t-PA突变体乳腺表达载体的构建及其在乳腺中的瞬时表达

目的 :探索建立乳腺瞬时性表达系统 ,用于快速检测所构建的乳腺表达载体的有效性 ,为进行转基因动物实验奠定基础。方法 :DNA常规操作 ;孕小鼠乳腺注射 ;纤维蛋白琼脂糖平板法检测Mut PA。结果 :构建了含有Mut PA基因的乳腺表达载体pB3mt PA ,将此载体直接注射到孕小鼠乳腺中进行暂时性表达 ,产仔后第 4天采乳汁 ,用纤维蛋白琼脂糖平板法检测t PA的活性 ,表达活性可达 2 0～ 4 0U/ml,其活性能被天然的t PA多克隆抗体所中和 ,表达持续期 8d。结论 :所克隆的牛BLG基因 70 5bp的 5′端调控序列包含了必需的调控元件 ,并具有调控外源基因的表达的功能 ,克隆的 3′端序列是适合的。构建的表达载体可用于制备转基因动物。     

1.1倍长乙型肝炎病毒基因组在Huh7细胞中的高效复制和表达

目的构建乙型肝炎病毒(HBV)1.1倍基因组长度的重组载体,研究其在人肝癌细胞系Huh7中的复制与表达。方法以慢性乙型肝炎患者C基因型HBV DNA为模板,用聚合酶链反应(PCR)扩增出HBV基因组的两条DNA片段,酶切后与载体连接成含HBV1.1倍基因组长度的重组载体。经PCR、酶切及测序鉴定后,将重组载体经FuGENEHD转染入Huh7细胞,用ELISA检测转染细胞培养上清液的HBsAg和HBeAg表达,用荧光定量PCR和Southern杂交检测HBV DNA的复制水平及复制中间体。结果经鉴定证实成功构建1.1倍基因组长度C基因型HBV重组载体,体外转染Huh7细胞48h后,培养上清液中检出HBsAg和HBeAg表达;转染72h后,荧光定量PCR检出较高的HBV DNA复制水平(107～109拷贝/ml);Southern杂交检出病毒复制中间体。结论构建的1.1倍长重组载体可以介导高水平的HBV病毒复制和基因表达,为进一步体外瞬时转染HBV表型耐药分析奠定基础。     

平滑肌细胞特异表达Cre重组酶转基因小鼠的建立

目的：建立平滑肌细胞特异表迭Cre重组酶的转基因小鼠。方法：用分子克隆的方法构建含有α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)启动子、Cre重组酶基因和polyA的转基因载体α-SMA-Cre。以显微注射的方法将5．3kb的转基因片段引入小鼠基因组。通过PCR和LacZ染色以检测Cre重组酶在体内介导重组的功能。结果：共注射282枚受精卵，移植至10只假孕母小鼠的输卵管中发育，获得子代小鼠19只，经PCR鉴定有4只小鼠在基因组上整合有Cre基因，整合率为2l％。将该小鼠与基因组上携带LoxP位点的Smad4务件基因打靶小鼠交配，通过PCR在所有含有平滑肌细胞的组织基因组DNA中检测到重组后的234bp特异条带。与“报告”小鼠-ROSA26交配，LacZ染色后小肠壁平滑肌细胞中特异地检测到Cre重组酶活性。结论：成功构建了平滑肌细胞特异表达Cre重组酶的转基因小鼠．该小鼠在平滑肌细胞中特异表迭Cre重组酶，并能在体内成功地介导LoxP位点间的重组。     

心脏组织特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立

目的：建立在小鼠心肌细胞中特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠。方法：构建了心肌细胞特异性表达Cre重组酶的转基因载体。该载体通过显微注射被导入小鼠受精卵中，通过胚胎移植，获得转基因首建者小鼠。利用PCR检测子代小鼠Cre重组酶整合情况。通过Northern杂交检测Cre重组酶表达的组织特异性。结果：构建了含有心肌细胞特异性α-肌球蛋白重链(α-MHC)启动子、Cre重组酶基因和人生长激素基因polyA的转基因载体α-MHC—Cre—hGH。将转基因载体进行显微注射，共注射了215枚小鼠受精卵，其中202枚移植入13只假孕母鼠的输卵管中发育，获得子代小鼠42只。PCR检测发现有1只小鼠在其基因组上整合有Cre重组酶基因。Northem杂交检测结果显示该转基因小鼠只在心脏组织中特异性地表达Cre重组酶基因。结论：成功获得了在小鼠心肌细胞中特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠，为利用条件基因打靶技术研究基因在心脏发育与相关疾病中的功能提供了有利的工具。     

