siRNA沉默E2F3基因对人膀胱癌细胞的增殖抑制作用

目的：探讨siRNA干扰E2F3基因对膀胱癌细胞(5637细胞)增殖的抑制作用,阐明E2F3基沉默对5637细胞增殖抑制作用的生物学机制。方法：化学合成3对编码短发夹RNA序列的、靶向E2F3基因的寡核苷酸链,经BamH Ⅰ、Hind Ⅲ 双酶切克隆至pRNAT-U6.1/Neo系统,重组构建E2F3 siRNA的RNAi质粒,以质粒转染DH5α菌株筛选得到稳定表达siRNA的细胞,转染5637细胞E2F3基因沉默,RT-PCR及Western blotting 检测E2F3表达,流式细胞术检测5637细胞周期,采用Annexin-V/PS双染法检测细胞凋亡率。结果：RT-PCR及Western blotting检测干扰后5637细胞E2F3基因表达抑制,3条干扰序列对5637细胞周期抑制且G1期细胞比例增高,与阴性转染对照组比较差异有显著性(P<0.05和P<0.001）;细胞凋亡率增加,与空白对照组及阴性转染对照组比较差异有显著性(P<0.001）。结论：siRNA干扰E2F3基因对膀胱癌5637细胞具有明显增殖抑制和促进凋亡的作用。     

DREAM短发卡质粒载体的构建及在C6细胞中沉默DREAM基因的效应

目的 构建表达下游调控元件的拮抗分子(DREAM)基因序列特异性的短发卡RNA(shRNA)质粒载体,检测其对C6细胞DREAM基因的干扰作用,为研究DREAM基因功能提供有力工具.方法 为了构建pRNAT-U6.1/Neo载体介导DREAM shRNA表达的质粒,针对DREAM的19碱基大小的片段,分别设计3对寡核苷酸和1条非特异性阴性对照序列,形成双链后将其依次连入带有U6启动子的pRNAT-U6.1/Neo载体(命名为pRNAT-DREAM),两对DNA双链连接后形成中间由9个碱基序列间隔的反向互补序列,构建成能产生DREAM shRNA的质粒.用构建成功的4条质粒转染C6细胞,分别采用Realtime PCR和蛋白印迹检测其DREAM基因的mRNA和蛋白表达.结果 酶切、连接后构建成的质粒,经酶切与测序证实构建成功,无任何碱基突变.在培养的神经胶质细胞中转染率为85%左右,pRNAT-DREAM-Ⅱ和pRNAT-DREAM-Ⅲ显著抑制DREAM基因的表达.结论 成功构建了能表达DREAM shRNA的质粒载体pRNAT-DREAM-Ⅱ、pRNAT-DREAM-Ⅲ,此项研究结果 为DREAM信号通路的深入研究奠定了基础.     

针对大鼠ICOS基因的shRNA表达质粒的构建与鉴定

目的 构建针对大鼠可诱导共刺激因子(inducible co-stimulater,ICOS)基因的特异性RNA干扰质粒,并进行鉴定.方法 采用U6启动子,分别把被9bp序列间隔的19bp长短的ICOS靶序列的反向重复序列,连接到线性化处理的pRNAT-U6.1/Neo载体质粒中,分别构建ICOS短发夹环RNA(ShRNA),产生重组质粒pRNAT-U6.1/Neo-ICOS.结果 将合成的DNA序列退火后克隆到载体上,并作测序分析,经测序鉴定确定为所需序列.结论 针对大鼠ICOS基因的特异性RNA干扰质粒pRNAT-U6.1/Neo-ICOS的成功构建,为进一步研究阻断ICOS表达对实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎(experimental autoimmune uveoretinitis,EAU)的影响奠定基础.     

