硼替佐米对K562/DNR细胞株MAPK信号途径的影响

本研究旨在检测硼替佐米对柔红霉素（daunorubicin,DNR）诱导的K562耐药细胞株K562/DNRMAPK信号途径中ERK、JNK及P38的影响,探讨硼替佐米逆转白血病细胞耐药的分子机制。应用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT法）进行耐药细胞株和硼替佐米细胞毒性的判定。选用4μg/L硼替佐米作为实验用药,以100μg/mlDNR单用或联合应用硼替佐米作用于K562/DNR细胞株12、24和36小时,应用Western blot检测不同时间点各组ERK、JNK、p38及P-gp的表达水平,同时应用流式细胞术检测各组细胞凋亡率。结果表明,与DNR组相比,在总ERK1/2、p38及JNK无明显变化的情况下,硼替佐米联合DNR可抑制P-ERK、P-P38的表达,增加P-JNK的表达（p〈0.05）,同时减少P-gp表达,其作用随作用时间延长而增强,同时加用硼替佐米可增加细胞凋亡率。结论：硼替佐米可通过MAPK信号通路逆转白血病细胞耐药性,增加细胞凋亡率,该作用呈时间依赖性。     

硼替佐米联合5-氮杂胞苷对K562细胞凋亡和SHIP基因表达的影响

本研究旨在探讨硼替佐米联合5-氮杂胞苷对K562细胞凋亡和SHIP mRNA表达的影响.用不同浓度硼替佐米和5-氮杂胞苷处理K562细胞24 h,采用MTT比色法检测细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡,RTPCR法检测SHIP基因mRNA的表达.结果表明：5-20 nmol/L硼替佐米对K562细胞增殖均有一定抑制作用,并随着浓度增加抑制作用逐渐增强.硼替佐米和5-氮杂胞苷联合处理组对细胞的抑制作用比同剂量两药单用时都显著增强（P＜0.05）.硼替佐米能促使K562细胞凋亡,且随浓度增加而凋亡增多,联合处理组对细胞的凋亡作用比同剂量单药作用时显著增强（P＜0.01）.硼替佐米能下调K562细胞SHIP mRNA的表达,且随着药物浓度增加,表达逐渐降低,联合处理组与同剂量单药组相比更显著下调SHIP mRNA表达（P＜0.05）.结论：硼替佐米或5-氮杂胞可以下调K562细胞中SHIP mRNA的表达,并可能通过此机制诱导K562细胞凋亡,两药具有协同作用.     

不同浓度硼替佐米对柔红霉素诱导的K562耐药细胞株ERK、JNK及P38表达的影响

本研究旨在观察蛋白酶体抑制剂硼替佐米(bortezomib,PS-341)对柔红霉素(daunorubicin,DNR)诱导的K562白血病耐药细胞株ERK、JNK及P38表达的影响,探讨硼替佐米逆转耐药的分子机制。用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)进行耐药细胞株和硼替佐米细胞毒性的判定。以100nmol/L DNR单用或联合应用1及10nmol/L PS-341作用于K562耐药细胞株36小时,检测各组ERK、JNK及P38的表达情况,检测各组细胞凋亡率。结果表明:与DNR组相比,PS-341联合DNR可抑制ERK和P38的表达,增加JNK的表达(p<0.05)。结论 :PS-341可显著抑制K562耐药细胞株ERK和P38的表达,增加JNK的表达;PS-341通过MAPK途径逆转细胞耐药,促进细胞凋亡。     

硼替佐米对K562细胞增殖、凋亡及SHIP基因表达的影响

本研究旨在探讨蛋白酶体抑制剂硼替佐米(bortezomib)对K562细胞的增殖、凋亡及SHIP基因表达的影响。将不同浓度的硼替佐米作用于K562细胞,采用MTT法测定细胞增殖活性,用流式细胞术检测细胞凋亡,RT-PCR方法检测SHIP mRNA表达。结果表明,硼替佐米10、20、50和100 nmol/L作用于K562细胞24 h,细胞增殖抑制率分别为(5.76±1.47)%、(10.55±1.59)%、(17.14±2.05)%和(27.69±3.57)%,空白对照组为(1.30±0.10)%;20nmol/L硼替佐米作用于K562细胞24、48、72 h,细胞增殖抑制率分别为(10.55±1.59)%、(16.33±2.53)%、(19.78±1.56)%,24 h组与48 h组比较,差异具有统计学意义(P<0.05),10、20、50、100 nmol/L硼替佐米作用于K562细胞24h,Annexin V-FITC/PI双标法显示其凋亡率分别为(12.7±0.6)%、(26.9±0.9)%、(32.6±1.2)%、(72.5±1.5)%,均高于对照组(1.0±0.5)%(P<0.05)。RT-PCR法检测结果显示应用硼替佐米作用后SHIP mRNA表达上调明显,与空白对照组比较差异有统计学意义。结论:硼替佐米呈时间、浓度依赖性抑制K562细胞增殖,并能通过上调SHIP基因的表达诱导细胞凋亡。     