1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠的制备及检测

目的制备1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠,为乙肝的防治提供较好的动物模型。方法采用受精卵显微注射法,制备1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠;采用PCR、ELISA、荧光定量PCR和免疫组化方法检测HBV基因在转基因小鼠体内的整合、复制和表达情况。结果共注射受精卵2282枚,成活2024枚,注射成活率88.7%。共移植假孕雌鼠72只,59只怀孕,假孕雌鼠妊娠率81.9%。共产下F0代小鼠185只,PCR检测共有19只整合阳性,阳性率10.3%。血清荧光定量PCR结果显示,其中6只小鼠有HBV DNA复制,拷贝数为102~103拷贝/ml;经传代产下F1代小鼠96只,PCR检测HBV DNA阳性33只,阳性率34.4%。血清荧光定量PCR结果显示,其中10只小鼠有HBV DNA复制,拷贝数为102~103拷贝/ml;F0代和F1代小鼠随机分别各取3只进行肝脏和肾脏HBsAg免疫组化检测结果均为阳性,且肾脏表达高于肝脏。结论 1.3拷贝C基因可以在上述制备成功的C型HBV转基因小鼠体内复制和表达,并且可以遗传给下一代。     

心肌细胞特异性Let-7b转基因小鼠的建立

目的建立心肌细胞中特异性过表达Let-7b的转基因小鼠。方法构建心肌细胞特异性过表达Let-7b的转基因载体,显微注射导入小鼠受精卵中,通过胚胎移植,获得转基因首建者小鼠。利用PCR检测子代小鼠Let-7b基因整合情况。通过实时定量PCR检测Let-7b过表达的效率。结果 PCR检测发现,1只小鼠在其基因组上整合有Let-7b基因。实时定量PCR结果显示,该转基因小鼠在心脏组织中特异性地过表达Let-7b基因。结论成功获得了在小鼠心肌细胞中特异性过表达Let-7b的转基因小鼠。     

α—粒子诱发BEP2D2细胞癌变系的DNA断裂重接修复缺陷与XRCCs修复基因mRNA表达研究

目的 研究α粒子诱发人支气管上皮细胞（BEP2D）癌变细胞系BERP35T－1和BERP35T－4的DNA断裂损伤修复能力，分析其DNA断裂修复基因XRCCs系列的mRNA表达。方法 脉冲电场凝胶电泳法检测DNA双链断裂，RT－PCR分析DNA修复基因的mRNA表达。结果 恶笥转化细胞系BERP35T－1和BERP35T－4受0－150Gy γ射线照射后修复4h的DNA断裂残留损伤显著高于亲本BEP2D细胞，mRNA表达分析显示修复基因XRCC2，XRCC3和Ku80(XRCC5)表达下调2.5-6.5倍，而BERP355－R细胞中DNA－PKcs(XRCC7)表达上调2．4倍。结论 α粒子诱发恶性转化细胞系的DNA链断裂修复机理缺陷，其中部分原因是DNA修复基因的表达抑制。DNA修复缺陷将导致细胞基因组不稳定性，α粒子诱发细胞恶性转化机理可能与此相关。     

人铜锌超氧化物歧化酶基因启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体的构建及表达

目的 构建人铜锌超氧化物歧化酶基因(Cu/Zn SOD,SOD1)启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,并对其功能进行鉴定,为研究细胞内SOD1基因表达调控和相关的信号转导机制提供重要工具.方法 提取人基因组DNA,FCR扩增SOD1 5'非编码区启动子序列(-1 499- +17);采用基因重组技术构建由SOD1启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,将该载体瞬时转染Hella细胞,观察静息或佛波酯(PMA)刺激下红色荧光蛋白表达,以检测SOD1启动子的转录活性及其基凶表达.结果 酶切和DNA测序证明所构建红色荧光蛋白报告基因载体正确;该表达载体静息状态下在Hella细胞表达少量红色荧光蛋白,经PMA刺激后,能够表达较多高亮度的红色荧光蛋白.结论 成功构建了SOD1启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,其对相关刺激有很好的反应,可用于SOD1基因表达信号调控机制的研究.     

