TGF—β诱导骺板肥大区软骨细胞向成骨样细胞分化

目的 通过研究转化生长因子－β（TGF－β）对骺板软骨细胞分化的作用,揭示TGF－β软骨内成骨的作用机制。方法 采用鸡胚股骨无血清培养、酶组化检测碱性磷酸酶（ALP）、免疫组化检测Ⅰ型胶原、纤维粘连蛋白（FN）等方法,观察TGF－β在不同作用时间和剂量时对骺板肥大区软骨细胞分化的作用。结果 TGF－β可使肥大区软骨细胞表达Ⅰ型胶原和FN,使ALP表达增加,并存在着量效和时效关系。结论 TGF－β可以诱导鸡胚股骨骺板肥大区软骨细胞向成骨样细胞分化,与TGF－β的作用剂量和时间密切相关。     

转化生长因子-β对骺软骨细胞增殖和PCNA表达的影响

采用14天鸡胚股骨无血清培养、5-溴尿嘧啶核苷(BrdU)掺入标记和细胞核增殖抗原(PCNA)免疫染色方法,研究转化生长因子-β(TGF-β)对骺软骨细胞增殖的作用.结果显示:BrdU阳性软骨细胞数目与分布部位与TGF-β作用剂量和时间密切相关,TGF-β可以促进骺板成熟区和肥大区软骨细胞增殖,与BrdU标记相比,PCNA阳性细胞分布区域和数目远多于前者,根据染色情况可以将PCNA阳性细胞分为S期和非S期细胞两种.结论:TGF-β参与和调节骺软骨各部位软骨细胞增殖活动,并能诱导非增殖软骨细胞表达PCNA,用PCNA作为细胞增殖的指标是不适宜的.     

转化生长因子—β对骺软骨细胞增殖和PCNA表达的影响

采用１４天鸡胚股骨无血清培养、５－溴尿嘧啶核苷（ＢｒｄＵ）掺入标记和细胞核增殖抗原（ＰＣＮＡ）免疫染色方法，研究转化生长因子－β（ＴＧＦ－β）对骺软骨细胞增殖的作用。结果显示：ＢｒｄＵ阳性软骨细胞数目与分布都位于ＴＧＦ－β作用剂量和时间密切相关，ＴＧＦ－β可以促进骺板成熟区和肥大区软骨细胞增殖，与ＢｒｄＵ标记相比，ＰＣＮＡ阳性细胞分布区域和数目远多于前者，根据染色情况可以将ＰＣＮＡ阳性细胞分为Ｓ期和Ｓ期细胞两种。结论：ＴＧＦ－β参与和调节骺软骨各部位软骨细胞增殖活动，并能诱导非增殖软骨细胞表达ＰＣＮＡ，用ＰＣＮＡ作为细胞增殖的指标是不适宜的。     

miR-145在间充质干细胞来源软骨细胞肥大化中的作用

目的 探讨miR-145对间充质来源软骨细胞肥大化的调控作用.方法 用肥大化完全诱导培养基对间充质干细胞进行软骨细胞肥大化诱导,检测肥大化相关基因表达,确定间充质来源软骨细胞肥大化诱导成功.实验分为转染antagomiR-145(miRNA拮抗剂)组和对照组,应用qRT-PCR检测miR-145对软骨细胞肥大化标志基因X型胶原(Col X)、成纤维细胞生长因子受体-1(FGFR-1)和基质金属蛋白酶-13(MMP-13)转录水平的影响.结果 转染antagomiR-145可以延缓间充质来源软骨细胞肥大化进程.转染antagomiR-145后肥大化软骨细胞的标志物Col X、FGFR-1、MMP-13的表达量与对照组相比显著降低(P＜0.05),而ColⅡ的表达与对照组相比显著增多(P＜0.05).结论 抑制miR-145的表达能有效地延缓间充质干细胞向肥大化软骨细胞分化进程.     

