Ⅱ型糖尿病大鼠颌骨骨髓基质干细胞体外培养及其成骨特性观察

目的:观察Ⅱ型糖尿病大鼠颌骨骨髓基质干细胞(BMSCs)的成骨分化特性。方法:无菌条件下从10周龄GK大鼠(实验组)及同龄正常Wistar大鼠(对照组)下颌骨获取BMSCs,采用全骨髓贴壁培养法对细胞进行纯化及培养,流式细胞仪检测干细胞表型.取第3代细胞成骨诱导培养,分别对两组细胞行茜素红染色,碱性磷酸酶染色及活性测定,培养基钙、磷含量测定,以及real-time PCR测定Runx2基因表达变化。结果:成功培养出Ⅱ型糖尿病大鼠颌骨来源的BMSCs,与正常组比较,实验组BMSCs茜素红染色变浅、钙结节形成减少,碱性磷酸酶(ALP)活性下降,细胞钙、磷分泌显著降低,差异有统计学意(P<0.05);Runx2 mRNA表达也明显降低(P<0.05)。结论:Ⅱ型糖尿病大鼠颌骨来源的BMSCs的成骨分化能力受到损害,并且即使在正常糖浓度下培养其成骨能力仍无法恢复。     

大鼠骨髓间充质细胞诱导成骨的体内外研究

目的研究大鼠骨髓间充质细胞(BMSCs)体内外成骨的能力。方法分离大鼠BMSCs,将原代细胞分别应用普通培养基(CM)、成骨诱导培养基(OM)诱导培养。应用碱性磷酸酶(ALP)活性和钙结节染色法检测体外成骨分化能力。建立裸鼠成骨模型,测定体内成骨能力。结果 OM组可明显诱导BMSCs成骨分化,表现出高水平的ALP活性和基质矿化能力。OM加骨粉组裸鼠培养8周后,镜下观察到广泛的新骨形成,而单纯OM组或骨粉组未见成骨。结论 OM可明显诱导BMSCs体外成骨分化,与骨粉联合应用能诱导体内异位骨形成。     

稀土元素铈对骨髓间充质干细胞成骨分化调控的体外实验研究

目的:研究铈离子对体外培养的骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化能力的影响。方法:分离培养小型猪骨髓间充质干细胞,分别用含有1×10-5mol/L CeCl3的成骨诱导液和单纯成骨诱导液进行培养;然后用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测两组细胞诱导培养1、7、14、21 d的ALP活性;用实时荧光定量PCR分析两组细胞诱导培养14 d时的成骨相关基因Runx2、BSP、OCN mRNA的表达水平。结果:诱导培养1、7、14、21 d后,CeCl3组各时间点的ALP活性均较对照组显著增加(P<0.05);诱导14 d后,CeCl3组的各成骨相关基因Runx2、BSP、OCN mRNA表达水平均显著高于对照组(P<0.05)。结论:CeCl3能促进BMSCs的成骨分化。     

BMP受体在大鼠骨髓间充质细胞成骨中的作用

目的:研究骨形成蛋白受体(BMP-R)在大鼠骨髓间充质细胞(BMSCs)成骨中的作用机制。方法:分离大鼠BMSCs,将原代细胞分为4组,分别应用普通培养基(CM)、成骨诱导培养基(OM)、骨形成蛋白-2(BMP-2)和OM+BMP-2诱导培养基培养。应用碱性磷酸酶(ALPase)活性和钙结节染色(Von Kossa法)检测成骨分化程度,RT-PCR检测骨形成蛋白受体(BMP-R)的表达情况。采用SPSS16.0软件包对数据进行单因素方差分析。结果:OM可诱导BMSCs成骨分化,表现出高碱性磷酸酶活性和基质矿化能力。BMP-2可提高OM诱导BMSCs成骨分化的能力;OM在早期即可诱导BMP-RⅠA和BMP-RⅡ的表达,而BMP-2诱导BMP-R较迟。结论:BMP-2可提高OM诱导BM-SCs分化成骨的能力,BMP-R在BMSCs分化成骨中起重要作用。     

