合欢皮-白蒺藜药对对AngⅡ-ROS诱导下HSC-LX2细胞增殖及PKC/Nrf2/HO-1通路的影响

[目的]探讨合欢皮-白蒺藜含药血清对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱导产生的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)作用下人源性肝星状细胞HSC-LX2的增殖及蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)/核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)/血红素氧化酶-1(hemeoxygenase-1,HO-1)通路的影响。[方法]以HSC-LX2细胞为研究对象,先以AngⅡ诱导产生ROS,再以合欢皮-白蒺藜含药血清进行干预,MTT法检测HSC-LX2细胞的增殖情况,Western blot和Real-time PCR检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、PKC、Nrf2、HO-1蛋白以及m RNA表达情况。[结果]MTT结果显示,与AngⅡ组比较,合欢皮-白蒺藜药对高、中、低剂量组均显著抑制HSC-LX2细胞增殖(均P<0.05)。Western blot结果显示,与AngⅡ组比较,合欢皮-白蒺藜药对高、中、低剂量组α-SMA蛋白表达减少(均P<0.001),低剂量组PKC蛋白表达减少(P<0.05),高、中剂量组Nrf2蛋白表达减少(P<0.001,P<0.01),高、中剂量组HO-1蛋白表达减少(P<0.001,P<0.001)。Real-time PCR结果显示,与AngⅡ组比较,合欢皮-白蒺藜药对高、中、低剂量组α-SMA mRNA表达减少(P<0.01,P<0.001,P<0.001),PKC mRNA表达减少(均P<0.001),Nrf2 mRNA表达减少(P<0.001,P<0.001,P<0.05),高、中剂量组HO-1 mRNA表达减少(均P<0.001)。[结论]HSC-LX2细胞经AngⅡ刺激后增殖活化明显,且α-SMA表达升高,此过程与PKC、Nrf2、HO-1蛋白的激活有关。合欢皮-白蒺藜可通过抑制HSC-LX2细胞增殖来阻止肝纤维化,其机制与抑制PKC、Nrf2、HO-1的表达有关。     

鳖甲煎丸化裁方对肝癌HCCLM3细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨鳖甲煎丸化裁方对肝癌HCCLM3细胞增殖和凋亡的影响。方法采用SD大鼠每天灌胃鳖甲煎丸化裁方(21 g/kg),7 d后腹主动脉取血离心获得含药血清。96孔板加入不同浓度鳖甲煎丸化裁方含药血清,分别干预24、48、72 h后,每孔加入10μL MTT溶液,继续培养4 h,检测各含药血清对HCCLM3增殖的影响;培养HCCLM3细胞后,向各孔内分别加入5%、10%、20%的鳖甲煎丸化裁方含药血清及葫芦素I培养24、48 h后,Annexin V-FITC/PI法检测含药血清对HCCLM3凋亡的影响。结果鳖甲煎丸化裁方各浓度含药血清在干预24 h后5%、10%含药血清对细胞增殖的影响不大,与对照组相比较,差异无统计学意义(P0.05)。在各给药组干预48 h后,10%、20%含药血清组的增殖率分别为87.86%和84.60%,与对照组相比较,对细胞的增值率影响具有统计学差异(P0.05)。各给药组在干预24 h后,5%含药血清组对细胞造成的凋亡与对照组相比较,无统计学差异(P0.05),而10%、20%含药血清及葫芦素I(0.5μmol/L)的凋亡率分别为7.90%,12.22%和15.36%,具有统计学差异(P0.05)。各给药组在干预48 h后,鳖甲煎丸代裁方含药血清5%、10%、20%组及葫芦素I(0.5μmol/L)的凋亡率分别为8.08%,11.95%,13.89%和19.02%,与对照组比较差异具有统计学意义(P0.05)。结论鳖甲煎丸化裁方含药血清具有明显抑制HCCLM3增殖并促进其凋亡的作用,作用效果随剂量增加而增强。     

