梅毒螺旋体Tp0453重组蛋白的表达纯化及免疫活性研究

目的表达梅毒螺旋体膜蛋白Tp0453(28-288 aa),纯化表达产物并进行免疫活性分析,为探索Tp0453重组蛋白在梅毒血清学诊断中的应用提供实验依据。方法通过生物信息学分析,挑选Tp0453抗原的优势表位,进行诱导表达;以W estern-b lot和间接ELISA法检测重组蛋白的免疫反应性;用重组蛋白免疫新西兰家兔,评价其免疫原性。结果纯化后获得了相对分子量约为32×103的融合蛋白。W estern-b lot检测其能与梅毒患者阳性血清发生特异性反应;同时以重组蛋白为包被抗原建立间接ELISA法,检测梅毒诊断试剂参考血清,其阴阳性符合率均为100%。用纯化的Tp0453重组蛋白免疫新西兰家兔,能诱导其产生特异性免疫应答,ELISA法测定免疫血清中特异性抗体滴度在1∶1280以上。结论基因重组表达的Tp0453重组蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性,为进一步研究其在梅毒血清学诊断中的应用和其生物学功能奠定了基础。     

梅毒螺旋体Gpd重组蛋白的表达

随着基因工程技术的迅速发展和梅毒螺旋体(Tp)全基因序列的解析^[1],通过重组技术已制备多种重组Tp抗原,并被广泛应用于梅毒血清学检测的研究和试剂盒的开发^[2-5],但对于哪一种Tp蛋白抗原在临床各期梅毒的血清学诊断中具有更高的特异性和敏感性尚无一致观点。我们应用软件筛选分析,选取抗原性较强的Tp外膜蛋白GPd进行克隆表达,并以重组蛋白为包被抗原,建立间接ELISA法,评价其在梅毒血清学诊断中的应用价值。     

梅毒螺旋体 Tp0453缩短抗原和 Tp47抗原在不同期梅毒检测中的应用比较

目的：比较梅毒螺旋体 Tp0453缩短抗原（ Tp0453-s）和Tp47抗原在不同期梅毒检测中的应用。方法：表达并纯化 Tp47抗原,进行 SDS-PAGE 电泳和 western blot 鉴定。 western blot 检测比较Tp0453-s和Tp47抗原在不同期梅毒患者检测中的阳性率。结果：Tp47和Tp0453-s 2种抗原均可与一期、二期和三期梅毒患者血清发生反应,而与非梅毒病人血清无交叉反应性。 Tp0453-s和Tp47抗原与隐性梅毒患者的血清反应阳性率分别为55.6％（10／18）和94.4％（17／18）,差异具有统计学意义（礸2＝7.26,P＜0.01）。结论：Tp0453-s和Tp47两种抗原与各期梅毒患者血清反应性良好,但在隐性梅毒检测方面Tp47比Tp0453-s更具有优势。     

梅毒的临床免疫学研究进展

梅毒是一种由梅毒螺旋体（Treponema pallidum,Tp）引起的、主要经性行为传播的慢性疾病,人类是Tp的唯一自然宿主。梅毒的临床表现多样,而血管炎是各种损害的主要病理特征。梅毒的危险性极大,可致多系统病变而出现不可逆性损害,如心血管梅毒、神经梅毒等;也能经胎盘造成胎儿感染,出现早产、畸形,甚至死胎。     

梅毒螺旋体特异性抗原Tp0453及其截短蛋白的克隆、表达及活性检测

目的:克隆和鉴定梅毒螺旋体(Tp)特异性抗原Tp0453及其截短蛋白(Tp0453-s),并用梅毒患者血清检测抗原反应性。方法:PCR扩增Tp0453和Tp0453-s基因,分别构建重组表达质粒pGEX-6P1-Tp0453和pET-28a(+)-Tp0453-s,经测序鉴定正确后转染E.coli BL21(DE3),对表达产物进行SDSPAGE电泳和Western blot鉴定。用不同分期梅毒患者血清作为一抗,Western blot检测抗原反应性。结果:经鉴定,2个原核表达质粒均构建成功,SDS-PAGE电泳和Western blot结果显示2个蛋白大小与预期一致。Western blot检测显示2个蛋白均与梅毒患者血清特异性结合,而与非梅毒患者血清无交叉反应。结论:成功克隆、表达并纯化了Tp0453和Tp0453-s蛋白,2个蛋白均有良好的抗原反应性。     