硼替佐米单用或联合三氧化二砷对Jurkat细胞凋亡和Livin mRNA表达的影响

本研究旨在探讨硼替佐米单用或联合三氧化二砷对Jurkat细胞凋亡的影响。用不同浓度硼替佐米、三氧化二砷处理细胞24小时,采用MTT比色法检测细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡,RT-PCR法检测Livin mRNA的表达。结果表明,5-25 nmol/L硼替佐米对Jurkat细胞增殖均有一定抑制作用,随着浓度增加抑制作用逐渐增强。硼替佐米和三氧化二砷联合处理组对细胞的抑制作用比同剂量两药中任一种单独使用时都显著增强(p<0.05)。硼替佐米能促使Jurkat细胞凋亡,且随浓度增加而凋亡增多,联合处理组对细胞的凋亡作用比同剂量单药作用时显著增强(p<0.01)。硼替佐米能下调Jurkat细胞Livin mRNA的表达,且随着药物浓度增加,表达逐渐降低,联合处理组比同剂量单药组更显著下调LivinmRNA的表达(p<0.05)。结论:硼替佐米或联合三氧化二砷可以下调Jurkat细胞中Livin mRNA的表达,并可能通过此机制诱导K562细胞凋亡,两药具有协同作用。     

硼替佐米对K562细胞株粘附分子ICAM-1表达的影响

目的:探讨蛋白酶体抑制剂硼替佐米(万珂,Valcade)对白血病K562细胞株细胞问粘附分子(ICAM-1)表达的影响。方法:用含10?S的RPMI1640培养液体外培养K562细胞,分别用0、10、20、30、50、100 nmol/L的硼替佐米干预K562细胞6h后收集,用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析K562细胞ICAM-1表达的变化。并用20 nmol/L浓度硼替佐米作用K562细胞株不同时间(0,6,12,24,48h)分析K562细胞ICAM-1表达的变化。结果:硼替佐米明显抑制K562细胞ICAM-1的表达(P<0.05),在硼替佐米浓度为0～20 nmol/L时成正比关系,当浓度>20 nmol/L各组差异无显著性。以20 nmol/L浓度作用K562细胞株不同时间后,ICAM-1的表达较作用前明显下降.并且这种效应持续存在。结论:K562细胞株ICAM-1基因表达异常增高,硼替佐米可抑制其表达量。     

硼替佐米对多发性骨髓瘤细胞凋亡及分子伴侣BiP表达的影响

本研究旨在探讨蛋白酶体抑制剂硼替佐米对多发性骨髓瘤细胞株NCI—H929（H929）的凋亡诱导作用及其对H929细胞中分子伴侣BiP表达的影响。以不同浓度硼替佐米处理H929细胞24小时后,采用Annexin V—FITC／PI双染联合流式细胞术检测靶细胞凋亡率;用RT—PCR和Westernblot检测靶细胞BiP mRNA和BiP蛋白的表达。结果表明：不同浓度硼替佐米（20、40、80nmol／L）均可诱导靶细胞凋亡,凋亡率分别为（15．73±0．67）％、（27．83±1．26）％7t．（44．17±2．25）％,呈剂量依赖性,且均显著高于未处理组（1．21±0．07％）（P〈0．05）;经不同浓度硼替佐米处理后,靶细胞BiPmRNA和BiP蛋白水平均高于未处理组,且二者变化一致;在相近的促凋亡条件下（凋亡率约40％-50％）,标准内质网应激诱导剂brefeldin A（500ng／ml,24小时）对H929细胞BiP mRNA和BiP蛋白表达的上调作用与硼替佐米（80nmol／L,24小时）基本一致。结论：硼替佐米诱导H929细胞凋亡并伴有分子伴侣BiP mRNA和BiP蛋白表达上调,表明硼替佐米诱导的H929细胞凋亡极可能涉及内质网应激反应。     