小分子干扰RNA沉默肝癌细胞CDK2基因对RB、CyclinE、E2F1基因表达的影响

【目的】观察小分子干扰RNA(siRNA)沉默细胞周期素依赖性蛋白激酶(CDK2)基因后,细胞周期相关基因RB、CyclinE、E2F1在肝癌细胞SMMC7721中mRNA的表达。【方法】将前期研究中已构建成功并筛选出的最有效干扰抑制CDK2基因的siRNA序列片段,采用Lipofectamine TM2000脂质体转染法转染肝癌细胞株SMMC7721后分6组:重组质粒组190、重组质粒组191、SMMC7721肝癌组、转染试剂组、阴性对照组、空质粒组。采用实时荧光定量PCR法检测RB、CyclinE、E2F1 mRNA水平。【结果】CDK2的siRNA转染SMMC7721细胞后,RB基因mRNA表达上调,CyclinE、E2F1基因mRNA表达下调。【结论】抑制CDK2基因的表达能使肝癌细胞SMMC7721中RB基因mRNA表达上调,CyclinE、E2F1基因mRNA表达下调,提示肝癌细胞中RB、CyclinE、E2F1基因的表达与CDK2基因的表达具有明显的相关性。     

ssp411基因siRNA表达载体的构建与有效干扰质粒的筛选

目的 为探索精子细胞特异表达的新基因ssp411在受精及早胚发育中的功能,设计并构建了以ssp411基因为靶点的RNA干扰表达载体siRNA-ssp411s,筛选其中对ssp411基因有显著干扰作用的表达质粒.方法 根据已知的ssp411 mRNA序列,选择设计三条带发卡结构的核苷酸序列,克隆到含有U6启动子的载体pRNAT-U6.1中并测序分析.用脂质体转染的方法将干扰质粒与表达质粒ssp411-pDsRed共转染293T细胞,24h后,荧光倒置显微镜观察转染效率,并收集细胞,通过实时定量PCR方法检测不同干扰质粒对ssp411 mRNA的干扰效果.结果 3个ssp411的siRNA片断被成功克隆到pRNAT-U6.1质粒载体中,插入片段测序结果与设计的序列完全一致.实时定量PCR结果表明,针对ssp411基因蛋白编码区3-22序列构建的干扰质粒效果最好,干扰效率可达71%.结论 成功构建了能表达ssp411 shRNA(small hairpin RNA)的重组质粒,同时通过共转染技术,筛选到一个干扰效果达70%以上的干扰片断,为建立转基因RNA干扰小鼠模型,在体内研究ssp411基因及蛋白的生殖生物学功能打好基础.     

E2F3基因真核表达载体的构建和表达

目的克隆人膀胱肿瘤组织E2F3基因及构建E2F3基因真核表达载体并研究其表达。方法取新鲜膀胱肿瘤组织,提取总RNA,采用逆转录-聚合酶联链反应(RT-PCR)扩增E2F3基因,构建其真核表达载体,测序分析及转染膀胱肿瘤细胞,Western Blot法检测其表达情况。结果成功克隆人膀胱肿瘤组织E2F3基因、构建E2F3基因真核表达载体,转染后成功表达。结论人膀胱肿瘤组织E2F3基因克隆及其真核表达载体构建成功,可用于肿瘤生物学的研究。     

抑制表皮生长因子受体基因表达的pSIREN-Shuttle RNAi表达载体的构建

目的:构建抑制表皮生长因子受体(EGFR)基因表达的RNA干扰(RNAi)质粒表达载体pSI-REN-Shuttle-EGFR。方法:化学合成3条编码短发夹RNA序列的、特异靶向EGFR基因的寡核苷酸链,各69个碱基,退火,克隆到RNAi-Ready pSIREN-Shuttle载体的人源U6启动子的下游,重组构建RNAi质粒,3种载体转染人鼻咽癌细胞株(CNE),用RT-PCR分析pSIREN-Shuttle-EGFR载体对EGFR基因的mRNA表达抑制效果。结果:重组构建的pSIREN-Shuttle-EGFR载体经插入基因片段序列分析,表明69个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致。CNE细胞EGFR基因的mRNA被明显抑制。结论:RNAi质粒表达载体介导对EGFR基因的RNA干扰可能是鼻咽癌干预治疗的一种有效手段。     

