四种细胞系培养沙眼衣原体易感性的比较

目的:比较McCoy、Hela、Vero、HaCat四种细胞培养沙眼衣原体的易感性及药物敏感性试验结果。方法:将5 000和1 000 IFU的衣原体分别接种到McCoy、HeLa、Vero、HaCat细胞中,培养48和72 h,通过碘染色和单克隆荧光抗体染色法,观察衣原体包涵体的数量。比较四种细胞对衣原体的易感性和两种染色方法的敏感性。培养McCoy和HeLa细胞,进行10株衣原体临床株对5种抗生素的药物敏感性试验,观察衣原体的最小抑菌浓度(MIC)。结果:在衣原体感染后48 h和72 h,比较McCoy、HeLa、Vero与HaCat细胞对沙眼衣原体的易感性,差异均具有统计学意义(P0.05)。在相同接种浓度下,碘染色观察McCoy和HeLa细胞中衣原体包涵体数量比HaCat细胞多,Vero细胞中包涵体数量最少;荧光染色时,McCoy和HeLa细胞中衣原体包涵体数量较多,HaCat细胞包涵体数量最少。衣原体感染48 h,碘染和荧光染色计数McCoy、HeLa和HaCat细胞内包涵体数量无明显差异(P0.05),Vero细胞具有明显差异(P0.05)。在McCoy和HeLa细胞中,5种抗生素对衣原体的最小抑菌浓度范围基本相同。结论:沙眼衣原体对McCoy细胞和Hela细胞有较高的易感性,碘染色观察Vero细胞中衣原体包涵体敏感性低,衣原体在McCoy和Hela细胞中的药敏试验结果一致。     

采用HaCaT细胞培养沙眼衣原体

目的 探讨新的培养沙眼衣原体的细胞。方法 借鉴McCoy细胞培养沙眼衣原体的方法,将E型标准株和临床标本接种于HaCaT细胞,分别用碘染、单克隆荧光抗体检测、PCR扩增沙眼衣原体内源性质粒的方法检测沙眼衣原体是否可以在体外感染HaCaT细胞。用HaCaT细胞传代培养沙眼衣原体E型标准株5代,分别计数5次传代的包涵体数,并用SPSS17软件进行单因素方差分析,以确定沙眼衣原体在HaCaT细胞中是否增殖。结果 碘染后可见 HaCaT细胞胞质内有典型的包涵体。单克隆荧光抗体检测,在荧光显微镜下可见HaCaT细胞内有黄色荧光颗粒。PCR扩增HaCaT细胞内沙眼衣原体内源性质粒为阳性。沙眼衣原体E型标准株在HaCaT细胞内经传代5次,包涵体数逐渐增加。结论 HaCaT细胞在体外培养沙眼衣原体成功,且沙眼衣原体E型标准株在HaCaT细胞中可以增殖。     