骨髓基质细胞的体外培养和成骨方向的诱导分化

目的:体外分离狗的骨髓基质细胞,诱导其成骨分化并鉴定成骨活性.方法:体外分离培养狗的骨髓基质细胞,传代培养中加入10-8rnol/L地塞米松、50 μg/ml维生素C和10mmol/L β-甘油磷酸钠进行诱导分化,进行细胞形态和增殖观察,矿化结节Von Kossa染色,细胞碱性磷酸酶染色和Ⅰ型胶原免疫组化染色检测其成骨活性.结果:骨髓基质细胞经诱导后表现出明显的成骨活性,体外矿化结节Von Kossa钙染色阳性;传代细胞碱性磷酸酶染色阳性,酶活性＞80%,Ⅰ型胶原免疫组化染色强阳性.结论:体外分离培养的骨髓基质细胞中含有骨源性前体细胞,传代细胞具有较强的成骨潜能.     

犬骨髓基质细胞向成骨细胞诱导分化的实验研究

目的:研究犬骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)在体外诱导分化为成骨细胞的方法和活性检测。方法:抽取犬骨髓3 mL,使用成骨条件培养液,贴壁法体外培养,将培养的第2、3代细胞进行透射电镜、流式细胞仪、生长曲线、碱性磷酸酶、Von Kossa和免疫组化等检测。结果:第2代细胞碱性磷酸酶染色呈阳性表达;第3代细胞Von Kossa染色、骨桥素、骨涎蛋白和骨钙蛋白呈阳性表达;第3代细胞透射电镜显示高尔基体和线粒体丰富;流式细胞仪检测显示第3代处于S期的细胞比例较第2代增加。结论:犬骨髓基质细胞在体外能定向诱导分化为成骨细胞。     

骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的培养方法及生物学特性鉴定

目的：探索骨质疏松大鼠（OVX）骨髓间充质干细胞（BMSCs）的培养方法,进行鉴定并观察其生物学特性,、方法：通过去卵巢法构建SD大鼠骨质疏松模型,在OVX组大鼠和假手术组（Sham）大鼠．分别冲取不同部位（肱骨、股骨和胫骨）的骨髓,贴链法分离纯化BMSCs,并通过MTT法检测其增殖活性,流式细胞仪检测其表面抗原：对BMSCs进干成骨、成脂诱导,并与Sham组BMSCs对比,观察OVX组BMSCs成骨、成脂肪分化的差别。结果：在OVX大鼠,尢法培养…股骨中的BMSCs,可培养出胫骨和肱骨的BMSCs,但前者细胞量少,后者量多：与Sham组相比较．成骨诱导后OVX组BMSCs的碱性磷酸酶活性和骨钙素分泌均较低;成脂诱导后,OVX组BMSCs生成的脂滴数目较多。结论：通过选取肱骨骨髓,加大细胞培养密度,可以成功培养出OVX大鼠的BMSCs,细胞量明显多于其他部位骨髓．町满足实验的样本量要求;大鼠BMSCs（OVX）具有增殖速率低、成骨能力弱、成脂能力强的生物学特性．     

低氧诱导因子-1α对兔骨髓间充质干细胞成骨作用的实验研究

目的:探索一定浓度的低氧诱导因子-1α对兔骨髓间充质干细胞体外成骨分化的影响。方法:全血培养法培养兔BMSCs,根据不同浓度HIF-1α分为四组:1基础培养2基础培养+50ng/ml 3基础培养+100ng/ml 4基础培养+200ng/ml,三天更换一次培养基,第1天至第7天,用MTT法分析细胞增殖情况,绘制细胞生长曲线。在第7天和第14天进行碱性磷酸酶(ALP)染色及半定量检测。结果:原代兔BMSCs培养10天可见细胞克隆,放射状生长,传代后细胞生长旺盛,长梭形,铺满皿底。MTT检测显示基础培养+100ng/ml组相对其它各组细胞增殖旺盛,第14天时,碱性磷酸酶染色及半定量检测显示基础培养+100ng/ml组促进其表达。讨论:骨替代材料由于没有骨诱导性,成骨能力受到限制,细胞因子可以刺激和诱导细胞增殖、分化,近年研究发现HIF-1α可以促进VEGF的表达,进而影响BMSCs成骨分化,ALP是细胞成骨分化的标志,100ng/ml的HIF-1α组ALP活性增强。结论:100ng/ml的HIF-1α可以促进BMSCs体外分化成骨,为骨缺损修复提供了理论依据。     

