶活性。     

雷公藤红素下调HL-60细胞P-Akt与Cyclin D1蛋白表达及其诱导细胞凋亡的效应

本研究探讨雷公藤红素诱导HL-60细胞凋亡及其可能的作用机制。以不同浓度雷公藤红素(0.25-8.0μmol/L)分别作用于HL-60细胞24-72小时,采用MTT法检测细胞增殖活性;TUNEL荧光染色、流式细胞术观察雷公藤红素对HL-60细胞凋亡及周期的影响;Western blot、RT-PCR法分别检测雷公藤红素对HL-60细胞内Akt(P-Akt)及其下游分子Cyclin D1的蛋白、基因的表达水平。结果表明,雷公藤红素能明显抑制HL-60细胞增殖,具有浓度依赖和时间依赖性。此外,雷公藤红素以浓度依赖性方式诱导HL-60细胞凋亡,并伴随明显的凋亡细胞形态学改变。雷公藤红素的凋亡诱导可能与其诱导HL-60细胞周期阻滞于G0/G1期有关。雷公藤红素对P-Akt及CyclinD1蛋白及基因表达水平均有不同程度的抑制作用,该抑制作用呈明显的量效和时效关系。结论:雷公藤红素明显抑制HL-60细胞的增殖,并诱导其凋亡,其抗白血病效应可能与其下调P-Akt和Cyclin D1蛋白表达有关。     

mPGES-1抑制剂MK886对白血病HL-60/A细胞凋亡及耐药性的影响

为了探讨膜结合型前列腺素E2合酶1(mPGES-1)抑制剂MK886对耐药白血病HL-60/A细胞诱导凋亡的作用及对其耐药性的影响,采用QT-PCR及Western blot法检测HL-60/A细胞mPGES-1的表达,CCK-8法观察药物对HL-60/A细胞增殖的影响,流式细胞术检测细胞凋亡,ELISA法检测PGE2的合成,Western blot法检测Akt、P-Akt表达,并观察低浓度(10μmol/L)MK886对HL-60/A细胞耐药性及多药耐药基因表达的影响。结果表明,HL-60/A细胞高表达mPGES-1,MK886可时间、浓度依赖性地抑制HL-60/A细胞增殖,诱导其凋亡(r=-0.83,P<0.05),同时,mPGES-1表达及PGE2合成减少,P-Akt表达明显下降。低浓度MK886可下调多药耐药基因mdr-1及蛋白P170表达,增强对化疗的敏感性。结论:MK886可抑制耐药白血病HL-60/A细胞增殖,诱导其凋亡,增强其化疗敏感性,其机制与下调mPGES-1/PGE2合成、抑制P-Akt蛋白及多药耐药基因表达有关。     

维甲酸诱导HL-60细胞分化过程中端粒酶活性与 hTERT,c-myc和bcl-2表达的研究

为了探讨全反式维甲酸(ATRA)诱导HL—60细胞分化过程中端粒酶活性与hTERT，c—myc和bcl—2　mRNA表达的变化规律及其意义，复制HL—60细胞的诱导分化模型，在分化前和分化过程中通过端粒重复序列扩增PCR—ELISA方法测定端粒酶活性，采用RT—PCR方法检测hTERT，c—myc和bcl—2　mRNA表达水平。结果显示，在ATRA诱导HL－60细胞分化过程中，端粒酶活性水平逐渐下降，hTERT　mRNA表达下调的同时c—myc和bcl—2　mRNA表达亦下调，且hTERT　mRNA下调早于端粒酶活性水平下降。结论：全反式维甲酸诱导的HL—60细胞分化过程与端粒酶活性降低和hTERT，c—myc及bcl—2　mRNA表达下降有关。     

三氧化二砷对HL-60细胞端粒酶活性表达的诱导效应

[目的]探讨三氧化二砷(As2O3)对HL-60细胞端粒酶活性表达的影响。[方法]采用TRAP-PAGE-银染定性法及TRAP-ELISA定量法检测As2O3作用于HL-60细胞前后其端粒酶活性的改变。[结果]浓度分别为0．1μmol／L、1．0μmol／L、5．0μmol／L的As2O3与HL-60细胞共培养1-3d,细胞端粒酶活性(吸光度A值)由1．577降至0．040,端粒酶活性明显受抑,相应的抑制率由2.47％上升至97.52％,且具有剂量依赖性和时间依赖性。[结论]As2O3可有效抑制HL-60细胞端粒酶活性的表达。     

