未成熟鼠慢性缺氧缺血脑损伤胶质细胞及髓鞘相关蛋白变化

目的 观察3日龄未成熟大鼠慢性缺氧缺血脑损伤胶质细胞凋亡及髓鞘相关蛋白（MBP和PLP）变化,研究早产儿脑损伤的发病机制。方法 将164只3日龄同窝生SD未成熟新生大鼠随机分为实验组92只和对照组72只,对照组仅切开颈部皮肤,而实验组结扎双侧颈总动脉,造成未成熟鼠缺氧缺血脑损伤,分别于不同时间点处死大鼠,采用组织切片苏木精-伊红染色、少突胶质细胞抗体O4和细胞凋亡免疫组化双标记、RT—PCR实时绝对荧光定量检测等方法,观察未成熟鼠脑损伤的病理变化、少突胶质细胞凋亡及MBP和PLP mRNA的表达。结果 实验组未成熟鼠出现脑白质液化疏松、小胶质细胞增生和脑室扩大等病理变化,深部白质凋亡细胞计数在损伤后24、48、72h和1周较对照组增多（P〈0．05）,以48h两组差异最为显著,损伤后2周两组无统计学差异（P〉0．05）。凋亡细胞经双标显示以少突胶质细胞为主。髓鞘相关蛋白mRNA的表达在损伤后较对照组减少。结论 3日龄未成熟新生大鼠缺氧缺血脑损伤后,出现以脑白质少突胶质细胞损伤为主的病变,有助于理解早产儿脑损伤发病机制和神经病理变化,并可作为研究早产儿缺氧缺血脑损伤的动物模型。     

基质金属蛋白酶在脑白质疏松症血-脑脊液屏障机制中的实验研究

目的 分析基质金属蛋白酶(MMPs)及其抑制物(TIMPs)的mRNA在脑组织的表达,探讨血-脑脊液屏障(BBB)损伤致脑白质疏松症(LA)发生的作用机制。方法 18只5月龄雄性自发性高血压(SH)大鼠为实验组,同龄7只雄性Wistar大鼠为对照组。取大鼠脑组织,应用HE染色及免疫组织化学染色,观察其病理变化及髓鞘碱性蛋白(MBP)、神经中丝(NF)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。取大鼠脑白质组织,使用Real-time PCR技术,检测MMP-9、MMP-2和金属蛋白酶组织抑制物-1(TIMP-1)mRNA的表达水平。结果 HE染色显示,SH大鼠脑白质区神经元和少突胶质细胞数量减少,星形胶质细胞反应性增生。实验组较对照组GFAP表达增加,而MBP和NF表达减少。实验组大鼠脑白质区TIMP-1、MMP-9和MMP-2 mRNA表达水平升高。其中,TIMP-1与MMP-2 mRNA升高显著(P＜0.05),而MMP-9 mRNA表达两组无显著性差异(P＞0.05)。结论 5月龄SH大鼠可作为脑白质疏松症的实验动物模型。MMPs导致的BBB破坏可能是脑白质疏松症的发病机制之一。     