骨髓基质干细胞诱导内皮细胞与自体骨髓基质干细胞低氧条件下培养后的成骨能力

目的:探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导内皮细胞(ECs)与自体BMSCs低氧条件下联合培养对BMSCs成骨能力的影响.方法:体外分离培养兔BMSCs并向ECs诱导培养,用CD34免疫细胞化学染色鉴定内皮细胞表型:实验分组为BMSCs常氧成骨诱导培养组,BMSCs低氧成骨诱导培养组,BMSCs+ ECs常氧成骨诱导联合培养组BMSCs+ECs低氧成骨诱导联合培养组,持续培养7d,前6d应用PNPP法每天固定时间测定碱性磷酸酶(ALP)活性并作统计学分析;茜素红染色观察第7d矿化结节形成情况.低氧组为1.0％O2浓度.采用SPSS11.0软件包对数据进行方差分析和q检验.结果:BMSCs在一定诱导条件下可诱导为ECs,CD34免疫细胞化学染色为阳性;统计学分析表明,BMSCs+ ECs低氧成骨诱导联合培养组的ALP活性表达显著高于其他3组(P＜0.05).只有BMSCs+ ECs低氧成骨诱导联合培养组有钙化结节形成,茜素红染色呈橘红色.结论:在一定时间内,由BMSCs诱导来源的ECs与自体BMSCs低氧条件下联合培养,BMSCs的成骨活性可显著提高.     

体外诱导鼠骨髓间充质干细胞构建人工骨的研究

目的：体外诱导鼠骨髓间充质干细胞，与聚乳酸-聚羟基乙酸支架材料体外复合构建人工骨进行研究。方法：分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，并进行体外诱导和成骨能力检验；而后与聚乳酸-聚羟基乙酸支架材料复合构建三维培养体系，进行扫描电镜、碱性磷酸酶和骨钙素活性检测。结果：对已构建三维培养体系，扫描电镜检测见有大量细胞粘附生长；均检测到碱性磷酸酶和骨钙素活性。结论：已构建三维培养体系内鼠骨髓间充质干细胞仍具有良好的增殖能力和成骨活性，可用于构建人工骨。     

生物吸收性多孔碳酸化羟基磷灰石支架的骨传导性体外研究

目的:通过体外实验对新型生物吸收性多孔碳酸化羟基磷灰石(CAP)支架材料的骨传导性进行评价。方法:体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,向成骨诱导后,定植于不同孔隙率及不同碳酸根含量的CAP支架材料上共同培养,通过扫描电镜、细胞黏附及增殖检测(MTT法)、碱性磷酸酶(ALP)定量检测、骨钙素(OCN)定量检测,评价成骨细胞在支架材料上的附着、增殖和分化情况。结果:成骨细胞定植于不同孔隙率及碳酸根含量的支架材料上,4 h均已开始黏附、且增殖情况良好。分化实验中,ALP和OCN在各组支架材料分化良好。不同孔隙率支架材料组间比较,40%孔隙率的实验组对ALP分化的促进作用有明显优势。结论:CAP支架材料有良好的生物相容性和骨传导性,是一种良好的组织工程支架材料。     

犬自体血清培养骨髓基质细胞的实验研究

目的:探讨犬自体血清培养骨髓基质细胞的可行性方法:获取犬自体血清,配制成含10%和20%自体血清的培养液,与含10%胎牛血清的培养液在相同条件下培养犬骨髓基质细胞(BMSCs)。通过倒置显微镜下观察细胞形态,细胞计数以及MTT法对细胞增殖情况进行检测。并且对第2代细胞用3种不同血清成分培养液(均加入β-甘油磷酸钠、抗坏血酸及地塞米松)进行成骨诱导分化,采用免疫组化检测碱性磷酸酶及钙结节形成。对检测到的量化数据做统计学分析,比较各组间的差异,以评价不同血清成分培养液对细胞增殖分化的影响。结果:3组细胞的生长及形态无明显差别,经过诱导培养均能形成钙结节。对3组间量化检测做统计学分析,各组间差异无统计学意义。结论:制备的犬自体血清能完全替代胎牛血清对骨髓基质细胞进行诱导培养。     