重组人白血病抑制因子对HL-60白血病细胞的抑制作用

白血病抑制因子(LIF)有抑制HL-60白血病细胞集落生成和诱导HL-60细胞分化的作用。当LIN浓度为2000U/ml时,HL-60集落数从对照的115±17下降到3±3。成熟细胞比例从对照的1.1±0.4上升到8.8±1.5。LIF还可与IL-6及SCF等因子有协同作用使上述作用进一步加强。LIF可能成为临床治疗某些白血病的有效药物。     

端粒酶活性的抑制对顺铂诱导HL—60细胞凋亡的影响

采用端粒酶聚合酶链反应-酶联免疫吸附测定(PCR ELISA)的方法,检测人类端粒酶逆转录酶(hTERT)基因反义寡脱氧核苷酸(ASODN)处理HL-60细胞前后端粒酶活性的改变,并进一步通过姬姆萨染色及流式细胞术方法,分析HL-60细胞的端粒酶活性受到抑制后顺铂对HL60细胞凋亡的影响.结果显示hTERT基因ASODN作用于HL60细胞后,端粒酶活性表现逐渐下降;hTERT ASODN与顺铂联合可诱导HL-60细胞出现一系列特征性的凋亡细胞的形态学变化;hTERT基因ASODN作用于HL-60细胞24小时再加入顺铂,用流式细胞术测定凋亡细胞的百分率明显高于正义寡核苷酸(S)DN)联合顺铂作用组和单用顺铂作用组(P＜0.01).然而,hTERT基因的ASODN下调HL-60细胞的端粒酶活性以后,再用DNR和Ara-c处理不能加速HL-60细胞的凋亡.以上的结果表明了端粒酶活性的下调可选择性促进顺铂诱导HL-60细胞凋亡.     

抑制SDF-1活性对人急性髓性白血病HL-60细胞系增殖的影响

本研究通过观察抑制SDF-1活性对HL-60细胞增殖活性的影响，探讨趋化因子SDF-1在维持HL-60细胞生存能力中的作用。培养骨髓基质细胞，并与HL-60细胞共培养，采用SDF-1受体CXCR4单克隆抗体阻断SDF-1生物活性后，用MTT法检测HL-60细胞活力、用流式细胞术观察HL-60细胞增殖周期变化、检测细胞膜表面CXCR4表达，同时检测CXCR4单克隆抗体应用前后HL-60细胞内钙离子浓度变化。结果显示，抗CXCR4单克隆抗体可下调HL-60细胞膜表面CXCR4的表达，同时处于G0／G1期的细胞增多，处于S期的细胞减少，而白血病细胞存活率下调，细胞内钙离子浓度降低。结论：抑制SDF-1活性可在一定程度上抑制白血病细胞的增殖。     

p53基因对HL-60细胞端粒酶活性和人端粒酶逆转录酶基因表达的影响

为了研究野生型p53基因转染的HL-60细胞端粒酶活性和人端粒酶逆转录酶（hTERT)基因表达的变化，采用脂质体法将野生型p53基因转染HL-60细胞，用TUNEL检测细胞凋亡。用端粒重复扩增法（TRAP）-酶联免疫吸附试验（ELISA）检测端粒酶活性变化，以及用RT-PCR方法检测hTERTmRNA表达的变化。结果显示：转染野生型p53基因的HL-60细胞在32.5℃培养24小时和72小时后，凋亡率分别为8.3%和21.0%,hTERTmRNA和端粒酶活性分别下降至对照组的68.4%和55.8%及27.3%和8.9%。结论：p53基因能下调HL-60细胞hTERTmRNA和端粒酶活性。这可能是野生型p53基因诱导细胞凋亡机制之一。     

CD44单克隆抗体A3D8通过抑制ERK1/2上调Bim诱导HL-60细胞早期凋亡

CD44单克隆抗体A3D8可抑制急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)细胞的增殖抑制,并诱导其早期凋亡。本研究探讨在此过程中ERK以及BCL-2家族成员的作用机制,为治疗白血病提供新方法和新的药物靶点。用MTT法检测A3D8对HL-60细胞的增殖抑制效应,用流式细胞术检测A3D8对HL-60细胞线粒体膜电位的变化,用实时定量PCR技术检测BIMmRNA表达的变化;用Western blot检测A3D8处理后磷酸化ERK-1/2的表达变化。结果表明:A3D8能显著抑制HL-60细胞的增殖,抑制效率呈现剂量和时间的量效关系,并可进一步诱导HL-60细胞的早期凋亡,而BCL-2家族成员Bim的表达水平也随时间和浓度的变化而改变,磷酸化ERK-1/2的表达水平明显降低。结论 :CD44单克隆抗体A3D8可通过降低磷酸化ERK-1/2的表达来调节Bim,从而诱导HL-60细胞的增殖抑制和早期凋亡。     