体外诱导沙眼衣原体持续性感染对宿主细胞凋亡的调控北大核心CSCD

目的探讨阿奇霉素诱导持续性感染下沙眼衣原体对Hela229细胞凋亡的调控作用。方法沙眼衣原体感染Hela229细胞22h后,加入含0．08mg／L阿奇霉素的DMEM培养液继续培养至感染48h,构建持续性感染细胞模型,以不含阿奇霉素的DMEM培养液培养构建急性感染细胞模型。感染48h后,去除阿奇霉素继续培养进行沙眼衣原体复活试验。免疫荧光和电镜检测技术验证持续性感染模型。将沙眼衣原体急性感染和持续性感染的Hela229细胞用星状孢子素处理4h诱导凋亡后,用Hoechst33258染色和膜联蛋白V-碘化丙锭流式细胞仪检测宿主细胞凋亡,以未感染Hela229细胞为对照。结果加入阿奇霉素后,沙眼衣原体感染的细胞内形成异形包涵体,其内为畸形网状体。去除阿奇霉素继续培养至96h,沙眼衣原体包涵体内见具有感染性的原体。Hoechst染色显示,经星状孢子素诱导细胞凋亡,持续性感染的细胞染色质疏松,而无沙眼衣原体感染的细胞染色质浓缩。在感染24h时诱导凋亡,持续性感染组和急性感染组细胞凋亡率分别为45．567％±2．631％和38．567％±1．701％,两者差异有统计学意义（t=2．686,P=0．028）,持续性感染组与未感染组（69．800％±2．835％）差异有统计学意义（t=8．187,P〈0．001）。在感染48h时诱导凋亡,持续性感染和急性感染组细胞凋亡率分别为46．700％±5．257％和61．767％±1．815％,两者差异有统计学意义（t=5．781,P〈0．001）;持续性感染组与未感染组（68．667％±3．156％）差异有统计学意义（t=7．421,P〈0．001）。结论阿奇霉素诱导沙眼衣原体持续性感染可调控宿主细胞凋亡,且作用持久至48h。     

生殖道沙眼衣原体体外经不同浓度阿奇霉素作用后超微结构的变化

目的 初步探讨不同浓度阿奇霉素作用下沙眼衣原体的超微结构形态变化。方法 采用McCoy细胞培养方法,在沙眼衣原体实验菌株（D/UW-3/Cx）体外培养过程中添加含阿奇霉素质量浓度为0.0667、0.1340、0.1900、0.2680、0.3330 mg/L的培养液,不加阿奇霉素的培养液作为空白对照组。在透射电镜下观察McCoy细胞和沙眼衣原体超微结构的变化。结果 在接种D/UW-3/Cx时加入阿奇霉素培养48 h后,随阿奇霉素浓度的增加,透射电镜下可见包涵体内外囊泡增多;有异常增大的网状体,部分存在分裂异常,甚至网状体坏死崩解;原体数目减少,体积增大,外膜皱褶增多。阿奇霉素质量浓度为0.3330 mg/L时见不到包涵体。结论 阿奇霉素可引起沙眼衣原体外膜膨大,形成囊泡;网状体异常增大,甚至崩解;原体减少。     

聚乙二醇促进沙眼衣原体生长最适浓度的探讨及对药物敏感性的影响

目的 探讨聚乙二醇（PEG）促进沙眼衣原体D-UW-5/Cx型、E-UW-5/Cx型标准株生长的最适浓度及对4种常用抗菌药物体外药物敏感性的影响。方法 在沙眼衣原体D、E型菌株接种于致密单层的McCoy细胞时,加入含有不同浓度PEG的离心液,离心后在孵箱中静置2 h后换成衣原体感染液,48 h后固定,碘染计数包涵体数量。将沙眼衣原体接种于McCoy细胞,接种过程中用0.7%（7 g/L）PEG处理菌株,McCoy细胞感染率达90％以上确定沙眼衣原体接种量后进行药敏实验。采用微量稀释法测定体外4种抗菌药物对沙眼衣原体的作用。将取自31例衣原体细胞培养阳性且基因分型为D、E型的临床标本加入或者不加入0.7%PEG,接种于致密单层的McCoy细胞后计数第1代全孔包涵体数量。结果 0.7%PEG能使沙眼衣原体E型包涵体数量提高3.44倍,D型包涵体数量提高3.56倍。在体外,PEG处理过的沙眼衣原体D、E型标准株对阿奇霉素、莫西沙星、多西环素、米诺环素的最低抑菌浓度与未经PEG处理的沙眼衣原体标准株药敏结果一致。0.7%PEG可以显著增加沙眼衣原体D、E型临床标本传代产生的包涵体数量。结论 0.7%PEG可以显著促进沙眼衣原体D型、E型的生长,但对药敏结果无明显影响。     

提高沙眼衣原体临床株培养阳性率的探讨

沙眼衣原体E型标准株和184株临床菌株破壁、离心后接种于细胞培养板的McCoy细胞,培养60～72 h后碘染观察衣原体包涵体.原代培养阴性或阳性的标本均进行传代培养.原代培养阳性8株(4.35%),其中男性6株,女性2株.传代培养阳性50株(27.17%),其中男性35株(23.81%),女性15株(40.54%).良好的细胞活力是沙眼衣原体临床标本感染细胞的关键.盲传等方法可以明显提高临床标本培养的阳性率.     