ω-3多不饱和脂肪酸对新生儿缺血缺氧所致脑瘫的防治作用

【立论依据】 脑瘫是新生儿尤其是早产儿最常见最严重的并发症之一,缺血缺氧(HI)是主要原因,而脑白质是其主要损伤部位,其中的晚期少突胶质细胞前体(OPCs)是主要受损细胞。脑黄金DHA的主要成分(ω-3多不饱和脂肪酸, ω-3)对胎儿及婴儿的大脑特别脑白质的生长发育极为重要。但ω-3对HI所致脑瘫是否具有防治作用目前还不清楚,深入探究其在HI脑白质损伤中的作用,对新生儿脑瘫的及时干预有着重要意义。 【设计思路】 体外观察ω-3对培养OPCs缺氧条件下增殖、分化和凋亡等的作用;体内观察ω-3对HI模型脑白质损伤及动物行为学的影响,得出ω-3对新生儿HI所致脑瘫的防治作用。 【实验内容】 (1)ω-3对缺氧后OPCs的作用:体外培养OPCs,制作缺糖缺氧(OGD)模型,给予ω-3预处理以及缺氧后给药,LDH和MTT检测细胞受损和活性,BrdU、Ki67和PCNA免疫荧光观察细胞增殖,TUNEL染色显示细胞凋亡,免疫荧光、蛋白质印迹和q-PCR检测细胞PDGFR-α、A2B5、NG2、CNPase、PLP和MBP等少突胶质细胞相关蛋白和mRNA的表达。(2)ω-3对缺氧后脑白质损伤的影响:制备新生大鼠HI模型,预给予或缺氧后补充ω-3,不同时相点取材,免疫荧光、蛋白质印迹和q-PCR检测脑白质中PDGFR-α、A2B5、NG2、CNPase、PLP和MBP等少突胶质细胞相关蛋白和mRNA的表达,快蓝和Fluomeylin染色显示白质髓鞘的情况,BrdU、Ki67和PCNA免疫荧光染色检测细胞的增殖,TUNEL染色显示细胞的凋亡。(3)ω-3对缺氧模型大鼠成年后行为学的影响:应用旷场、斜杆、Y迷宫和Morris水迷宫等行为学测试,检测模型鼠成年后的运动能力和学习记忆能力。取材观察大脑重量、大脑的白、灰质分布以及神经反射速度。 【材料】 新生大鼠、缺氧罐、ω-3、各种细胞培养、分子生物学和免疫组织化学试剂。 【可行性】 以前研究表明ω-3对创伤后脑白质损伤具有保护作用,因此有理由推测ω-3对缺氧造成的脑白质损伤及少突胶质细胞损伤具有防护作用;指导教师一直进行脑缺氧方面的研究,可以提供指导和帮助。 【创新性】 本项目创新将ω-3引入新生儿脑瘫的防治研究,以期为HI性脑损伤的防治提供新措施。     

Ischemic cerebral white matter damage model of two-day-old rats:Experimental study

目的 建立未成熟大鼠脑白质损伤动物模型,观察缺血性脑白质损伤对2日龄大鼠脑细胞髓鞘碱性蛋白(MBP)表达及近、远期学习、记忆能力的影响.方法 2日龄SD新生大鼠108只随机分为正常对照组(n=28)、假手术组(n=28)及模型组(n=52).模型组予双侧颈总动脉永久性结扎,观察缺氧缺血后早期大鼠神经行为变化及1、2、3、7、14、35 d时体重、脑重以及脑组织病理改变,监测神经细胞凋亡、MBP蛋白表达及学习、记忆能力情况,干湿法测定术后3 d时脑组织含水量.结果 模型组大鼠体重、脑重增长不良,各时间点模型组大鼠的体重与正常对照组和假手术组比较,差异有显著性(P<0.05);模型组脑组织含水量明显高于正常对照组和假手术组(P<0.05).HE染色模型组大鼠出现脑室周围白质损伤.术后1、2、3、7 d模型组大鼠MBP积分光密度与正常对照组及假手术组比较明显降低,差异有显著性(P<0.05);Morris水迷宫试验、避暗试验、跳台试验的结果均差于正常对照组和假手术组,差异有显著性(P<0.05).结论 采用双侧颈总动脉结扎术导致大鼠脑白质损伤,可影响动物近、远期空间学习、记忆能力,推测其与少突胶质细胞凋亡、MBP蛋白表达降低有关.     