鳖甲煎丸化裁方及其拆方对肝癌H22细胞的影响

目的探讨鳖甲煎丸化裁方及其拆方(软坚散结方、扶正方)对肝癌H22细胞增殖、侵袭、迁移及上皮间质转化(EMT)的影响。方法将50只健康SD大鼠随机分为空白组,鳖甲煎丸化裁方低、中、高浓度组,软坚散结方低、中、高浓度组,扶正方低、中、高浓度组,每组5只,制备含药血清;采用CCK8法检测各组大鼠含药血清干预肝癌H22细胞12 h、24 h、48 h后的增殖影响;采用Transwell检测鳖甲煎丸化裁方及其拆方对肝癌H22细胞迁移与侵袭能力的影响;免疫荧光检测Vimentin与E-cadherin蛋白的表达,评估鳖甲煎丸化裁方及其拆方对H22肝癌细胞EMT进程的影响。结果各给药组干预12 h、24 h后,与空白组比较,鳖甲煎丸化裁方、软坚散结方、扶正方的低、中、高浓度组均可抑制H22肝癌细胞的增殖,差异有统计学意义(P 0.05)。各给药组干预48 h后,与空白组比较,除鳖甲煎丸化裁方低浓度组外,其余各组均可抑制H22肝癌细胞的增殖,差异有统计学意义(P 0.05)。与空白组比较,鳖甲煎丸化裁方高浓度组及其拆方高浓度组均可抑制H22细胞的迁移和侵袭能力,差异有统计学意义(P 0.05),与鳖甲煎丸高浓度组比较,软坚散结高浓度组、扶正高浓度组的细胞迁移和侵袭数相对较高,鳖甲煎丸高浓度组中迁移和侵袭细胞数量最少,表明鳖甲煎丸化裁方高浓度组较其拆方高浓度组抑制肝癌H22细胞的迁移和侵袭能力更明显。与空白组比较,鳖甲煎丸化裁方高浓度组及其拆方高浓度组可提高E-cadherin相对荧光表达量,降低Vimentin的表达,差异有统计学意义(P 0.05)。结论鳖甲煎丸化裁方及其拆方可抑制H22肝癌细胞的增殖、侵袭、迁移及EMT的进程,鳖甲煎丸化裁方较拆方效果更显著。     

鳖甲煎改良方含药血清对肝星状细胞增殖、周期及凋亡的影响

目的 探讨鳖甲煎改良方含药血清对大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)-T6增殖、周期及凋亡的影响.方法 分别用高剂量[28.4 g/(kg·d)]、中剂量[14.2g/(kg·d)]与低剂量[7.1 g/(kg·d)]的鳖甲煎改良方及与鳖甲煎改良方高剂量相同剂量的鳖甲煎丸灌胃大鼠以制备含药血清.将等体积不同剂量的鳖甲煎改良方含药血清分别处理HSC-T6细胞,以等体积鳖甲煎丸含药血清处理的细胞为阳性对照组,生理盐水处理的细胞为空白对照组,正常大鼠血清处理的细胞为正常对照组.CCK-8检测不同处理组HSC-T6细胞的增殖情况,并绘制其增殖曲线;流式细胞仪(flow cytometry,FCM)检测经不同处理的HSC-T6细胞的周期,Annexin V-PI染色法检测其凋亡;在mRNA及蛋白水平分别检测经不同处理的HSC-T6细胞的增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)基因及其编码蛋白的表达变化.结果 CCK-8检测结果显示,鳖甲煎改良方含药血清对HSC-T6细胞增殖具抑制作用,高剂量与中剂量组的增殖速度慢于正常对照组、阳性对照组和空白对照组(P ＜0.05,P＜0.01),且该抑制作用呈剂量-效应关系.FCM检测证实,鳖甲煎改良方含药血清可将HSC-T6细胞阻滞于S期,能诱导HSC-T6细胞的凋亡,与正常对照组比较,其凋亡诱导率差异具有统计学意义(P＜0.01).mRNA与蛋白水平检测结果显示,与空白对照组和阳性对照组比较,高剂量组能在基因与蛋白水平显著下调HSC-T6细胞PCNA的表达.结论 鳖甲煎改良方含药血清能明显抑制HSC-T6细胞的增殖,诱导HSC-T6细胞的凋亡,并能下调其PCNA基因及其编码蛋白的表达.     

鳖甲煎丸调控EGFR/MAPK/ERK通路对MHCC-97H肝癌细胞的影响

目的 探讨鳖甲煎丸通过miR-885-5p对表皮生长因子受体(EGFR)/丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)/细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路的靶向调控对MHCC-97H肝癌细胞的影响及作用机制。方法 SPF级SD大鼠10只随意分为空白组和鳖甲煎丸(1.1 g/kg)组,制备空白及鳖甲煎丸含药血清。取对数生长期的MHCC-97H细胞,分为模型组、不同质量分数(5%、10%、15%、20%)空白血清梯度组和鳖甲煎丸含药血清梯度组,以及不含细胞的空白组。CCK-8法检测细胞增殖,筛选含药血清最佳干预时间及质量分数。将MHCC-97H细胞分为空白对照组(不做任何处理)、鳖甲煎丸含药血清组(20%鳖甲煎丸含药血清)、miR-885-5p mimics组(转染miR-885-5p mimics)、miR-NC组(转染miR-885-5p阴性对照物)、鳖甲煎丸含药血清+miR-885-5p mimics组(20%鳖甲煎丸含药血清和转染miR-885-5p mimics),各组细胞均培养72 h。采用双荧光素酶报告实验验证miR-885-5p与EGFR的靶向关系。CCK-8法检测细胞增殖,细胞划痕实...     