基于生物信息学分析的人ID4基因启动子表达载体的构建及鉴定

目的:基于生物信息学分析构建人ID4基因启动子表达载体,以其作为研究ID4基因启动子表达调控分析的工作基础.方法:在分析人ID4基因启动子结构和调控元件的基础上,据UCSC基因组生物信息学中人ID4基因转录起始点(TSS)上游启动子区-643 bp及5'非翻译区(5'-UTR) 164 bp序列设计并合成引物,进行PCR扩增;以PCR产物作为模板经巢式PCR扩增了TSS上游启动子区-621 bp片段,将PCR产物回收、纯化后再连接到pGEM-T Easy载体上并转化至DH5α感受态大肠杆菌中构建成pGEM-T Easy-人ID4基因启动子重组质粒.转化产物经半巢式PCR及酶切鉴定,对得到的阳性克隆进行测序.结果与结论:成功构建出含有糖皮质激素受体、cAMP结合蛋白及雌激素受体反应调控元件序列的人ID4基因启动子表达载体.该表达载体的构建为进一步研究人ID4基因的启动子活性及表达调控奠定了基础.     

胃癌中TIMP3基因的甲基化与表达间的相关性分析

目的探讨转移抑制基因TIMP3(金属组织蛋白酶抑制因子-3)在胃癌和胃癌细胞系中启动子甲基化及其蛋白和mRNA表达的特点,并分析两者之间的关联。方法应用MSP法检测TIMP3基因启动子区的甲基化状态;RT-PCR和免疫组织/细胞化学法检测TIMP3基因mRNA和蛋白的表达;观察DNA去甲基化剂(5-aza-2’-deoxycitydine)对人胃癌细胞系(MGC803和HGC-27)细胞系TIMP3基因表达的影响。结果TIMP3基因于胃癌组织中的甲基化频率为17/33(51.5%);四个胃癌细胞系均存在TIMP3基因的甲基化,而MGC803、BGC823和HGC-27仍有该基因的表达或低水平表达;在去甲基化剂的作用下TIMP3基因的表达水平明显上调。结论TIMP3的异常甲基化是其表达下调或沉默的主要原因并存在部分甲基化的倾向。该指标可作为胃癌的敏感性表观遗传学标记物在胃癌的筛查和诊断中应用。     

脑红蛋白重组腺病毒表达载体的构建与鉴定

目的：为进一步研究脑红蛋白（NGB）的生理功能并为基因治疗缺血性脑损伤提供有效的表达载体，应用细菌内同源重组方法分别构建含NGB及绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组腺病毒表达载体，并对其进行鉴定。方法：用电转方法将腺病毒基因组质粒pAdEasy-1导入BJ5183细菌，制备BJ5183-pAdEasy-l细菌，再以后者作为电感受态细菌，与线性化质粒pShuttle-CMV-NGB进行同源重组，获得重组腺病毒质粒pAdEasy-NGB，转染293细胞。制备含脑红蛋白基因的重组腺病毒。结果：通过PCR、序列测定和Western印迹杂交鉴定，确认该重组腺病毒表达载体可正确表达脑红蛋白。结论：成功地构建了表达NGB基因的重组腺病毒载体，为深入开展脑红蛋白的功能研究以及用于缺血性脑损伤疾病的基因治疗奠定了基础。     

S100A2全长基因真核表达载体pEGFP-N2-S100A2的构建及其在胃癌细胞系BGC-823中的表达

 目的 克隆S100A2 cDNA,构建pEGFP-N2-S100A2重组表达载体,转染胃癌细胞系BGC-823,为探讨其对胃癌细胞系的影响奠定实验基础.方法 应用RT-PCR 和DNA 重组技术构建pEGFP-N2-S100A2 融合蛋白表达载体,质粒经测序正确后,用脂质体转染BGC-823 细胞.结果 重组质粒经限制性酶切鉴定得到与S100A2全长基因长度一致(294 bp) 的酶切产物; 测序分析证实,重组质粒中含有一与GenBank 上登录的S100A2基因(NM-005978) 序列完全一致的序列,表明成功地完成了表达载体的构建; 荧光显微镜下可见转染的BGC-823 细胞有绿色荧光蛋白的表达.结论 构建完成真核表达载体pEGFP-N2-S100A2,S100A2基因在BGC-823细胞内成功表达.     