沙眼衣原体微量细胞培养和鉴定

目的细胞培养沙眼衣原体,并应用四种方法对培养结果进行鉴定。方法将McCoy细胞在细胞培养板中培养至致密单层后,接种沙眼衣原体标准株和临床株,培养44～48h后,用卢戈氏碘液染色、Giemsa染色、单克隆荧光抗体和内源性质粒扩增四种方法鉴定培养结果。结果四种鉴定方法结果均呈阳性,证实沙眼衣原体培养成功。结论沙眼衣原体培养的成功将为该病原体的致病机理、免疫机制、药物敏感性检测和保护性疫苗等方面的研究奠定基础。     

泌尿生殖道沙眼衣原体持续性复发性感染的分子机制研究

沙眼衣原体感染可以引起多种疾病。而持续性和复发性是沙眼衣原体感染疾病的一个重要特点,了解导致其持续性的原因对于沙眼衣原体疾病的治疗,减少后遗症有重要作用。就近年来的一些相关研究,简要介绍了干扰素γ抑制被感染细胞凋亡,肿瘤坏死因子-α诱导T细胞凋亡,色氨酸合成酶的不同等几方面可能导致其持续性的原因。     

泌尿生殖道沙眼衣原体持续性复发性感染的分子机制研究

沙眼衣原体感染可以引起多种疾病。而持续性和复发性是沙眼衣原体感染疾病的一个重要特点，了解导致其持续性的原因对于沙眼衣原体疾病的治疗，减少后遗症有重要作用。就近年来的一些相关研究，简要介绍了干扰素γ抑制被感染细胞凋亡，肿瘤坏死因子-α诱导T细胞凋亡，色氨酸合成酶的不同等几方面可能导致其持续性的原因。     

M13-IN5重组噬菌体的构建与鉴定及其对沙眼衣原体的作用研究

目的 构建针对沙眼衣原体的活性噬菌体,并评估其对沙眼衣原体的作用。方法 将衣原体噬菌体phiCPG1衣壳蛋白VP1的IN5序列与M13噬菌体重组,获得重组M13-IN5噬菌体。利用PCR扩增、酶切、测序重组噬菌体基因,验证目的片段是否成功插入;通过噬菌斑形成实验检测重组噬菌体的活性。利用CCK8法检测效价为1011噬斑形成单位（PFU）/ml的M13噬菌体和M13-IN5重组噬菌体对Hela细胞增殖的影响,同时设置空白对照组（未感染衣原体的Hela细胞）。Western印迹检测重组噬菌体、M13噬菌体、对数期大肠杆菌ER2738中IN5环蛋白的表达。在沙眼衣原体E型标准株的培养过程中,分别加入效价为1011 PFU/ml的M13噬菌体、M13-IN5重组噬菌体进行干预,并设置衣原体对照组。感染后36 h,共聚焦显微镜下观察M13噬菌体和M13-IN5重组噬菌体定位情况;在感染后36、48、60、72 h碘染色观察计数包涵体。两样本均数间比较用t检验;多组样本均数间比较采用方差分析,两两比较采用Bonferroni检验。结果 成功构建含有IN5环基因的具有生物活性的重组M13噬菌体,Western印迹证实重组噬菌体表达IN5环/pIII融合蛋白,重组噬菌体效价达3.05 × 1011 PFU/ml。CCK8法检测显示,空白对照组、M13噬菌体组、M13-IN5噬菌体组A450值分别为3.63 ± 0.01、3.55 ± 0.02、3.70 ± 0.01,组间差异无统计学意义（F = 12.0,P > 0.05）。共聚焦显微镜定位显示,噬菌体荧光与衣原体包涵体荧光存在重叠;衣原体感染后36、72 h,M13-IN5噬菌体组和M13噬菌体组包涵体数目较对照组减少（均P < 0.05）,且M13-IN5噬菌体组包涵体数目较M13噬菌体组有明显降低（P < 0.05）;衣原体感染后48、60 h,M13噬菌体组、M13-IN5噬菌体组与对照组包涵体数目差异无统计学意义（P > 0.05）。结论 构建的M13-IN5重组噬菌体具有生物学活性,且能够成功表达IN5环蛋白;体外实验中,该噬菌体能进入衣原体包涵体内,且能明显抑制沙眼衣原体感染。     