hTERT反义寡核苷酸对HL-60细胞致瘤性的影响及其诱导凋亡作用

目的研究人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因反义寡核苷酸(ASODN)对 HL-60细胞致瘤性的影响及其诱导凋亡作用。方法用流式细胞术检测 hTERT ASODN 转染 HL-60细胞72 h 后细胞凋亡,琼脂糖凝胶电泳检测凋亡细胞 DNA 梯带;将转染及未转染寡核苷酸的 HL-60细胞分别接种BALB/c 裸鼠,观察成瘤情况,切片观察移植瘤组织形态;另取10只 BALB/c 裸鼠,改进成瘤方法使其均匀成瘤后分成两组,在瘤体局部分别注射 ASODN、磷酸盐缓冲液(PBS),经7d 治疗后测量瘤体并切片观察其细胞形态变化,采用 TUNEL 方法检测细胞凋亡。结果 hTERT ASODN 作用于 HL-60细胞72 h 后,流式细胞术检测出早期凋亡峰,琼脂糖凝胶电泳显示 DNA 梯形条带,SODN 组及空白对照组未检测出凋亡峰及 DNA 梯形条带 ASODN 转染的 HL-60细胞组 BALB/c 裸鼠接种后第16～17天成瘤,5只中2只成瘤,未转染组在第12～13天成瘤,5只中4只成瘤,成瘤后 ASODN 治疗组瘤组织间质及血管较少,PBS 治疗对照组瘤组织间质发达,血管丰富。成瘤后 ASODN 治疗前肿瘤体积为(100.9±24.6)mm~3,治疗后肿瘤与 PBS 对照组比较,生长明显减缓[瘤体积分别为(422.7±326.4)mm~3和(786.4±357.6)mm~3](P<0.05) 组织切片显示,ASODN 治疗组瘤组织中可见大量细胞呈现凋亡形态,PBS 治疗组则少见凋亡细胞 TUNEL 检测显示,ASODN 治疗组瘤组织中阳性细胞数较 PBS 治疗组明显增多(P<0.05)。结论 hTERT 基因 ASODN 能够诱导 HL-60细胞凋亡并降低其在 BALB/c 裸鼠体内的致瘤性,抑制移植瘤增长速度。     

HOXA9在髓系白血病细胞HL-60中的表达及药物对其干预作用

本研究旨在观察同源盒基因(HOX)HOXA9在髓系白血病细胞HL-60中的表达和药物干预对其表达的影响,在mRNA水平和蛋白水平探讨HOX介导白血病的发病机制。用实时荧光定量PCR法观察HOXA9 mRNA的表达,Western blot法观察HOXA9蛋白的表达,以及全反式维甲酸(ATRA 1μmol/L)或三氧化二砷(As2O3 1μmol/L)对HOXA9表达的调节作用。结果表明:ATRA组和As2O3组的HOXA9基因表达都呈先上升后下降趋势,第1天就有表达,在第2天表达上升,而在第3天表达降低。ATRA组和As2O3组的HOXA9蛋白第1天就有表达,对照组与ATRA处理组HOXA9蛋白表达呈先上升后下降趋势;As2O3处理组HOXA9蛋白表达呈逐渐下降趋势。ATRA组HOXA9基因的表达在第1-3天均较对照组高(P<0.05);As2O3组HOXA9基因表达水平与对照组比较,第2天增高(P<0.05),第1,3天差异无统计学意义。ATRA组HOXA9蛋白的表达水平在第1-3天均较对照组高(P<0.05);As2O3组HOXA9蛋白表达量与对照组比较,第1天增高(P<0.05),第2天降低(P<0.05),第3天变化无统计学差异。结论:HOXA9在人髓系白血病细胞HL-60中有表达,1μmol/L ATRA能上调HL-60细胞中HOXA9mRNA和蛋白的表达,ATRA、As2O3治疗白血病的机制可能与调节HOXA9 mRNA和蛋白的表达有关。     

Novel indole retinoid derivative induces apoptosis and cell cycle arrest and modulates AKT and ERK signaling in HL-60 cells