乙型肝炎病毒DNA聚合酶反式调节人类新基因HBVDNAPTP1的克隆及原核表达与组织表达分析

目的 克隆应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学技术筛选得到的乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶反式调节新型靶基因HBVDNAPTP1,构建HBVDNAPTP1基因的原核表达载体,诱导其在大肠埃希菌中表达,并进一步分析HBVDNAPTP1在组织中的分布表达水平.方法 应用RT-PCR技术扩增获得HBVDNAPTP1基因片段,测序正确后插入至原核表达载体pET-32a( )中,转化BL21(DE3)宿主菌,IPTG诱导以获得HBVDNAPTP1融合蛋白的表达,利用Western blot证实表达蛋白的特异性.应用UniGene数据库对HBVDNAPTP1基因的染色体中定位及组织分布表达水平进行分析.结果 RT-PCR扩增获得HBVDNAPTP1基因片段,插入pET-32a( )表达载体,转化BL21(DE3)受体菌,经IPTG诱导获得了HBVDNAPTP1重组蛋白的表达,Western blot证实了表达的重组蛋白的特异性.HBVDNAPTP1在多数组织中低表达,仅在脑垂体腺、扁桃体、舌、胸腺、气管与脐带中无表达.结论 成功构建了HBVDNAPTP1基因的原核表达载体,利用大肠埃希菌原核表达系统获得了重组蛋白的表达,并初步了解了HBVDNAPTP1基因的染色体定位与组织表达水平.     

大肠杆菌-链霉菌穿梭型BAC载体的构建及功能验证

目的构建可由大肠杆菌接合转移至链霉菌并整合至其基因组的穿梭型BAC载体,以实现大片段基因簇在大肠杆菌中完成遗传操作后,转移至链霉菌中进行异源表达。方法从原始B载体pBeloBAC11出发,利用pKD46介导的Red同源重组技术,将一段包含接合转移元件oriT、定点整合元件attp-int和安普霉素抗性基因Am的DNA片段替换其上的氯霉素抗性基因,该DNA片段通过PCR扩增得到,两端为待替换氯霉素抗性基因上下游55 bp的同源臂,替换后的载体通过酶切连入链霉菌组成型启动子ermEP1P2和绿色荧光蛋白（GFP）基因以验证其接合和整合功能。结果原载体pBeloBAC11的氯霉素抗性基因被成功替换,得到载体pBTIBAC1,利用该载体可在变铅青链霉菌（Streptomyces lividans）TK24和1326中表达GFP,在pBTIBAC1上插入新的多克隆位点（MCS）后得到载体pBTIBAC11。结论 pBTIB AC11载体可通过接合转移携带外源基因片段进入链霉菌并整合至其基因组中,同时保留了原有BAC载体的功能元件,为大片段在链霉菌中的异源表达奠定了基础。     

hTERT基因转染对人胚胎成纤维细胞端粒长度、端粒酶活性及其亚单位的影响

为了探讨外源性人端粒酶蛋白催化亚单位 (hTERT)基因转染对人胚胎成纤维细胞 (hEFs)端粒长度、端粒酶活性及其亚单位的影响 ,采用基因重组技术构建hTERT全长cDNA正义荧光真核表达载体 ,并采用脂质体法将正义重组质粒pIRES2 EGFP hTERT及空载质粒pIRES2 EGFP分别转染原代培养hEFs,检测转染细胞端粒长度、端粒酶活性及端粒酶亚单位的变化。结果显示 ,外源性hTERT基因转染细胞 (hEF hTERT)端粒酶活性较未转染细胞 (hEFs)及空载体转染细胞 (hEF EGFP)显著增加 (P <0 0 1) ,hEF hTERT、hEFs及hEF EGFP端粒长度分别为 6 0kb、5 3kb及 5 4kb ,端粒酶亚单位中除hTERT在mRNA和蛋白水平表达均增加外 ,hTR和TP1mRNA无明显变化。以上结果提示 ,外源性hTERT基因转染能使原代培养的hEFs端粒酶活化 ,端粒长度不再继续缩短 ,hTERT在mR NA和蛋白水平表达增加     

外源性WAF1-S基因表达对喉癌细胞生长的作用

目的 探索WA1F-S基因在喉癌细胞内表达的作用,为喉癌的基因治疗提供理论依据。方法 采用亚克隆技术,构建WAF1-S真核表达载体pcDNA3-WAF1-S。利用lipofectamine介导,将外源野生型WAF1-S基因导入喉癌细胞系Hep-2,筛选阳性克隆,采用打点杂交技术观察WAF1-S基因mRNA在喉癌细胞中的表达,用Western blot及激光共聚焦方法定量分析WAF1-S基因的蛋白表达产物,MTT及流式细胞仪检测Hep-2细胞的生长状态。同时以空载体质粒pcDNA3为对照,分析WAF1基因对喉癌细胞生长的影响。结果 打点杂交证实转染WAF1-S基因的Hep-2细胞有外源WAF1-S基因的表达,外源基因WAF1-S在Hep-2细胞系中的表达能抑制Hep-2细胞系的生长。转染后喉癌细胞中WAF1-S的蛋白表达明显高于对照组。流式细胞仪计数证实WAF1-S能诱导喉癌细胞系Hep-2发生凋亡并导致其发生G1期阻滞。结论 导入外源野生型WAF1-S基因可抑制喉癌细胞生长。     