短发夹RNA干扰表达质粒逆转人乳腺癌细胞MCF-7/ADR多药耐药的研究

目的构建靶向多药耐药基因（MDR-1）的短发夹RNA（short hairpin loop RNA shRNA）干扰表达质粒，并探讨其逆转人乳腺癌细胞MCF-7/ADR多药耐药的作用效果。方法根据MDR-1基因表达序列设计有效的RNA干扰片断，构建并获得MDR-1基因特异的shRNA质粒表达载体pRNAT-U6.1/Neo－mdr1，采用lipofectin2000分别转染人乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR，利用G418筛选稳定表达的细胞克隆。利用RT-PCR检测MDR-1-RNA的表达，Western Blotting检测MDR-1蛋白质的表达，MTT法检测耐药逆转效果，罗丹明123外排实验检测p-gp的转运功能。结果成功构建表达siRNA的质粒载体pRNAT-U6.1/Neo－mdr1，转染人乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR后48h及G418筛选后1、2月，mdr1-RNA及蛋白质表达均呈明显下降，p-gp的转运功能明显提高，对阿霉素的敏感性增强，与耐药细胞及转入空白载体的细胞比较，差异有统计学意义（P均＜0.05）。筛选后1、2月与转入48h比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论shRNA干扰表达质粒pRNAT-U6.1/Neo-mdr1能够稳定、持久的抑制MDR-1基因，逆转乳腺癌细胞MCF-7/ADR对阿霉素的耐药性。     

抑制Smad3的pSUPER RNAi系统的构建和活性鉴定

目的:构建抑制Smad3的shRNA表达载体.方法:化学合成2段编码短发夹RNA序列的、靶向Smad3的寡核苷酸,各64个碱基,退火,克隆到经BgL Ⅱ和Hind Ⅲ双酶切同时经牛小肠碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,CIP)处理后的pSUPER载体的poly Ⅲ H1启动子的下游,重组构建RNA干扰(RNA induced interference,RNAi)质粒,同时设立错义寡核苷酸作为非特异性对照.并将所构建的pSUPER Smad3转染到人类肾小管上皮细胞(human renal tubular epithelial cells,HKC),检测其抑制效果.结果:重组构建的pSUPER Smad3载体经双酶切电泳分析及插入基因片段序列分析,结果表明64个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致.体外活性鉴定表明其能成功地抑制Smad3的基因和蛋白表达,却不影响Smad2的表达.结论:载体成功构建,其在体外抑制效率高,且特异性好.     

人抗肌萎缩蛋白Dp71 shRNA载体构建与检测

目的:构建有效针对人Dystrophin Dp71基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体,并验证其干扰效果。方法:设计合成3对针对人Dystrophin Dp71基因的和1对无同源性的siRNA片段,在两端和中间加上酶切位点和Loop环。将合成的DNA片段插入到干扰载体pRNAT-U6.1/Neo中,经过酶切和测序验证,成功构建人Dp71基因的shRNA和空白对照载体。将各干扰载体和空白载体转染人正常胃黏膜上皮细胞(gastric epithelial cells,GES-1)和人支气管上皮细胞(human bronchial epithelium,HBE),Western印迹检测Dp71 shRNA真核表达载体的干扰效率。结果:酶切和测序验证均表明各Dp71-shRNA载体构建成功。将空载体及各Dp71 shRNA载体分别转染GES-1和HBEC,和空白细胞对照及shRNA空白载体组相比,3组Dp71-shRNA能够明显抑制Dp71蛋白表达,但是3组质粒的抑制效率有一定的差异,以Dp71 shRNA2对Dp71表达的干扰效率最强。结论:成功构建了3个有效针对人Dystrophin Dp71基因的shRNA干扰载体,3组质粒都能有效地抑制Dp71在GES-1和HBEC中的表达,其中以Dp71-shRNA2的抑制效率最高。     