转录因子Sox9调控软骨发育的研究进展

骨的发育主要有膜内成骨和软骨内成骨两种形式,其中软骨内成骨是体内大部分骨骼包括四肢骨、脊椎骨、颅底骨和一部分锁骨的发育形式.软骨内成骨包括软骨发生和生长板发育阶段.在软骨发生阶段,间充质干细胞分化为软骨细胞形成软骨原基.软骨原基是未来骨骼的雏形,原基内的软骨细胞有序分化、增殖和排列形成典型的生长板结构.软骨生长板在结构上包含4个分区:即静息区、增殖区、前肥大区和肥大区.静息区软骨细胞体积小呈圆形,细胞排列紧密,增殖少而且分化不成熟,表达Ⅱ型胶原蛋白(Col2a1).增殖区软骨细胞分裂旺盛,细胞扁平呈柱状排列.前肥大区为软骨细胞由增殖区向肥大区的过渡阶段.肥大区软骨细胞停止增殖进入终末分化阶段,细胞体积变大分泌一些特定的软骨基质如X型胶原蛋白(ColX)等.终末分化的软骨细胞最后发生生理性死亡,同时伴有成骨细胞、破骨细胞和血管侵入,成骨细胞分泌的骨基质最终取代软骨基质实现骨化.一系列的研究表明软骨内成骨受到多因素、多层次严格有序的调控,如全身性的生长激素和甲状腺素;软骨细胞分泌的Wnts、BMP、FGF、IGF和Ihh-PTHrp等信号[1].这些信号通过激活多种转录因子启动一系列基因表达,最终使软骨内成骨协调有序进行.近年来的研究表明,转录因子Sox9参与调控软骨内成骨的多个阶段的发育过程,包括软骨发生、生长板内软骨细胞的成熟、肥大等过程,本文就Sox9基因调控软骨发育的最新研究进展进行综述.     

TGF-β增强rhBMP-2诱导成骨中Ⅰ, Ⅱ型胶原及碱性磷酸酶的表达

目的 对β转化生长因子（TGF-β）增强人重组骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2)诱成骨中CollagenⅠ，Ⅱ及碱性磷酸酶（ALP）的表达进行研究。方法 BALB/c小鼠110只随机分为2组，每组55只，设立rhBMP-2/TGF-β为实验组，rh-BMP-2为对照组，分别于3-21d共8个时间点取材，采用免疫组织化学方法对新生骨组织中的Ⅰ，Ⅱ型胶原进行检测；对ALP活性进行定量分析。观察2组在诱导成骨中CollagenⅠ，Ⅱ及ALP的表达情况。结果 Ⅱ型胶原的出现是和成软骨，软骨细胞的出现相伴随的，但是，肥大，变性的软骨细胞并不表达Ⅱ型胶原，作为成骨细胞成熟标志物的Ⅰ型胶原，ALP在软骨形成期即有表达，但是随着成骨细胞的出现，骨组织的形成Ⅰ型胶原仍表现为高表达，而ALP的表达则呈下降趋势。实验组CollagenⅠ，Ⅱ及ALP的表达早于对照组。结论 TGF-β增强了rhBMP-2诱导成骨中CollagenⅠ，Ⅱ及ALP的表达。     

转化生长因子-β3诱导大鼠前软骨干细胞成软骨分化的量效作用

目的研究转化生长因子-β3（TGF-β3）诱导大鼠前软骨干细胞（PSCs）向软骨方向分化的可行性以及剂量效应关系。方法在体外将分离纯化的大鼠PSCs置于含有不同剂量TGF-β3的诱导培养液中培养,依据其浓度分为5个实验组和1个对照组（不含TGF-β3）,观察细胞生长情况,分别进行Ⅱ型胶原的免疫组织化学检测及逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测Ⅱ型胶原mRNA表达。结果细胞生长良好。免疫组织化学检测对照组Ⅱ型胶原表达阴性,而含TGF-β3的诱导培养液诱导的各组细胞Ⅱ型胶原表达均阳性,其中10μg/L组阳性率最高。RT-PCR半定量检测也显示10μg/L组Ⅱ型胶原mRNA表达量最多,与其它组比较,差异均有显著意义（P〈0.05）。结论TGF-β3在体外能有效诱导PSCs向软骨细胞定向分化。TGF-β3对PSCs促分化作用存在剂量依赖性。     