不同血清型沙眼衣原体小鼠生殖道感染模型的建立

目的 建立不同血清型沙眼衣原体小鼠生殖道感染模型,为研究型别与毒力的关系奠定基础。方法 将6周龄BALB/c雌性小鼠分为4组,实验组经孕酮处理后接种4.0 × 107沙眼衣原体,孕酮对照组接种McCoy细胞培养液,无孕酮对照组直接接种4.0 × 107沙眼衣原体,以及单纯小鼠的空白对照。分别于接种后4 d起观察小鼠外阴变化,阴道分泌物细胞培养、直接免疫荧光法和实时荧光PCR检测沙眼衣原体。结果 实验组接种沙眼衣原体E、F、J和K型,4 d后小鼠生殖道表现出轻微的感染迹象,7 d后阴道分泌物培养、免疫荧光和PCR检测均检出沙眼衣原体,而对照组为阴性。感染持续时间以K型最长（21 d,1/11只阳性）,其次为J型（17 d,1/11只阳性）、F型（14 d,5/11只阳性）和E型（14 d,2/11只阳性）。结论 适龄小鼠经孕酮处理后,接种一定量的沙眼衣原体,可建立不同血清型沙眼衣原体感染模型。     

实时聚合酶链反应定量沙眼衣原体

以往定量临床标本中的沙眼衣原体(Ct)依赖于细胞培养,即把标本接种于细胞单层上,72h后在显微镜下计数细胞内荧光单克隆抗体染色的衣原体包涵体。此法费时且受主观因素的影响。我们报告一种精确定量Ct的方法,应用Light Cycler仪(Roche公司生产)进行实时聚合酶链反应(PCR),通过检测结合于dsDNA产物上的SYBR GreenⅠ荧光来定量CtDNA拷贝数。该技术不需要PCR后分析过程,在3h内直接完成Ct的检测及定量,现报道如下。     

沙眼衣原体K血清型诱导细胞凋亡

目的探讨沙眼衣原体(CT)K血清型对细胞凋亡的影响。方法用流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡百分率,DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡“梯状带”,观察沙眼衣原体K血清型感染36h,48h,60h对BGM细胞和Mc-Coy细胞凋亡的影响。结果沙眼衣原体感染的BGM细胞在36h,48h,60h的细胞凋亡百分率分别为(3.41±0.09)%,(8.96±0.78)%和(16.60±0.41)%,沙眼衣原体感染的McCoy细胞在36h,48h,60h的细胞凋亡百分率分别为(2.63±0.11)%,(8.78±0.58)%和(12.93±0.45)%,均显著高于相应的对照组(P<0.01),且凋亡百分率随时间延长而增加(P<0.01)。结论沙眼衣原体K血清型能诱导细胞凋亡。     