2日龄大鼠缺血性脑白质损伤模型的实验研究

目的建立未成熟大鼠脑白质损伤动物模型,观察缺血性脑白质损伤对2日龄大鼠脑细胞髓鞘碱性蛋白(MBP)表达及近、远期学习、记忆能力的影响。方法 2日龄SD新生大鼠108只随机分为正常对照组(n=28)、假手术组(n=28)及模型组(n=52)。模型组予双侧颈总动脉永久性结扎,观察缺氧缺血后早期大鼠神经行为变化及1、2、3、7、14、35 d时体重、脑重以及脑组织病理改变,监测神经细胞凋亡、MBP蛋白表达及学习、记忆能力情况,干湿法测定术后3 d时脑组织含水量。结果模型组大鼠体重、脑重增长不良,各时间点模型组大鼠的体重与正常对照组和假手术组比较,差异有显著性(P<0.05);模型组脑组织含水量明显高于正常对照组和假手术组(P<0.05)。HE染色模型组大鼠出现脑室周围白质损伤。术后1、2、3、7 d模型组大鼠MBP积分光密度与正常对照组及假手术组比较明显降低,差异有显著性(P<0.05);Morris水迷宫试验、避暗试验、跳台试验的结果均差于正常对照组和假手术组,差异有显著性(P<0.05)。结论采用双侧颈总动脉结扎术导致大鼠脑白质损伤,可影响动物近、远期空间学习、记忆能力,推测其与少突胶质细胞凋亡、MBP蛋白表达降低有关。     

人脐带间充质干细胞对新生鼠脑白质软化灶的神经保护作用

目的:探讨人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUcMSCs),对新生未成熟鼠脑室周围白质软化灶受损神经细胞的保护作用.方法:建立新生大鼠PVL(periventricular leukomalacia)动物模型,造模后随机分为两组.于第5天(P5d)分别给两组大鼠腹腔注射5-溴脱氧尿核苷(5-bromodeoxyuridine,BrdU)标记的第二代HUcMSCs[每只1×107(0.05 ml)-1]或0.05 ml PBS无菌溶液.24 h后(P6d)处死一组大鼠,行BrdU染色观察HUcMSCs在鼠脑内的迁移;另一组于移植HUcMSCs后14 d(P19d)行微型MRI(MicroMRI)扫描观察受损区域修复程度,髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)染色观察移植HUcMSCs对大鼠脑室周围脑白质损伤的保护.结果:HUcMSCs在宿主体内明显向侧脑室周围白质损伤区域迁移,且脑室周围存活少突胶质细胞数量明显多于注射PBS组,微型MRI扫描观察到HUcMSCs可缩小受损脑白质病灶,远期神经行为学观察到HUcMSCs移植组神经行为学高于PBS组(P<0.05).结论:HUcMSCs对新生大鼠PVL具有神经保护作用,可缩小病变范围.     

3,3'二吲哚甲烷对围产期缺血缺氧性脑病新生大鼠的保护作用

目的 探讨3,3’二吲哚甲烷(DIM)在围产期新生大鼠缺氧缺血性脑病(HIE)中的作用及其相关机制。方法 通过结扎在体妊娠足月孕大鼠双侧子宫动脉构建HIE动物模型,将新生大鼠分为假手术组、模型对照组、阳性对照组(尼莫地平0.4 mg/kg)、DIM高剂量组(DIM 20 mg/kg)、DIM低剂量组(DIM 10 mg/kg),Morris水迷宫实验测试其学习认知功能;苏木素伊红(HE)染色观察脑白质损害情况; RT-q PCR实验、Western blotting和免疫荧光实验检测胼胝体脑组织中髓鞘碱性蛋白(MBP) m RNA和蛋白的表达情况;免疫荧光实验检测少突胶质细胞前体细胞标记物血小板源性生长因子-α受体(PDGFR-α)和成熟少突胶质细胞标志物APC的表达; Western blotting实验检测胼胝体脑组织中钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca MKⅡ)、信号转导与转录激活因子3(STAT3)蛋白表达的变化。结果 与假手术组比较,模型对照组大鼠逃避潜伏期明显延长,穿越平台次数明显减少(P <0.05);脑白质区胼胝体组织结构疏松,细胞水肿,胼胝体中MBP m RNA...     