间充质干细胞在构建组织工程软骨中的实验研究

目的探索利用几丁质支架和间充质干细胞(MSC)构建组织工程软骨。方法抽取兔股骨骨髓,密度梯度离心分离骨髓MSC,用转化生长因子β(1TGF-β1)诱导第3代的骨髓MSC向软骨方向分化,2周后用免疫组化检测Ⅱ型胶原表达情况。将分化后的软骨样细胞传代,接种在几丁质支架上,用含TGF-β1的培养基继续培养2周,再用免疫组化检测Ⅱ型胶原表达情况,并在电镜下观察软骨细胞的生长情况。结果骨髓MSC经TGF-β1诱导后,具有软骨细胞特点,接种在几丁质支架上继续培养2周,这些细胞在支架上生长良好,并仍能很好表达Ⅱ型胶原。结论MSC经TGF-β1诱导,分化成的软骨样细胞在几丁质支架上表型稳定,生长良好。     

miRNA-29b调控骨髓间充质干细胞来源的软骨细胞肥大化的作用研究

目的 探讨miR-29b在骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分化为软骨细胞时,对细胞肥大化进程的调控作用.方法 培养BMSCs并进行软骨细胞肥大化方向的诱导,检测软骨细胞标志基因Ⅱ型胶原(ColⅡ)、肥大化细胞标志基因X型胶原(Col X和Runx2),并用特异性染色法确定细胞肥大化诱导成功,再检测miR-29b在转录水平的表达情况.然后将实验分为miR-29b过表达(miR-29b mimics)和miR-29b抑制(miR-29b抑制剂)两组,每组分别设置空白对照组,分别检测两处理组中上述软骨细胞和肥大化细胞相关标志的表达变化.结果 miR-29b过表达组中,ColⅡ表达与对照组相比显著降低(P＜0.05),Col X和Runx2表达显著升高(P＜0.05);而miR-29b抑制组中,ColⅡ的表达与对照组相比显著升高(P＜0.05),Col X和Runx2显著降低(P＜0.05).结论 miR-29可以有效促进BMSCs向肥大化的软骨细胞分化,而抑制miR-29b可降低BMSCs来源的软骨细胞的肥大化.     

血管内皮生长因子在新生鼠胫骨生长板软骨细胞中的表达

目的：探讨血管内皮生长因子（VEGF）在鼠生长板软骨细胞增殖、分化和矿化过程中的自分泌作用。方法：新生鼠（1～2d）10只．切取干骺部软骨组织，采用免疫组织化学方法（5只）和RT—PCR方法（5只），检测VEGF及其受体Flt-1和KDR/Flk-1在胫骨生长板中的表达。结果：免疫组织化学染色VEGF、Fit-1和KDR／Flk-1在生长板的上肥大区、下肥大区和矿化区中的软骨细胞表达强阳性，在增殖区少数软骨细胞中呈阳性表达，在静止区软骨细胞中表达阴性。RT—PCR检测的5只鼠中除1只不表达Flt-1外，VEGF（251bp）、Flt-1（272bp）和KDR/Flk-1（252bp）在软骨组织中均清晰表达。结论：VEGF及受体Flt-1和KDR／Flk-1在生长板软骨中的表达具有高度一致性，并且随着软骨细胞的分化成熟表达逐渐增强。提示VEGF在生长板软骨细胞的增殖、分化和矿化过程中，可以自分泌作用方式起重要调节作用。     

无血清培养骺板细胞分泌TGF-β1的实验研究

目的观察骺板细胞在无血清培养液中的生长情况,并通过ELISA方法检测骺板细胞分泌TGF-β1。方法提取3周龄新西兰兔骺板组织,获得良好生物活性的骺板细胞。采用CCK-8生长曲线检测骺板细胞在无血清培养液中的生长增殖情况,并通过ELISA方法检测骺板细胞分泌TGF-β1。结果骺板细胞生长情况良好,分泌细胞外基质。AO/PI荧光染色显示存活的骺板细胞呈亮绿色,周围散在有少量红染的死细胞。骺板细胞在DMEM培养液以及无血清培养液培养时生长曲线形态基本相似,在1、2d时细胞增殖缓慢,之后增殖速度逐渐增加,6-7d逐渐进入平台期。第1天时骺板细胞开始释放TGF-β1,然后释放量逐渐增加,第6d时浓度达到167.2pg/ml。结论骺板细胞在无血清培养液中增殖情况良好并能分泌TGF-β1。     