蛋白酶体抑制剂硼替佐米对K562细胞株NF-κB活性及ICAM-1表达的影响

为了研究蛋白酶体抑制剂硼替佐米对急性白血病K562细胞株核因子κB(NF-κB)及细胞间黏附分子(ICAM-1)表达的影响,用含10%小牛血清的RPMI1640培养液体外培养K562细胞,用0、10、20、30、50、100nmol/L的硼替佐米干预K562细胞6小时后收集细胞。用SP免疫组织化学法测各组细胞NF-κB活性,并以反转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析K562细胞ICAM-1表达的变化。结果表明:各药物处理组K562细胞NF-κB的活性和ICAM-1的表达均明显受抑制,与对照组相比,存在显著性差异(p<0.05),且各组NF-κB活性与ICAM-1表达成正相关。结论:蛋白酶体抑制剂硼替佐米可能通过抑制NF-κB活性下调细胞间黏附分子ICAM-1的表达,这为白血病靶向治疗提供了一个新的途径。     

骨髓间充质干细胞对K562细胞增殖及凋亡的影响

本研究比较K562细胞与相同数量以及不同数量的人骨髓间充质干细胞（MSC）黏附培养前后K562细胞增殖、细胞周期和凋亡的变化,以探讨MSC对人白血病K562细胞生长的影响。通过建立正常人骨髓MSC的体外培养体系及其与K562细胞共培养的体系测定K562细胞的生长曲线;将不同数量的MSC与K562细胞共培养测定K562细胞的增殖率曲线;应用流式细胞术检测K562细胞周期以及凋亡的变化。结果显示：与单独K562细胞培养相比,K562细胞与相同数量MSC共培养后,生长受抑;K562细胞与不同数量MSC共培养后,MSC对K562细胞的抗增殖作用呈剂量依赖性;细胞周期分析发现,K562细胞与MSC共培养后,G0／G1期以及G2／M期的细胞增加,S期的细胞减少。共培养24、48、72小时后流式细胞仪检测发现,K562细胞的凋亡率下降。结论：正常人骨髓MSC能使导致K562细胞生长抑制,阻止K562细胞周期的运行,凋亡率下降,且在一定范围内,随着MSC数量的增加,对K562细胞的抗增殖作用增强。     

自噬在硼替佐米诱导的肾癌细胞凋亡中作用的研究

目的探讨自噬在硼替佐米诱导的肾癌细胞凋亡中的作用。方法采用MTT检测硼替佐米对人肾癌ACHN细胞增值率的影响;通过Western Blotting检测硼替佐米对人肾癌ACHN细胞凋亡相关蛋白cleaved caspase-3及自噬相关蛋白LC3表达水平的影响;联用自噬抑制剂3-MA后,MTT检测细胞增殖率,Western Blotting检测凋亡相关蛋白cleaved caspase-3表达水平。结果硼替佐米对肾癌ACHN细胞的增殖有抑制作用,并且增加人肾癌ACHN细胞凋亡相关蛋白cleaved caspase-3表达水平及自噬相关蛋白LC3表达水平,呈一定的浓度依赖性;联用3-MA可增加硼替佐米诱导的肾癌ACHN细胞的增殖抑制作用,并可增加硼替佐米诱导的肾癌ACHN细胞cleaved caspase-3表达水平。结论硼替佐米可诱导肾癌细胞凋亡并诱导肾癌细胞发生自噬,抑制自噬可以明显增强硼替佐米的肾癌细胞毒作用。     