梅毒螺旋体抗体IgG酶联免疫吸附试验的建立

梅毒螺旋体抗原试验,如荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验(FTA-ABS)、梅毒螺旋体血球凝集试验(TPHA)、梅毒螺旋体明胶凝集试验(TPPA)等的敏感性和特异性高,但试剂昂贵,操作较复杂,所需时间较长,现不用于筛查而用于确证。为探讨既可用于筛查又可用于确证的梅毒螺旋体抗体检测方法,我们用基因重组技术表达的梅毒螺旋体蛋白(Treponema pallidum protein,Tp)17和Tp44.5为抗原,以辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG单克隆抗体为酶结合物,建立了梅毒螺旋体抗体IgG的间接ELISA法(ELISA-Tp-IgG),经临床观察和献血员筛查,效果较好,现报道如下。     

梅毒螺旋体体内诱生抗原Tp0462的表达鉴定及在临床血清学诊断中的应用评价

目的 筛选鉴定并评价梅毒螺旋体（Tp）体内诱生抗原Tp0462的临床血清学诊断价值。方法 提取Tp Nichols株全基因组,PCR扩增Tp0462,克隆构建重组质粒pET30a（+）?Tp0462,转化至E.coli Rosetta（DE3）菌,大量诱导表达重组蛋白Tp0462并纯化、鉴定。18只新西兰兔随机平均分为活Tp接种组、紫外线照射灭活Tp接种组和未接种对照组,接种后不同时间点抽血分离血清,用ELISA鉴定Tp0462蛋白的体内诱生性特点。ELISA法（Tp0462?ELISA）、梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA）、梅毒初筛ELISA试验及快速血浆反应素环状卡片试验（RPR）试验检测336份临床梅毒患者血清样本,初步评价该蛋白的诊断价值。结果 重组质粒Tp0462?pET30a（+）在E.coli Rosetta（DE3）中最适的表达条件为0.5 mmol/L IPTG,20 ℃,180 rpm摇床诱导培养4 h。活Tp接种组血清Tp0462特异性抗体水平从第2周起呈急剧上升趋势,至5周后趋于平稳,而灭活Tp接种组及未接种对照组血清Tp0462特异性抗体水平一直处于低水平。活Tp接种组Tp0462特异性抗体水平显著高于灭活Tp接种组及未处理组（P < 0.05）,而灭活Tp接种组与未处理组相比,差异无统计学意义（P = 0.256）。活Tp接种组、灭活Tp接种组Tp92抗体水平显著高于未处理组（P < 0.05）,而活Tp接种组与灭活Tp接种组差异无统计学意义（P = 0.127）。与TPPA相比,Tp0462?ELISA的灵敏度和特异度分别为91.7%和98.8%,符合率为95.2%,曲线下面积为0.997。Tp0462?ELISA与梅毒初筛ELISA试验的符合率为92.3%,Kappa值为0.846;与RPR试剂盒的符合率为83.9%,Kappa值为0.293。结论 Tp0462在梅毒血清学诊断中具有较高的灵敏度和特异度,可以作为潜在的梅毒诊断候选蛋白。     