转化生长因子-β及其受体在不同时期增生性瘢痕组织中的表达

目的:检测转化生长因子-β(TGFβ1、TGFβ2)和受体(TGFβRⅠ、TGFβRⅡ)在增生性瘢痕组织中的表达特征,探讨其对增生性瘢痕形成的作用。方法:采用免疫组化染色方法检测TGFβ1、TGFβ2、TGFβRⅠ、TGFβRⅡ在人正常皮肤组织及增生性瘢痕中的表达水平与定位。结果:在正常对照皮肤组织中,TGFβ1在基底细胞层呈弱阳性表达,在真皮成纤维细胞表达为阴性;TGFβ2在基底细胞层、棘细胞层下方、真皮层血管内皮细胞表达为阳性;TGFβRⅠ、TGFβRⅡ在表皮、毛囊上皮细胞、真皮层血管内皮细胞表达阳性,真皮成纤维细胞基本不表达。增生性瘢痕真皮组织中大量成纤维细胞的TGFβ1、TGFβ2、TGFβRⅠ、TGFβRⅡ表达均为强阳性;而部分瘢痕病史超过1年的患者瘢痕真皮层中主要为胶原组织,成纤维细胞较少,成纤维细胞TGFβ1、TGFβ2表达为阴性,但TGFβRⅠ、TGFβRⅡ的表达则为强阳性。结论:转化生长因子-β和受体在增生性瘢痕组织早期形成中发挥重要的促进作用。     

丹酚酸B对NIH/3T3成纤维细胞TGF-β1/ERK胞内信号转导的影响

目的探讨丹酚酸B(SA-B)影响TGF-β1/ERK信号转导的抗肝纤维化作用机制。方法NIH/3T3成纤维细胞常规培养后分为正常组、模型组和治疗组。正常组细胞以含0.5%FBS的M199培养,模型组和治疗组均在相同培养条件下,以100pmol/LTGF-β1刺激24h,治疗组在此基础上再分别以1μmol/LSA-B和10μmol/LSA-B同时温育24h。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活力;Western blot法观察细胞TGF-β受体蛋白表达、ERK蛋白表达与磷酸化水平、胞外基质蛋白表达等。结果不同浓度SA-B无明显细胞毒性;TGF-β1刺激明显促进细胞TGF-β受体蛋白表达、ERK磷酸化水平、纤维蛋白酶原激活物抑制因子(PAI-1)与Ⅰ型胶原的蛋白表达,SA-B剂量依赖性抑制TGF-βⅠ型受体(TβR-Ⅰ)的蛋白表达,抑制ERK磷酸化与PAI-1蛋白表达。结论SA-B抑制TGF-β1的胞内ERK信号转导,拮抗TGF-β1的促NIH/3T3成纤维细胞胶原生成可能是SA-B抗肝纤维化的作用机制之一。     

川芎嗪对IL-1β诱导的兔原代软骨细胞iNOS表达和NO合成的影响

目的观察川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)对IL-1β(interleukin-1β,IL-1β)诱导的兔原代软骨细胞诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)表达及一氧化氮(NO)合成的影响。方法体外培养兔软骨细胞,用甲苯胺蓝染色检测蛋白多糖,免疫荧光检测兔原代软骨细胞Ⅱ型胶原;用IL-1β10 ng/ml和(或)不同浓度(5、10、15、20μg/ml)川芎嗪共培养兔原代软骨细胞48 h后,RT-PCR和免疫组化检测iNOS基因及蛋白表达;用硝酸还原法检测细胞培养上清液NO的表达。结果软骨细胞呈三角形或多角形,蛋白多糖表达于细胞质中,Ⅱ型胶原主要表达于细胞质,少见于细胞核。与对照组比较,IL-1β单独作用软骨细胞iNOS和NO的表达显著增加(P<0.01);IL-1β和川芎嗪联合作用后,软骨细胞iNOS和NO的表达较IL-1β单独作用显著降低(P<0.05,P<0.01),但仍显著高于对照组(P<0.01)。结论川芎嗪能有效抑制IL-1β诱导兔软骨细胞iNOS的表达和NO的合成。     