Ⅰ型骨质疏松症大鼠骨髓基质细胞体外培养及分化研究

目的　研究在构建的Ⅰ型骨质疏松症大鼠动物模型中,骨髓基质细胞( BMSCs)的生物学特性及其成骨和 成脂分化能力。方法　16只6月龄雌性SD大鼠随机分为实验组和对照组,实验组行双侧卵巢切除建立Ⅰ型骨质 疏松动物模型,对照组切除卵巢周围少量脂肪组织。术后3个月处死动物,非连续密度梯度离心分离骨质疏松大 鼠的BMSCs,传代后分别在成骨及成脂培养基中诱导培养14 d,观察细胞形态,通过组织特染对BMSCs的成骨、成脂 表型进行鉴定,计数阳性染色细胞百分比。结果　构建的Ⅰ型骨质疏松大鼠模型大鼠体重及整体股骨骨矿物质密 度(BMD)与对照组比较差异有显著性(P<0.01 );诱导培养后两组大鼠BMSCs碱性磷酸酶(ALP )、Von Kossa′s染色 和油红O染色实验阳性,且两组细胞阳性染色率无明显差别(P>0.05)。结论　本实验成功建立了大鼠骨质疏松 症模型,骨质疏松症大鼠BMSCs保持分化能力。     

葛根素诱导人骨髓间充质干细胞成骨分化的研究

［摘要］ 目的 通过体外实验探讨不同浓度的葛根素诱导骨髓间充质干细胞（bone marrow-mesenchymal stem cells,BMSCs）骨组织分化的作用以及与Notch信号通路之间的关系。方法 根据葛根素的浓度,实验分为6组。取3周的SD大鼠分离培养BMSCs,传至第3代后接种细胞,改用不同分组的培养基。继续培养2~4周,测定碱性磷酸酶（ALP）与骨钙素（OC）的含量,评价葛根素的体外诱导成骨能力。用Elisa试剂盒测定Delta样配体4 （DLL4）的含量,评估葛根素的促成骨作用与Notch信号通路的关系。〖HTH〗结果〖HTSS〗 不同浓度组的细胞出现与典型成骨细胞相似的形态特征和生物学特性,ALP、OC和DLL4含量增加,但以1×10-5 mol/L组显著高于对照组,比其他浓度组要高,但是差异无统计学意义。〖HTH〗结论〖HTSS〗 葛根素能有效促进BMSCs向成骨方向分化,以10-5 mol/L浓度效果最佳,其作用机制可能与Notch信号通路有关。     

淫羊藿苷对犬骨髓间充质干细胞增殖、成骨和成脂分化的影响

目的:研究淫羊藿苷对犬骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖和成骨、成脂分化的影响。方法:将淫羊藿苷配制成终浓度为1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4 mol/L的溶液,以0 mol/L组为空白对照组,分别用于体外培养犬BMSCs。CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况,碱性磷酸酶试剂盒检测碱性磷酸酶活性。然后实验分为淫羊藿苷组和对照组,分别在含或不含成骨、成脂诱导液条件下,行成骨、成脂诱导分化实验,通过茜素红和油红O染色检测各组钙沉积和脂质形成面积。结果:发现淫羊藿苷1×10-6 mol/L组促进犬BMSCs增殖,而1×10-4mol/L组抑制增殖。碱性磷酸酶活性与淫羊藿苷浓度呈剂量依赖性关系。不含成骨、成脂诱导液条件下,各组均几乎未见明显钙沉积和脂质形成;含成骨、成脂诱导液条件下,淫羊藿苷组(1×10-6 mol/L)钙沉积面积高于对照组,脂质形成面积低于对照组。结论:淫羊藿苷能促进犬BMSCs增殖和成骨分化,并抑制其成脂分化。     

间接共培养诱导大鼠骨髓间充质干细胞向牙周膜成纤维样细胞分化

目的：探讨通过间接共培养诱导骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）向牙周膜成纤维细胞（Periodontal ligament fibroblasts,PDLFs）分化的可行性。方法：将大鼠BMSCs与PDLFs间接共培养,分别于不同时间段检测碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）活性以及骨钙素（Osteocalcin,OCN）、Ⅲ型胶原（Collagen typeIII,COLⅢ）mRNA表达的变化。结果：间接共培养后的BMSCs表现出类似PDLFs的性质,各检测指标与单独培养的PDLFs无统计学差异,与单独培养的BMSCs有统计学差异。结论：牙周膜成纤维细胞通过旁分泌机制可以诱导骨髓间充质干细胞向其分化。     