梅毒螺旋体感染兔模型中特异性抗体分析

目的　确立早期诊断梅毒及判定临床疗效的抗体指标。方法　试用梅毒兔模型 ,采用RPR法、TPPA法及免疫印迹法检测梅毒螺旋体感染兔模型治疗前后血清抗体的变化情况。结果　梅毒螺旋体接种入兔机体后 ,3天就可用免疫印迹法检测到血清中 47kD特异性抗原抗体 ,之后相继出现 45kD、17kD、3 7kD、92kD及 15 .5kD抗原的抗体 ,其中45kD、15 .5kD和 92kD抗原的抗体在治疗后逐渐减弱并可消失 ;RPR法检测的心磷脂抗体滴度在感染早期 1～ 1.5个月可随治疗明显下降 ;TPPA法检测到血清中TP抗体较 47kD特异性抗原抗体出现晚 ,且出现的高峰时间及变化的时间均较心磷脂抗体晚。结论　免疫印迹法检测血清 47kD抗原抗体可作为梅毒的早期诊断指标 ,45kD、15 .5kD、92kD抗原抗体和心磷脂抗体在治疗中变化明显 ,可考虑作为疗效观察的指标。     

基因工程技术制备梅毒螺旋体重组抗原的研究

目的 用基因工程技术制备梅毒螺旋体特异蛋白抗原,以梅毒螺旋体不能体外培养而难以获得足量的纯梅毒螺旋体特蛋白抗原的难题。方法 以PCR技术克隆出目的基因,重组后通过DNA序列测定验证重组质粒中连结有目的基因片段;以pMAL^TM-e2为质粒载体,TB1大肠杆菌为宿主菌进行目的基因的转化、诱导和表达,并对表达产物进行蛋白印迹试验检测其血清学活性。结果 PCR克隆出梅毒螺旋体15000、17000以及47000蛋白的基因克隆,其中梅毒螺旋体17000以及47000在TB1大肠杆菌中得到稳定的表达,且表达产物显示与梅毒患者血清有非常特异的血清学反应。结论 梅毒螺旋体之目的基因在大肠杆菌中得到了成功表达,并具特异的血清学活性,从而为建立为国产化梅毒血清学诊断的新方法奠定了基础。     

梅毒免疫和梅毒螺旋体的研究进展

梅毒螺旋体有着独特的基因和蛋白结构,对其基因分型有利于梅毒分子流行病学的研究.梅毒螺旋体缺乏脂多糖与外膜蛋白,但可表达多种脂蛋白,这些脂蛋白同梅毒螺旋体的组织黏附及播散有关,同时可诱导机体发生免疫应答.机体对于梅毒螺旋体的免疫应答过程十分复杂,固有免疫、体液免疫及细胞免疫均在梅毒螺旋体的感染过程中参与了应答过程.Th1型细胞免疫在梅毒的发生发展过程中起重要作用,梅毒患者在局部及系统免疫方面都存在细胞免疫的异常.     

非梅毒螺旋体血清学试验持续阳性梅毒患者神经梅毒发生情况及影响因素分析

目的 探讨正规治疗后非梅毒螺旋体（Tp）血清学试验持续阳性梅毒患者的神经梅毒发生情况及相关危险因素。 方法 回顾性分析248例正规治疗后非Tp血清学试验持续阳性梅毒患者的临床资料。用单因素分析、多因素logistic回归分析及ROC曲线法检测可用于预测神经梅毒的临床指标。 结果 248例患者中25例（10.1%）诊断为神经梅毒。单因素分析显示,血甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）下降程度（χ2 = 20.663,P < 0.05）、血TRUST持续阳性滴度（Z = -7.021,P < 0.05）与神经梅毒发生有关,而性别、年龄、梅毒分期、治疗方案、初次就诊时血TRUST滴度、有无神经系统症状与神经梅毒无显著相关性（均P > 0.05）。多因素logistic回归分析显示,血TRUST持续阳性滴度是神经梅毒的相关危险因素（OR = 4.685,95% CI = 2.552 ～ 8.601,P < 0.05）。绘制血TRUST持续阳性滴度的ROC曲线下面积为0.907,最佳临界滴度为1 ∶ 8。 结论 正规治疗后,血清TRUST滴度对于预测神经梅毒有一定意义。     