丹酚酸A对心肌成纤维细胞在高浓度葡萄糖刺激下Wnt信号通路的影响

目的探讨丹酚酸A对高浓度葡萄糖诱导的心肌成纤维细胞（CFs）Wnt信号通路的影响及作用机制。方法采用高浓度葡萄糖刺激CFs构建细胞增殖模型,以22 mg/L卡托普利为西药对照,不同浓度丹酚酸A处理CFs。MTT比色法检测细胞的增殖能力,流式细胞术分析细胞增殖周期,ELISA法测定细胞中Ⅰ型、Ⅲ型胶原的生成和转化生长因子-β1（TGF-β1）蛋白的分泌,蛋白质印迹法检测β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β蛋白的表达水平。结果干预24、48 h,与模型对照组相比,25、50、100 mg/L丹酚酸A均可明显抑制细胞增殖（P < 0.01）。与模型对照组相比,25、50、100 mg/L丹酚酸A均能抑制CFs Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的分泌（P < 0.05~P < 0.01）;50、100 mg/L丹酚酸A均能明显抑制TGF-β1的合成及β-catenin的表达（P < 0.01）;100 mg/L丹酚酸A可以上调p-GSK-3β的表达（P < 0.05）。结论丹酚酸A可抑制高浓度葡萄糖诱导的CFs增殖、胶原蛋白分泌和TGF-β1的合成,其机制可能与抑制Wnt信号通路有关。     

延龄草皂苷通过抑制TGF-β/Smad3与Wnt/β-catenin信号通路改善大鼠肺纤维化

目的 探讨延龄草皂苷对肺间质纤维化大鼠的治疗作用及其可能机制。 方法 雄性SD大鼠50只,随机分为对照组,模型组,延龄草皂苷低、中、高剂量组［25 mg/(kg·d)、50 mg/(kg·d)和100 mg/(kg·d)］,每组10只。除对照组外,其余各组采用气管插管注入伯莱霉素法(5 mg/kg)建立大鼠肺纤维化模型;次日开始连续给药28 d。处死大鼠后,取肺组织称重并计算肺系数;进行HE和Masson染色观察小鼠肺组织形态病理学变化;ELISA法检测大鼠白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)的表达以及超氧化物歧化酶(SOD)的活性;Western blotting法检测大鼠肺组织中纤连蛋白(fibronectin)、胶原蛋白Ⅰ型(Collagen Ⅰ)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子-β(TGF-β)、SMAD同源物3(Smad3)、Wnt3a、β-连环蛋白(β-catenin)和糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)的蛋白表达水平。 结果 与模型组比较,延龄草皂苷低、中、高剂量组的肺系数降低;大鼠肺组织炎性细胞浸润、胶原沉积和纤维化程度改善;大鼠IL-1β、TNF-α、IL-6、MDA和ROS的表达水平降低, SOD的活性升高,发挥抗炎、抗氧化作用;肺纤维化标志蛋白fibronectin,Collagen Ⅰ和α-SMA表达被抑制;大鼠肺组织TGF-β1、Smad3、Wnt3a、β-catenin和GSK-3β蛋白的表达水平降低,且治疗效果呈现剂量依赖性。 结论 延龄草皂苷可通过抗炎、抗氧化,抑制TGF-β/Smad3与Wnt/β-catenin信号通路激活,从而对肺纤维化产生保护作用。     