Chemotherapy with targeted drugs is the first line therapy option for acute and chronic myeloid leukemia. However, hematopoietic stem cell transplantation may be used in high-risk patients or patients with failed responses to chemo drugs. Discovery and development of more effective new agents with lower side effects is the main aim of leukemia treatment. In this study, a novel retinoid compound with tetrahydronaphthalene ring was synthesized and evaluated for anticancer activity in human chronic and acute myeloid leukemia cell lines K562 and HL-60. Novel N-(1H-indol-1-yl)-5,5,8,8-tetramethyl-5,6,7,8-tetrahydronaphthalene-2-carboxamide was synthesized based on molecular hybridization of the two different bioactive structures retinoid head and indole. The effects of the synthesized carboxamide compound, which was referred to as compound 5 , were determined in K562 chronic myeloid leukemia and HL-60 acute myeloid leukemia cell lines and L929 fibroblast cell line, which served as a control. Colorimetric MTT and caspase3 activity tests, flow cytometry, western blot, and microscopic examinations were used to evaluate biological activity. Compound 5 more effectively induced cell death in HL60 cells in comparison to K562 cells and L929 fibroblast cells. Therefore, further mechanism of cell death was investigated in HL60 cell line. It was found that compound 5 induced remarkable cytotoxicity, caspase3 activation, and PARP fragmentation in HL60 cells. Flow cytometric staining showed that the percentage of cells arrested in G0/G1 was also increased with compound 5 treatment. Important modulator proteins of cell proliferation p-ERK, p-AKT, and p-m-TOR were also found to be inhibited with compound 5 treatment. Collectively, our results reveal compound 5 , which is a novel indole retinoid compound as a potential active agent for the treatment of acute promyelocytic leukemia.     

B淋巴增殖性疾病的SOX11、cyclin D1、cyclin D2和cyclin D3的表达研究

目的 探讨各B淋巴增殖性疾病(B-LPD)中SOX11、cyclin D1、cyclin D2和cyclin D3表达的差异和相关性,以及与慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者临床特征的关系.方法 采用实时定量逆转录PCR(qRT-PCR)技术检测154例B-LPD患者与12例健康对照SOX11、cyclin D1、cyc...     

Mcl-1基因在HL-60细胞对全反式维甲酸耐药机制中的作用

目的探讨髓系白血病-1(Mcl-1)基因在HL60细胞对全反式维甲酸(ATRA)耐药中的作用。方法采用少量、递增、反复ATRA诱导HL-60细胞,建立ATRA耐药细胞系HL60/ATRA;利用鸡尾酒法制备Mcl-1基因的小片段干扰RNA(SmallinterferenceRNA,siRNA),并通过脂质体介导将其导入HL60/ATRA细胞;Westernblot检测Mcl-1蛋白在细胞中的表达;MTT实验、NBT还原反应实验、TUNEL免疫组化染色法分别检测细胞的增殖、分化和凋亡情况。结果HL60/ATRA细胞Mcl1蛋白相对灰度值为0.624±0.127,较野生型HL60细胞(相对灰度值为0.162±0.127)明显高表达,并可耐受100nmol/L的ATRA,而不发生分化、凋亡[凋亡率为(1.0±0.5)%];Mcl1siRNA导入HL60/ATRA细胞后,Mcl1蛋白表达下调(相对灰度值为0.267±0.086),恢复对ATRA的敏感性[凋亡率为(18.5±4.5)%]。结论Mcl1基因可能参与了HL60细胞ATRA耐药的形成;抑制Mcl-1基因可能成为一种新的逆转ATRA耐药的策略。     

mPGES-1抑制剂MK886对白血病HL-60细胞周期的影响

本研究探讨膜结合型前列腺素E2合酶1(mPGES-1)抑制剂MK886对人急性髓系白血病HL-60细胞周期的作用。采用流式细胞仪分析技术、Western blot、ELISA等方法检测不同浓度MK886(10、25、50μmol/L)对HL-60细胞周期的作用及对细胞周期调控因子周期蛋白D1、mPGES-1、PGE2、Akt、P-Akt、C-MYC蛋白的影响。结果表明:与正常人外周血单个核细胞比较,G0/G1期HL-60细胞比例减少,S期比例增多。MK886作用24 h后,被阻滞于G0/G1期的细胞增多,同时细胞mPGES-1表达下调,合成PGE2减少,P-Akt、C-MYC、周期蛋白D1蛋白表达下降。结论:MK886对白血病HL-60细胞有细胞周期阻滞作用,其机制可能与抑制mPGES-1表达,减少PGE2的合成,抑制Akt磷酸化及C-MYC表达,下调周期蛋白D1表达有关。