硼替佐米对K562细胞增殖、凋亡及其对XIAP表达的影响

目的 研究蛋白酶体抑制剂硼替佐米(bortezomi)对白血病细胞株K562细胞的增殖、凋亡及X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)表达的影响.方法 将不同浓度的硼替佐米作用于K562细胞,采用WST-1法测定细胞增殖活性,瑞特-吉姆萨染色观察细胞形态学变化,用流式细胞术、原位末端转移酶标记(TUNEL)法检测细胞凋亡,RT-PCR法检测XIAP mRNA表达,SP免疫组化法检测XIAP蛋白的表达.结果 5、10、30、50、100 nmol/L硼替佐米作用于K562细胞24 h,细胞增殖抑制率分别为(13.6±0.2)%、(28.7±0.5)%、(55.4±1.1)%、(68.1±1.1)%、(81.4±0.1)%,空白对照组为(1.2±0.0)%(P＜0.05),24 h IC50值为24.6 nmol/L.30 nmoL/L硼替佐米作用于K562细胞12、24、36、48 h,细胞增殖抑制率分别为(29.1±0.9)%、(55.4±1.1)%、(57.8±0.8)%、(59.8±1.2)%,12 h组与24 h组比较,差异有统计学意义(P＜0.05),但24 h组与36、48 h组比较差异有统计学意义(P＞0.05);30 nmol/L硼替佐米作用于K562细胞24 h,镜下可见细胞核固缩、核边集、核碎裂,胞质中见大量空泡及凋亡小体,对照组细胞形态正常.TUNEL检测法显示凋亡细胞阳性率为49.0%,空白对照组阳性率2.3%(P＜0.05).10、30、100 nmoL/L硼替佐米作用于K562细胞24 h,AnnexinⅤ-FTTC/PI双标法显示其凋亡率分别为(32.2±1.2)%、(53.9±1.3)%和(81.3±2.8)%,均高于对照组(0.3±0.6)%(P＜0.05).RT-PCR法检测结果显示随硼替佐米浓度增高,XIAP mRNA表达下调明显.免疫组化结果显示硼替佐米组XIAP蛋白表达下调,与空白对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 硼替佐米呈时间、浓度依赖性抑制K562细胞增殖,并可能通过下调XIAP的表达诱导细胞凋亡.

Abstract：

Objective To investigate the effect of proteasome inhibitor bortezomib on proliferation,apoptosis of K562 cells and the expression of XIAP. Methods K562 cells were treated with bortezomib at different concentration. Cell proliferation was analyzed by WST-1 assay, cell apoptosis by flow cytometry and TUNEL, XIAP mRNA expression from 5 - 100 nmol/L by RT-PCR, and XIAP protein expression by SP immunohistochemistry. Results K562 cells were treated with bortezomib at different concentrations for 24 h respectively, the cells growth was significantly inhibited with inhibition rates from( 13.6 ±0.2)% to (81.4 ±0. 1 ) %, respectively, being markedly higher than that of control ( 1.2 ± 0. 1 ) % ( P ＜ 0. 05 ). IC50 was 24.6 nmol/L of bortezomib treated for 24 h. When K562 cells were treated with 30 nmol/L of bortezomib for 12 - 48 h, the inhibition rates were (29.1 ± 0. 9) % to (59.8 ± 1.2 ) %, respectively, the differences being statistically significant( P ＜0.05 ) between 12 h group and 24 h group, while there was no statistical difference between 24 h, 36 h and 48 h groups. K562 cells treated with 30 nmol/L bortezomib for 24 h showed nuclear condensation, nuclear margination, nuclear fragmentation, cytoplasmic vacuoles and a large number of apoptotic body formation. The apoptotic cells rate was 83.67% in bortezomib treated group, and 2.33% in untreated group (P ＜ 0.05 ). The expression of XIAP mRNA was decreased in a dose-dependent manner, and the expression of its protein was down-regulated. Conclusion Bortezomib can inhibit the proliferation of K562 cells, and induce apoptosis by down-regulating the expression of XIAP, providing the laboratory evidence for the targeted therapy in acute leukemia.     

蛋白酶体抑制剂硼替佐米对K562细胞株NF-κB活性及ICAM-1表达的影响

为了研究蛋白酶体抑制剂硼替佐米对急性白血病K562细胞株核因子κB（NF-κB）及细胞间黏附分子（ICAM-1）表达的影响，用含10％小牛血清的RPMI 1640培养液体外培养K562细胞，用0、10、20、30、50、100nmol/L的硼替佐米干预K562细胞6小时后收集细胞。用SP免疫组织化学法测各组细胞NF-κB活性，并以反转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析K562细胞ICAM-1表达的变化。结果表明：各药物处理组K562细胞NF-κB的活性和ICAM-1的表达均明显受抑制，与对照组相比，存在显著性差异（P〈0．05），且各组NF-κB活性与ICAM-1表达成正相关。结论：蛋白酶体抑制剂硼替佐米可能通过抑制NF-κB活性下调细胞间黏附分子ICAM-1的表达，这为白血病靶向治疗提供了一个新的途径。     