TGF-β1对人胚肺成纤维细胞HSP47、collagenⅠ表达的影响

目的通过观察TGF-β1对人胚肺成纤维细胞（HELF）的热休克蛋白47（HSP47）及Ⅰ型胶原（CollagenⅠ）表达的影响,探讨三者在肺纤维化形成中的作用和关系。方法用TGF-β1刺激HELF,观察HSP47、collagenⅠ的动态表达;实验分2组：a组相同浓度TGF-β15ng/mL作用于细胞后0h,12h,24h,48h,72h;b组不同浓度TGF-β10ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml作用于细胞48h;免疫印迹技术检测a组与b组的HSP47、collagenⅠ的表达情况。通过倒置相差显微镜观察细胞形态学变化及增殖情况。结果免疫印迹分析：a组HELF在5ng/mLTGF-β1作用下,HSP47与CollagenⅠ的表达随着时间的延长同步增强（P〈0.05）;b组TGF-β1剂量逐渐增加后,HSP47与collagenⅠ的表达亦同步增强（P〈0.05）。倒置相差显微镜下可见HELF细胞成梭形生长,加入TGF-β1后明显增殖。结论 TGF-β1可能主要通过促进HSP47分泌调控CollagenⅠ的合成分泌,HSP47作为胶原特异性分子伴侣在肺纤维化的发生发展过程中发挥至关重要的作用,有望成为治疗肺纤维化的新靶点。     

心肌成纤维细胞Wnt信号通路在高糖环境下的调控变化

目的:观察乳鼠心肌成纤维细胞在高浓度葡萄糖作用下胶原蛋白分泌和细胞增殖及Wnt信号通路调控的变化。方法:基于高糖刺激诱导心肌成纤维细胞体外增殖的培养方法,CCK8法检测细胞增殖能力;流式细胞仪检测细胞的增殖周期;ELISA法观察细胞TGF-β1蛋白及I型、Ⅲ型胶原的分泌能力;western blot法检测蛋白β-catenin,GSK-3β,P-GSK-3β的表达水平;观察心肌成纤维细胞在高糖环境中Wnt信号通路传导的变化。结果:高浓度葡萄糖环境可以引起细胞的增殖(P0.01);促进TGF-β1的合成(P0.01);提高细胞I型、Ⅲ型胶原分泌的能力(P0.01);在分子水平上可以增强β-catenin的表达(P0.01),抑制P-GSK-3β的表达(P0.05)。结论:心肌成纤维细胞在高糖环境中增殖明显,心肌成纤维细胞TGF-β1和胶原的分泌会增加,引发Wnt信号通路的异常表达。研究其作用机制,对糖尿病心肌纤维化的防治及研究具有重大意义。     

TNF-α、TGF-β1在胆汁淤积性肝硬化中平衡调控肝脏干细胞分化

目的探讨TNF-α、TGF-β1在胆汁淤积性肝硬化中的变化及其对肝脏干细胞分化平衡的影响。方法Balb/c小鼠行胆总管 结扎术,血生化指标和肝脏HE染色评价造模情况;免疫组织化学和蛋白印迹检测造模后TNF-α、TGF-β1的变化;以小鼠胚胎肝 脏干细胞HP14-19为研究对象,TNF-α、TGF-β1分不同浓度干预,蛋白印迹、Real-time PCR、PAS染色评价分化情况。结果胆总 管结扎组中血生化指标明显升高（P<0.05）,HE染色见胶原纤维增多,TNF-α、TGF-β1表达高于假手术组（P<0.05）;TNF-α、TGF-β1 诱导分化3 d后,其分化情况与对照组相比,无明显差别;诱导分化5 d后,TNF-α、TGF-β1各浓度组的PAS染色强于对照组,TNF-α 20、40、80 ng/mL浓度组的细胞角蛋白18（ck18）明显高于细胞角蛋白19（ck19）（P<0.05）,而TGFβ1则相反,20、40、80 ng/mL浓度组 的ck19 高于ck18（P<0.05）;诱导分化10 d 后,TNF-α、TGF-β1促分化的趋势与诱导5 d 时相同,且蛋白印迹、PAS染色更强,但 Real-time PCR表达更低。结论胆总管结扎术能成功模拟胆汁淤积性肝硬化,TNF-α、TGF-β1在该疾病中表达均增加,但它们对 于肝脏干细胞的分化平衡发挥着相互制约的作用：前者主要促进肝脏干细胞向肝细胞分化,而后者则主要促进其向胆管细胞分化。