各期梅毒患者治疗前 IgG、IgA 和 IgM 抗体表达差异的研究

目的：分析梅毒各个时期治疗前IgG、IgA和 IgM抗体的表达差异。方法：采用免疫印迹法检测已确诊的34份不同时期（一期8例,二期15例,三期11例）梅毒患者治疗前血清中IgG、IgA和IgM Tp蛋白表达情况。结果：IgG抗体Tp47、Tp45、Tp34和Tp15在治疗前各期梅毒患者血清中均100％表达,Tp33在三期梅毒中的阳性率（63.6％）明显低于一、二期梅毒（均为100％）,差异有统计学意义（P＝0.009）。 IgA抗体各期表达无明显差异,其中一期梅毒中Tp41、Tp34、Tp33和Tp30抗体以及三期梅毒中Tp33均无阳性条带出现。 IgM抗体Tp41和Tp37在各期梅毒患者血清中阳性率差异有统计学意义（ P值分别为0.035、0.020）,其余差异均无统计学意义。结论：强阳性的 Tp 蛋白 Tp47、Tp45和Tp15可作为早期梅毒诊断的指标;在各期表达有明显差异的Tp41、Tp37和Tp33可考虑作为临床分期观察指标;Tp45、Tp41、Tp17和Tp15可作为以后临床治疗效果的辅助诊断参考。     

梅毒螺旋体Tp0319重组蛋白的表达及免疫活性研究

目的 克隆和表达梅毒螺旋体Tp0319基因,并对其表达产物进行免疫活性分析。方法 挑选并克隆出Tp0319免疫优势区基因,构建原核表达载体;诱导表达并纯化重组蛋白,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western印迹法鉴定;用纯化的重组蛋白免疫新西兰兔;间接ELISA法检测梅毒螺旋体参考血清及临床标本。结果 成功构建原核表达载体pQE32/Tp0319;高效表达和纯化出一相对分子质量约30 000的重组蛋白。用重组蛋白免疫新西兰兔,能刺激其产生高水平抗体滴度。Western印迹证明其能与梅毒患者血清发生特异性反应,阴性对照菌未见目的表达条带。间接ELISA法检测80份梅毒螺旋体参考血清（阴性、阳性各40份）,阳性和阴性结果的符合率均为100%。检测200份临床梅毒血清标本及200份正常人血清,结果与梅毒螺旋体明胶凝集试验相比,灵敏度和特异度分别为92.6%和100%,符合率为96%。结论 制备的Tp0319重组蛋白具有良好的免疫活性,为进一步研究其在梅毒血清学诊断中的应用奠定一定的基础。     

梅毒螺旋体IgM抗体对于神经梅毒的诊断意义

目的　探讨检测脑脊液中梅毒螺旋体IgM抗体对于神经梅毒的诊断意义。 方法　神经梅毒组 2 1例 ,以无神经系统被累的各期梅毒组 2 8例、非梅毒组 2 8例为对照。对三组患者腰穿取脑脊液 ,采用抗体捕获酶联免疫吸附分析技术 ,进行梅毒螺旋体IgM抗体检测。 结果　神经梅毒组脑脊液Tp IgM检测的阳性率为 71.4% ,两对照组则均为 0 ,差异有高度显著性 (u =5 .3 7,P <0 .0 1)。脑脊液Tp IgM试验、VDRL/RPR试验在神经梅毒组的阳性率分别为 71.4%、3 3 .3 % ,差异有显著性 (χ2 =4.90 ,P <0 .0 5 )。结论　脑脊液Tp IgM检测有助于神经梅毒的诊断 ,无症状神经梅毒的脑脊液Tp IgM检测也可以呈阳性结果。     

梅毒螺旋体部分膜蛋白研究进展

梅毒是由梅毒苍白螺旋体引起的一种可侵犯多器官的慢性性传播疾病.目前梅毒螺旋体尚不能在体外长期培养,获取较困难,从而阻碍了对梅毒致病机制的研究、诊疗方案的优化和疫苗的研制.梅毒螺旋体全基因序列的揭示,TprK蛋白、Tp0483蛋白、Tp0155蛋白等一些重要膜蛋白成功表达及对其结构特点、抗原性和免疫保护作用的深入研究,为梅毒发病机制的研究、诊疗方案的优化和疫苗的研制提供了基础和可能.概述近年来新发现的对梅毒螺旋体具有诊断意义和免疫保护作用的几种主要膜蛋白的研究状况.     