人中性粒细胞多肽1真核表达载体的构建与表达

目的 构建人中性粒细胞多肽1(HNPl)基因真核表达载体,为探讨HNP1基因工程生产的可能性奠定基础。方法 从健康人中性粒细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出HNPl基因cDNA片段,将纯化PCR产物与pMD18-T载体连接,经酶切鉴定及测序确证,将其亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO中．用脂质体转染CA3S-7细胞,用BA-ELISA法检测转染细胞上清中HNP1的表达。结果 从人中性粒细胞中克隆出人HNP1基因,经测序分析与GenBank公布的人HNP1核苷酸序列完全一致,并在COS-7细胞中获高效瞬时表达。结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO／HNP1,为后续哺乳动物工程细胞株的建立奠定了实验基础。     

利用套叠PCR技术合成人胰岛素原基因的临床研究

目的设计并分子克隆适宜于大肠杆菌表达系统的人胰岛素原基因。方法以美国国家基因库（GenBank）发布的人胰岛素原的氨基酸序列为模板,参考大肠杆菌表达系统的密码子偏好性以及所用表达载体（pGEX-3x）的特点,经计算机分析、设计人胰岛素原基因为8个寡核苷酸片段,以重叠延伸PCR（SOE-PCR）技术体外延伸获得完整的人胰岛素原基因,分子克隆后测定所得基因的核苷酸序列。结果经限制性内切酶分析确定为重组克隆的质粒进行核苷酸序列分析,结果表明,我们所克隆的基因序列完全符合我们先前的设计。结论SOE-PCR技术可用于体外寡核苷酸片段的延伸并获得完整长度的基因。TaqDNA聚合酶延伸反应前以Klenow片段处理可提高较短覆盖末端或较低专一性末端正确延伸的成功率。     

CyclinD1、P27、CK19、ALDH1A1在乳腺病变中表达及意义

目的探讨细胞周期D1(Cyclin D1)、P27、细胞角蛋白19(CK19)、ALDH1A1在乳腺病变中的表达及其临床意义。方法采用免疫组化法检测79例乳腺组织标本(包括正常乳腺、乳腺增生、乳腺导管原位癌、乳腺浸润性导管癌)中Cyclin D1、P27、CK19、ALDH1A1的表达情况,分析其与乳腺癌干细胞增殖及乳腺病变组织分化程度之间的关系。结果正常乳腺、乳腺增生、乳腺导管原位癌、乳腺浸润性导管癌中Cyclin D1、ALDH1A1的表达逐渐上升,P27、CK19的表达逐渐下降;乳腺正常及良性增生组织中Cyclin D1、CK19、ALDH1A1的表达明显低于乳腺导管原位癌及浸润性导管癌(P<0.05);乳腺正常及良性增生组织中P27的表达明显高于导管原位癌及浸润性导管癌(P<0.05)。结论 Cyclin D1、P27相互作用调节乳腺癌干细胞的发生及发展过程,CK19、ALDH1A1可作为乳腺癌诊断及恶性程度评估的参考指标。     

表达人HER2/neu及荧光素酶的小鼠乳腺癌模型的建立

目的建立表达HER2/neu表皮生长因子受体及萤火虫荧光素酶基因的小鼠乳腺癌细胞模型。方法将重组人HER2/neu原癌基因真核表达载体与荧光素酶报告基因依次转染小鼠乳腺癌4T1细胞系,用G418与潮霉素加压筛选阳性克隆,Western印迹及活体成像技术鉴定HER2/neu和荧光素酶在4T1细胞中的表达。在BALB/c小鼠前肢乳腺皮下注射该细胞1.5×106个,活体成像观察肿瘤的生长及转移。结果与结论经过两步转染获得抗G418及潮霉素4T1细胞,Western印迹结果显示,该细胞高表达HER2/neu。流式细胞术检测结果提示几乎所有细胞均有GFP的表达。用该细胞株接种小鼠后具有与野生型4T1细胞相似的成瘤性和转移能力。实验结果提示,我们已建立可表达HER2/neu表皮生长因子受体及荧光素酶基因的小鼠乳腺癌细胞株,为乳腺癌的研究提供一个良好的模型。