靶向表皮生长因子受体shRNA表达载体的构建和鉴定

目的构建靶向表皮生长因子受体（EGFR）的短发卡状RNA（shRNA）质粒表达载体并进行鉴定。方法①根据人类EGFR的mRNA序列,设计4条干扰片段,以PGPU6/GFP/Neo质粒为载体,构建shRNA重组体,转化入DH5a大肠杆菌,提取质粒,进行酶切和测序鉴定;②采用脂质体Lipofectamin 2000分别转染人皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞,用G418筛选阳性克隆。结果①经酶切及测序鉴定,成功构建了针对EGFR的4个重组干扰质粒;②成功转染Colo-16细胞,经筛选后得到稳定表达的细胞克隆。结论利用RNAi技术原理成功构建针对EGFR的shRNA重组质粒,并转染入Colo-16细胞。     

人E2F1蛋白的表达及与Sedlin蛋白共定位研究

目的 研究人E2F1 蛋白在真核细胞内的表达及其与 Sedlin 蛋白的共定位. 方法 构建 pcDNA3. 1-E2F1-FLAG真核表达质粒,然后瞬时转染至 HEK 293T 细胞内, Western blot法检测E2F1蛋白的表达;瞬时单转E2F1-FLAG和共转E2F1-FLAG+Sedlin-绿色荧光蛋白( GFP)至非洲绿猴肾细胞( COS7 )内,免疫荧光制片,荧光显微镜下观察E2F1-FLAG在细胞内的定位及其和Sedlin的共定位. 结果真核表达质粒 pcDNA3. 1-E2F1-FLAG 构建成功,且在HEK 293T细胞中能够成功表达,在COS7 细胞中主要定位在细胞核,且与Sedlin共定位于细胞核. 结论 人E2F1 在HEK 293T、COS7细胞中都能够正常表达,且与 Sedlin蛋白存在共定位现象,为进一步了解人E2F1的功能及其蛋白质相互作用提供了一定的细胞学基础.     

shRNA抑制人骨髓间充质干细胞SMN1基因表达的研究

目的 构建在哺乳动物细胞中表达SMN1 shRNA的质粒,并初步探讨其对人骨髓间充质干细胞全长SMN mRNA及蛋白的抑制作用,为进一步建立脊髓性肌萎缩症细胞模型提供实验依据。方法 根据GenBank中SMN1 cDNA序列设计5条SMN1靶向shRNA并将其克隆至pRNAT-156．1／Neo载体中U6启动子的下游,形成能在细胞内表达SMN1特异性短发夹状RNA的重组质粒pshRNA-SMN1;在脂质体介导下将重组质粒pshRNA-SMN1转染人骨髓间充质干细胞（hMSC）,RT-PCR、Western印迹分别检测fl-SMNmRNA及fl-SMN蛋白的表达。结果 琼脂糖凝胶电泳及DNA测序证实重组质粒pshRNA-SMN1构建成功,其中pshRNA-SMN1-1组和pshRNA-SMN1-4组转染后明显抑制了hMSCsfl-SMNmRNA及蛋白的表达（均P〈0．05）,在mRNA水平上千扰效率分别为64．05％、61．04％,蛋白水平上干扰效率分别为52．97％和61．57％,而未影响△7-SMN mRNA的表达。结论 构建的pshRNA-SMN1重组质粒能有效地抑制人骨髓间充质干细胞fl-SMNmRNA及蛋白的表达。     

Survivin基因siFNA表达载体的构建及其在食管癌EC109细胞中的表达

目的为研究survivin基因的功能及食管癌的基因治疗,构建针对survivin基因的siRNA的表达载体,转染细胞EC109后观察其对survivm基因表达的抑制作用.方法利用网站选择适当位点设计并合成针对survivin基因nRNA的寡核苷酸序列,插入质粒pBAsi-hU6中形成重组载体pBAsi-survlvin.重组载体经测序鉴定后转染食管癌细胞EC109,western blot检测转染前后survivin蛋白的表达情况.结果测序结果与所合成的寡核苷酸完全一致,证实成功构建了针对sLurvivin基因的siRNA表达载体.Westem blot检测显示转染食管癌细胞EC109后有效抑制了survivin基因的表达.结论针对surivivin基因的siRNA表达载体成功构建,并能有效抑制食管癌细胞EC109中survivin基因的表达.     