衣原体噬菌体phiCPG1衣壳蛋白Vp1对豚鼠结膜炎衣原体及E型沙眼衣原体的抑制作用

目的 探讨豚鼠结膜炎衣原体（GPIC）噬菌体衣壳蛋白Vp1对GPIC及E型沙眼衣原体的抑制作用,为沙眼衣原体感染的治疗提供新的思路。 方法 用Vp1-pET30a（+）重组质粒菌表达Vp1蛋白,Western印迹法鉴定蛋白,透析袋纯化蛋白,BCA法测定蛋白浓度,将GPIC、E型沙眼衣原体分别与Vp1蛋白、Tris甘氨酸溶液、S蛋白及培养液室温孵育3 h,衣原体培养过程中分别 加入相同浓度的上述液体,72 h或48 h后,免疫荧光计数包涵体数。 结果 GPIC在Vp1蛋白组、Tris甘氨酸溶液组、S蛋白组及培养液组培养72 h,包涵体计数分别为5.0 ± 1.5、24 ± 1.2、25 ± 1.7及25 ± 1.5,各组包涵体数比较,差异有统计学意义（F = 476.632,P < 0.05）。Vp1蛋白组GPIC包涵体数显著低于Tris甘氨酸溶液组、S蛋白组及培养液组（P < 0.05）,而后3组之间差异无统计学意义（P > 0.05）。与阴性对照组（培养液组）相比,Vp1蛋白对GPIC的抑制率为（80.2 ± 3.99）%。此外,Vp1蛋白对E型沙眼衣原体的抑制率为（77.2 ± 1.79）%,t检验示Vp1对GPIC的作用与对E型沙眼衣原体的作用差异无统计学意义（t = 2.057,P > 0.05）。 结论 Vp1蛋白可明显抑制GPIC的感染,同时对E型沙眼衣原体有相似的抑制作用。     

性病门诊患者使用CC法和QV法检测衣原体的结果比较分析

沙眼衣原体(CT)在性传播疾病(STD)中占非常重要的地位,其中非淋菌性尿道炎(NGU)40～50%由沙眼衣原体引起,检查衣原体的方法有多种:可以对细胞涂片做姬姆萨(Giemsa)染色;也可以做直接免疫荧光检查标本中有无感染衣原体包涵体或原体.     

沙眼衣原体持续和急性感染状态McCoy细胞Rab蛋白表达差异的研究

目的 探讨沙眼衣原体(Ct)急性感染和持续感染McCoy细胞后Rab蛋白家族表达的差异.方法 Ct感染McCoy细胞后,经青霉素G诱导获得持续感染组,未经青霉素G诱导为急性感染组,同时设立无衣原体感染、无青霉素G处理的空白对照组和无衣原体感染、有青霉素G处理的青霉素对照组.感染48 h后,裂解McCoy细胞、收集蛋白后,用ELISA检测以上各组Rab4A、Rab6A、Rab10、Rab1 1A、Rab14蛋白水平,同时提取各组细胞RNA,采用荧光定量PCR检测Rab4A和Rab14 mRNA的相对表达量(用2-△△α法计算).结果 Ct持续感染组Rab4A、Rab6A、Rab10、Rab1 1A、Rab14蛋白水平均高于急性感染组,差异有统计学意义(Z值均为3.621,均P＜ 0.001),且急性感染组和持续感染组中5种蛋白水平均显著低于空白对照组(均P＜0.008 3),而空白对照组和青霉素对照组中这5种Rab蛋白表达水平差异无统计学意义(均P＞ 0.05).在转录水平,Rab4A和Rab14mRNA在各组的表达均显示与其蛋白表达相同的趋势.结论 McCoy细胞在Ct持续感染状态下,Rab蛋白的转录和表达水平高于急性感染状态.     