胶体金法检测梅毒螺旋体特异性抗体的初步观察

检测梅毒螺旋体抗体有两种,一种是检测非特异性抗体,另一种是检测其特异性抗体。目前胶体金标记金黄色葡萄球菌Ａ蛋白(ＳＰＡ)法检测梅毒螺旋体非特异性抗体已见报道[1]。我们采用基因重组梅毒螺旋体抗原点样于醋酸纤维薄膜上、胶体金标记ＳＰＡ快速检测血清中梅毒螺旋体特异性抗体,现将结果报道如下。一、材料和方法1.梅毒螺旋体特异性抗原的制备:选用公认的42000膜蛋白(ＴｍｐＡ)作为梅毒螺旋体特异性抗原[2,3],聚合酶链反应(ＰＣＲ)人工合成或者将其基因片段植入大肠埃希菌内大量合成其ＴｍｐＡ蛋白,本抗原及醋酸纤维薄膜由Ｔｒｉｃｏｎ…     

梅毒螺旋体47kD脂蛋白的研究现状

梅青螺旋体是梅毒的病原体。因其完全依赖哺乳动物宿主维持生长和活力,进行实验室研究十分困难,但完整基因组序列的揭示为研究提供了充足的信息。描述了梅毒螺旋体47kD脂蛋白有关结构和功能的研究现状,并对其结构特征,氨基酸序列在梅毒免疫致病机理中可能的作用及有关应用研究等进行了分析。     

梅毒螺旋体Tp0821基因的克隆、表达、纯化及免疫活性研究

目的 构建梅毒螺旋体(Tp)膜脂蛋白Tp0821的重组质粒,表达、纯化其相应蛋白,研究其免疫活性.方法 构建重组质粒pQE32/Tp082l,诱导表达其相应蛋白,以纯化的重组蛋白免疫新西兰兔,制备多克隆抗体并测定其效价.建立间接ELISA法,检测80份梅毒参比血清、临床经FTA-ABS确诊的阳性血清各150份.结果 成功构建重组质粒pQE32/Tp0821,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白分子量与预期结果相符.将亲和层析后所获高纯度重组蛋白免疫新西兰兔,制备的多克隆抗体效价达1:6400.间接ELISA法检测梅毒参比血清、临床梅毒患者血清,与间接免疫荧光螺旋体抗体吸附试验(FTA-ABS)法比较,其灵敏度、特异度分别为92.6%和98.6%,差异有统计学意义(P<0.05).结论 Tp0821重组蛋白具有较好的免疫活性,可用于梅毒血清学检测.     

梅毒螺旋体耐抗生素研究进展

青霉素一直是治疗梅毒的一线用药，常用替代药物有第三代头孢菌素、大环内酯类和四环素类抗生素。对大环内酯类耐药的梅毒螺旋体(Tp)菌株已在全球多个地区流行，近年也有四环素类治疗梅毒失败的例子，但其耐药情况尚不普遍。本文将对Tp耐药情况、已报道的耐药突变和潜在的耐药分子机制进行综述。     

重组梅毒螺旋体抗原的研究进展

在梅毒螺旋体人工培养尚未获得成功的情况下，基因克隆技术的出现为该病原体的研究开辟了一条新的途径。应用基因工程技术目前已制备出多种重组梅毒螺旋体抗原，这些抗原的制备对梅毒发病机理的探讨，疫苗的研制，以及血清学诊断试验的建立与应用具有重要意义，为梅毒的预防和控制提供了更加有效的手段。