骨髓间充质干细胞对异体自然杀伤细胞调节作用的研究

本研究探讨骨髓间充质干细胞(MSC)对异基因自然杀伤细胞(NK)和NK-T细胞增殖和杀伤功能的影响。分离健康供者外周血单个核细胞,在抗人CD3单克隆抗体、IL-2和PHA诱导下培养扩增NK和NK-T细胞,用流式细胞术分析MSC共培养对扩增体系中NK和NK-T细胞比例的影响,MTT法观察MSC对NK细胞杀伤K562细胞的影响。结果表明:高密度MSC能抑制NK细胞的生成,MSC在0、1×105/ml和5×105/ml时培养体系中NK细胞的比例分别为(16.9±4.6)%、(14.0±8.6)%和(6.4±4.6)%,统计学分析有显著意义(P<0.05),但MSC在低密度条件下(1×104/ml)可促进NK细胞的生成,NK细胞比例可达(20.9±7.1)%,与无MSC相比有统计学意义(P<0.05)。MSC剂量的变化对共培养体系中NK-T细胞的比例无明显影响。MTT法检测结果显示,共培养体系中K562细胞杀伤作用与NK细胞比例平行,不同密度MSC可能通过对NK细胞比例的双向调节而调节NK细胞对K562细胞的杀伤作用。结论:MSC在低剂量时可促进NK细胞形成并增强其肿瘤杀伤作用,但在高剂量时可抑制NK细胞形成从而抑制其对肿瘤细胞的杀伤作用。     

蛋白酶体抑制剂对多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞迁移能力及其肝细胞生长因子表达的影响

本研究探讨蛋白酶体抑制剂硼替佐米对多发性骨髓瘤(MM)患者骨髓间充质干细胞(MSC)迁移能力及其肝细胞生长因子(HGF)基因表达水平的影响。应用Transwell模型观察MM患者骨髓MSC经2.5 nmol/L硼替佐米处理前后的体外迁移能力,实时定量PCR检测MSC的HGF mRNA的表达水平。结果表明,经2.5 nmol/L的硼替佐米作用48小时后,MSC的迁移能力明显低于对照组,并且HGF mRNA在MSC的表达与对照组相比也明显降低,两者结果均具有统计学意义(p<0.05)。结论:硼替佐米可抑制MM患者骨髓MSC的迁移,同时可下调其趋化相关因子HGF的表达。     

人骨髓间充质干细胞对K562细胞增殖和化疗敏感性的影响

本研究比较K562细胞与正常人骨髓间充质干细胞（MSC）黏附培养前后细胞增殖、化疗敏感性及MDR1变化，以寻找白血病耐药与造血微环境的关系。对悬浮培养和与MSC黏附培养的K562细胞绘制细胞生长曲线；用流式细胞术测定细胞周期并观察化学药物对细胞存活率和凋亡的影响；用RT-PCR技术检测MDR1基因表达。结果表明：与悬浮培养比较，黏附培养K562细胞增殖受抑，G0／G1期细胞比例增加（P〈0．05），S期细胞比例下降（P〈0．05），G2／M期细胞比例增加（P〈0．01）。在柔红霉素（DNR）诱导的凋亡中，黏附培养组K562细胞凋亡受阻（P〈0．05）。黏附培养未诱导K562细胞MDR1基因表达，也未使K562／ADM细胞的MDR1基因表达发生改变。结论：K562细胞与MSC黏附接触共培养，可导致K562细胞生长抑制，并产生化疗耐药，其机制可能与MDR1无关。     

WT1反义寡核苷酸对白血病细胞增殖和凋亡的影响

目的 了解ＷＴ１反义寡核苷酸对白血病细胞增殖和凋亡的影响。方法 应用ＷＴ１基因的反义寡核苷酸（ＷＴ１ＡＳＯ）处理Ｋ５６２、Ｕ９３７、ＨＬ－６０细胞系,白血病患以及正常人骨髓细胞,然后以台盼蓝拒染法、细胞集落法及流式细胞仪检测法确定白血病细胞的增殖和凋亡。结果 ＷＴ１ ＡＳＯ能够抑制ＷＴ１表达阳性的Ｋ５６２细胞生长,对ＷＴ１表达阴性的Ｕ９３７细胞则无抑制作用;ＷＴ１ ＡＳＯ对８例急性髓系白血病患