中药尿路清合剂体外抗沙眼衣原体活性研究

目的了解中药尿路清合剂体外抗泌尿生殖道沙眼衣原体的活性。方法尿路清合剂浓度为1g/ml,10株沙眼衣原体为来自性病门诊的临床株,未进行血清学分型,应用微量McCoy细胞培养法,检测中药尿路清体外抗沙眼衣原体的活性。结果尿路清有抗泌尿生殖道沙眼衣原体的活性,当浓度为50～200mg/ml时能显著减少包涵体数目,其最大抑制率达94%,随着中药浓度的升高,衣原体包涵体的体积逐渐减小、数量逐渐减少,最后消失。结论尿路清有体外抗泌尿生殖道沙眼衣原体的作用。     

299例泌尿生殖道沙眼衣原体的检测及药物敏感性分析

目的:检测近4年来天津地区泌尿生殖道沙眼衣原体对阿奇霉素、米诺环素、莫西沙星3种临床常用抗生素体外药物敏感性,并评价药敏结果与临床疗效的关系.方法:将采集到的符合要求的299例临床标本及E型标准株破壁、离心后接种于细胞培养板的McCoy细胞,培养60～72 h后碘染观察衣原体包涵体.原代培养阴性或阳性的标本均进行传代培养.阴性标本均传代培养至第5代,阳性标本传代培养至感染率达90%以上,收集标本进行3种常用抗生素的药敏试验.结果:共培养出沙眼衣原体阳性株104株,阳性率为34.78%.其中McCoy细胞感染率达90%以上的菌株共94株,药敏(最低抑菌浓度,MIC)结果分别为阿奇霉素(0.063～1.000 mg/L),米诺环素0.004～0.128 mg/L,莫西沙星0.030～0.240 mg/L.应用阿奇霉素、莫西沙星、米诺环素治疗后的沙眼衣原体总体阴转率分别为44.44%、63.46%、88.89%.结论:随着时间的推移和抗生素的广泛应用,抗生素的敏感性呈不同程度的下降,米诺环素抗衣原体活性相对较强.整体评价临床各类药物治疗效果与时间变化趋势分析,药敏结果与临床疗效之间明显相关.     

色氨酸缺乏及外源性吲哚对沙眼衣原体生长的影响

目的探讨色氨酸缺乏及外源性吲哚对沙眼衣原体E-UW-5/Cx和D-UW-5/Cx型标准株及临床株生长的影响。方法分别用DMEM-10细胞培养液(简称:DMEM-10)、缺乏色氨酸的DMEM-10细胞培养液[简称:DMEM-10(-Trp)]和缺乏色氨酸的DMEM-10细胞培养液中加入10μM外源性吲哚的细胞培养液[简称:DMEM-10(-Trp)+IND]三种液体培养沙眼衣原体至48h,甲醇固定,计数包涵体,观察色氨酸缺乏及外源性吲哚对E型和D型沙眼衣原体标准株及临床株生长的影响。结果 DMEM-10组(-Trp)组衣原体包涵体计数明显低于DMEM-10和DMEM-10(-Trp)+IND组,且差异有统计学意义(P0.01);但DMEM-10组和DMEM-10(-Trp)+IND组包涵体计数差异无统计学意义(P0.05);E型标准株、临床株与D型标准株、临床株之间生长差异也无统计学意义(P0.05)。结论色氨酸缺乏不利于沙眼衣原体的生长,补充外源性吲哚后,沙眼衣原体可恢复其感染活力。     

沙眼衣原体实验室诊断研究进展

衣原体是严格细胞内寄生、有独特生活周期的原核细胞型微生物。其中沙眼衣原体(Ｃｔ)与人类疾病关系密切,可分为15个血清型,其中ＡＣ型引起沙眼,ＤＫ型引起泌尿生殖道感染。在西方国家该感染发病率已居性传播疾病首位,在我国其发病率仅次于淋病、尖锐湿疣居第三位。这些引起了世界各国学者的关注且进行了大量的研究。本文就此领域的研究进展作一介绍。一、细胞涂片染色法常用染色为Ｇｉｅｍｓａ、碘、荧光抗体染色。Ｃｔ在柱状上皮细胞内增殖形成包涵体,取宫颈或尿道标本涂片染色可直接镜检。此法简便且特异性为100%,但标本中完整细胞少、细…