宫内感染对新生大鼠早期生长及神经行为发育的影响

探讨宫内感染对新生大鼠出生后早期生长发育和神经行为发育的影响。 通过将大肠埃希菌注入孕15 d的SD大鼠的子宫颈内建立宫内感染大鼠模型,并观察宫内感染对孕鼠分娩的影响。HE染色法观察新生大鼠脑白质组织病理学变化;免疫组织化学染色和蛋白质印迹法检测新生大鼠脑白质组织胶质细胞原纤维酸性蛋白（GFAP）、2′,3′-环核苷酸磷酸二酯酶（CNPase）、神经丝（NF）表达。随机监测新生大鼠早期生长发育和神经行为功能。 孕鼠宫内感染后,子宫和胎盘组织白细胞计数升高,提示建模成功,但宫内感染对分娩无显著影响。新生大鼠7日龄时脑白质部位结构稀疏呈筛网状改变,GFAP表达增加（P＜0.01）,而CNPase和NF表达减少（P＜0.05或P＜0.01）。与对照组新生大鼠比较,感染组新生大鼠出生体质量轻、体质量增长缓慢（P＜0.05或P＜0.01）;耳廓分离、睁眼、平面翻正、负趋地性、听觉惊恐和游泳试验等完成日龄延长（P＜0.05或P＜0.01）。 宫内感染可导致新生大鼠脑白质损伤,并引起新生大鼠早期生长发育及神经行为发育延迟。      

3日龄SD大鼠慢性脑缺血后脑室下区细胞的凋亡

目的观察3日龄SD大鼠慢性缺血脑损伤后脑室下区细胞凋亡情况,了解早产儿缺血后脑进一步损伤的发病机理,为干预治疗提供时间窗实验依据。方法3日龄新生SD大鼠随机分为对照组和实验组。实验组结扎双侧颈总动脉,造成未成熟鼠慢性脑缺血脑损伤模型;对照组双侧颈总动脉不结扎,组织切片HE染色定位,采用TUNEL法分别观察脑室下区背侧、前端细胞凋亡变化。结果脑室下区背侧、前端凋亡细胞分别计数发现在缺血48、72h和1周后较对照组增多(P<0.01),于72h时间点两组差异最为显著(背侧:实验组87.0±11.5,对照组60.9±7.1;前端(冠状位):实验组86.1±5.5,对照组56.4±5.6;前端(矢状位):实验组69.1±3.5,对照组44.0±2.3,P<0.01),损伤后2周两组差异无统计学意义(P>0.05)。结论3日龄SD大鼠慢性脑缺血后脑白质损伤外,神经生发区之一:脑室下区细胞对缺氧缺血敏感,易发生凋亡,其可能为早产儿脑白质进一步损伤的机制之一,同时此模型提示慢性缺血缺氧可致神经元再生不足,提示缺血后48~72h可能为防止脑室下区损伤的时间窗。     

脑缺氧缺血对不同年龄小鼠脑组织神经干细胞增生与分化的影响

目的：探讨脑缺氧缺血损伤（HI）对不同年龄小鼠脑组织神经干细胞增生与分化的影响。方法：结扎9d龄（P9）、21d龄（P21）C57／BL6小鼠（各10只）左侧颈总动脉后分别给予吸入体积分数为7．7％氧气的氮氧混合气35min（P9小鼠）／30min（P21小鼠）,制成脑HI模型,选取相应天龄正常对照组小鼠各5只,连续腹腔注射新生细胞标记物5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）7d,并分别于末次注射后4周处死小鼠并取脑,采用免疫组织化学染色及免疫荧光染色法分别以成熟神经元细胞标记物、少突细胞标记物、新生小胶质细胞标记物以及星形胶质细胞标记物检测不同日龄小鼠神经干细胞增生与细胞分化情况。结果：细胞增生随着脑组织发育快速下降;HI后P9小鼠皮层和纹状体的BrdU阳性细胞数显著增加,而在P21小鼠,大量的新生细胞仅发现于纹状体区;P9小鼠在皮层和纹状体区、P21小鼠仅在纹状体区检测到极少量新生细胞为成熟神经元细胞,多数分化为胶质细胞;HI后,P9小鼠3种新生胶质细胞在皮层和纹状体区均显著增高,P21小鼠仅发现在纹状体区新生小胶质细胞和星形胶质细胞均增加,新生少突细胞无明显改变。结论：适中的HI损伤可诱导神经干细胞增生和存活,细胞增生和分化与大脑区域和年龄相关。