大鼠GPR17基因真核表达载体的构建及其功能鉴定

目的:构建大鼠GPR17(rGPR17)基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,并对其功能进行初步研究.方法:从大鼠脑组织提取总RNA,通过RT-PCR扩增rGPR17 cDNA,与载体pcDNA3.1(+)连接,并转化到大肠杆菌DH5α以获得重组载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,以PCR、双酶切和测序鉴定;将重组载体pcDNA3.1(+)-rGPR17通过脂质体转染方法,转染HEK293细胞,RT-PCR、免疫荧光法检测rGPR17的表达,Fluo-4测定激动剂LTD_4处理后细胞内钙变化.结果:RT-PCR、双酶切和测序证明,重组的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17构建成功,并在HEK293细胞获得表达,加入外源性激动剂LTD_4可诱导细胞内钙的增加.结论:成功构建了rGPR17的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,并在HEK293细胞功能性表达,为GPR17受体及其拮抗剂的研究提供了基础.     

大鼠PEDF基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建针对大鼠PEDF 基因的RNA干扰（RNAi）慢病毒表达载体并进行鉴定,探讨PEDF基因对缺血心肌血管新生的影响.方法 构建PEDF基因过表达质粒,测序鉴定.针对PEDF基因不同干扰靶点构建4种RNAi 病毒载体质粒pGCsi-U6/Neo/GFP/shRNA,测序鉴定.过表达质粒和RNAi质粒共转染293T细胞后应用Western blot方法进行外源筛靶确定PEDF基因RNAi 有效靶序列.有效RNAi 病毒质粒和其他3种辅助包装原件载体质粒通过Lipofectamine 2000共转染293T细胞,培养48 h后, 收集细胞培养上清液,将其浓缩后用孔稀释法测定病毒滴度.结果 过表达质粒及4种RNAi质粒构建成功.Western blot外源筛靶显示2个靶点能有效敲减目的基因的表达.PEDF shRNA慢病毒表达载体Serpinf1-RNAi-LV经293T细胞包装成功,收集293T细胞分泌的病毒上清测定浓缩病毒悬液的滴度为2×1012Tu/L.结论 成功构建了PEDF基因的RNAi慢病毒载体,为研究PEDF基因对缺血心肌血管新生的影响打下基础.     

人抗肌萎缩蛋白Dp71 shRNA载体构建与检测

目的：构建有效针对人Dystrophin Dp71基因的短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)真核表达载体，并验
证其干扰效果。方法：设计合成3对针对人Dystrophin Dp71基因的和1对无同源性的siRNA片段，在两端和中间加上酶
切位点和Loop环。将合成的DNA片段插入到干扰载体pRNAT-U6.1/Neo中，经过酶切和测序验证，成功构建人Dp71基
因的shRNA和空白对照载体。将各干扰载体和空白载体转染人正常胃黏膜上皮细胞(gastric epithelial cells，GES-1)和人
支气管上皮细胞(human bronchial epithelium，HBE)，Western印迹检测Dp71 shRNA真核表达载体的干扰效率。结果：酶
切和测序验证均表明各Dp71-shRNA载体构建成功。将空载体及各Dp71 shRNA载体分别转染GES-1和HBEC，和空白细
胞对照及shRNA空白载体组相比，3组Dp71-shRNA能够明显抑制Dp71蛋白表达，但是3组质粒的抑制效率有一定的差
异，以Dp71 shRNA2对Dp71表达的干扰效率最强。结论：成功构建了3个有效针对人Dystrophin Dp71基因的shRNA 干
扰载体，3组质粒都能有效地抑制Dp71在GES-1和HBEC中的表达，其中以Dp71-shRNA2的抑制效率最高。