静电纺聚己内酯/壳聚糖纳米纤维膜诱导骨髓间充质细胞成骨分化的研究

目的：观察静电纺聚己内酯/壳聚糖纳米纤维膜对骨髓间充质细胞（BMSCs）粘附、增殖和成骨分化的影响。方法：通过静电纺丝技术制备聚己内酯/壳聚糖纳米纤维膜,将第4代BMSCs接种于纤维膜,扫描电镜、碱性磷酸酶（ALP）和茜素红染色、MTT检测BMSCs粘附、分化及增殖能力。结果：在静电纺丝技术制备的聚己内酯/壳聚糖纳米纤维膜表面,BMSCs的黏附和增殖增强,呈现明显升高的ALP活性,并形成矿化结节,提示具有向成骨细胞方向分化的倾向。结论：静电纺聚己内酯/壳聚糖纳米纤维膜对BMSCs的细胞相容性较好,适合BMSCs的黏附生长,具有诱导其向成骨细胞分化的潜能,有望成为一种新型牙周组织工程支架材料。     

兔骨髓间充质干细胞的体外分离培养、鉴定及向成骨细胞分化诱导

目的:探讨体外分离培养、鉴定兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法,并观察其向成骨细胞分化的潜能。方法:采用贴壁分离法分离培养兔BMSCs,通过细胞形态学观察和细胞表面抗原检测对细胞进行鉴定,并向成骨细胞分化诱导培养,通过钙钻法检测碱性磷酸酶表达,茜素红染色观察钙结节形成能力。结果:分离培养3d,可见贴壁细胞呈三角形、成纤维形或多角形外观,培养10～12d细胞长满瓶底,传代后细胞增殖明显加快;使用条件培养基传代培养2周,细胞呈集落生长后开始形成钙结节,茜素红染色阳性。结论:全骨髓贴壁法是一种简单实用的分离培养方法,可获得纯度较高的兔BMSCs,经过诱导后可向成骨细胞分化。     

SD大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养鉴定及骨向诱导分化研究

目的：建立骨髓间充质干细胞（MSCs）体外分离培养体系,并进行骨向分化诱导以探讨大鼠MSCs的体外培养方法及向成骨细胞分化的条件。方法：采用全骨髓贴壁筛选培养法分离成年SD大鼠MSCs,经条件培养液诱导培养后,进行细胞形态学观察、绘制细胞生长曲线、免疫细胞化学检测及碱性磷酸酶活性、钙结节的形成测定。结果：SD大鼠MSCs在体外分离培养扩增形态呈长梭形,细胞生长曲线呈S形。诱导条件下,细胞碱性磷酸酶活性明显增高,并出现了矿化结节。结论：SD大鼠MSCs体外分离培养体系能够成功建立,培养出的细胞能向成骨细胞分化,可以作为骨组织工程的种子细胞。     

外源性TGF-β1诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肌成纤维细胞分化的实验研究

目的　探讨大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs(bone marrow mesenchymal stem cells)的分离、培养、扩增方法及外源性转化生长因子TGF-β1(Transforming growth factor-1)诱导BMSCs向肌成纤维细胞定向分化的可能性,为放射性诱导的颌骨纤维化提供体外理论依据。方法　取大鼠股骨的骨髓,全髓培养法分离培养骨髓间充干细胞;培养至第三代时分别用+/-TGF-β1的2组诱导培养基定向分化诱导;诱导2周后显微镜下观察细胞形态变化,Real-time PCR检测细胞的基因表达情况;细胞爬片行免疫组化鉴定α-SMA及胶原纤维的表达。结果　大鼠股骨骨髓组织中可分离出骨髓间充质干细胞,体外生长形态类似成纤维细胞,呈梭型、纺锤型,定向诱导后TGF-β1组细胞可表现出肌成纤维细胞的特性（α-SMA+）,同时伴有COLⅠ、COLⅢ、α-SMA基因的高表达。结论　从大鼠股骨骨髓组织中可分离出骨髓间充质干细胞,TGF-β1能定向诱导BMSCs向肌成纤维细胞方向分化,为放射诱导的颌骨纤维萎缩机制提供了体外理论依据。