AngⅡ-ROS-PKC/Nrf2/HO-1通路调控LX-2细胞增殖的机制研究

[目的]研究血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)对体外培养的LX-2细胞增殖的影响,并探讨蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)/核因子相关因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)/血红素氧化酶(hemeoxygenase-1,HO-1)通路在其中的作用。[方法]采用MTT法检测不同浓度AngⅡ作用不同时间对LX-2细胞增殖的影响,流式细胞术检测AngⅡ刺激后不同时间点LX-2细胞的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)表达水平,Western blot技术检测PKC、Nrf2、HO-1蛋白表达水平。[结果]与正常组比较,当AngⅡ浓度为10-5mol·L-1时,LX-2细胞增殖有统计学差异(P0.01)。与正常组比较,以10-5mol·L-1的AngⅡ刺激LX-2细胞0.5、24h时,细胞增殖有统计学差异(P0.05),ROS表达显著增加(P0.05)。Western blot提示,与正常组比较,10-5mol·L-1的AngⅡ刺激LX-2细胞2、24h后,PKC蛋白表达显著增加(P0.05,P0.01);刺激细胞2、12、24h后,Nrf2蛋白表达显著增加(P0.05,P0.01,P0.001);刺激细胞24h后,HO-1蛋白表达显著增加(P0.05)。[结论]AngⅡ刺激LX-2细胞后,早期即可产生ROS,促进细胞增殖,并迅速激活PKC,进而诱导Nrf2从复合物解离并移位入核,激发HO-1的表达,启动了细胞自身潜在的抗氧化作用。     

鳖甲煎丸活血化瘀抗肿瘤作用的实验研究

目的:研究活血化瘀方——鳖甲煎丸对肿瘤的抑制作用。方法:以H22荷瘤小鼠为对象,环磷酰胺为阳性对照药,生理盐水为阴性对照组,来观察鳖甲煎丸高剂量组及低剂量组对瘤块的抑制作用。结果:鳖甲煎丸高剂量组和鳖甲煎丸低剂量组的抑瘤率与阴性对照组均有显著性差异(P<0.01);鳖甲煎丸高剂量组与鳖甲煎丸低剂量组的抑瘤率间亦有显著性差异(P<0.05);鳖甲煎丸高剂量组与环磷酰胺组比较其抑瘤率无显著性差异(P>0.05)。结论:具有破血化瘀、软坚散结之功效的鳖甲煎丸能显著抑制肿瘤的生长。     

清心饮抑制CVB3感染心脏内皮细胞发生 EndMT的作用机制研究

目的探讨清心饮含药血清通过调控Pyk2-PI3K-AKT信号通路抑制柯萨奇B3病毒(CVB_3)感染心脏微血管内皮细胞(CMVECs)向间充质细胞转分化(EndMT)的作用。方法选取稳定培养的心脏CMVECs,以100TCID_(50)CVB_3进行感染,采用20%清心饮含药血清进行干预(期间设立Pyk2抑制剂-TAE226和PI3K抑制剂-LY294002进行干预)。通过免疫荧光(IF)、蛋白质印迹(Western blot)、聚合酶链式反应(PCR)等实验方法检测内皮细胞标志物血小板/内皮细胞粘附分子-1(CD31)和间充质细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(Pyk2)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)蛋白及基因的表达。结果与空白对照组比较,模型组CD31蛋白表达下调,α-SMA蛋白表达上调(P0.05),Pyk2,PI3K,AKT蛋白均表达下调(P0.05)。与空白血清组比较,20%清心饮含药血清组CD31蛋白表达上调,α-SMA蛋白表达下调(P0.05);Pyk2,PI3K,AKT表达上调(P0.05)。与20%清心饮含药血清组比较,Pyk2抑制剂组PI3K,AKT表达下调(P0.05),CD31蛋白表达下调,α-SMA蛋白表达上调(P0.05);PI3K抑制剂组AKT表达下调(P0.05),CD31蛋白表达下调,α-SMA蛋白表达上调(P0.05),而Pyk2表达无明显变化(P0.05)。通过PCR亦发现,Pyk2,PI3K,AKT mRNA与Western blot法蛋白表达趋势一致。结论 20%清心饮含药血清可通过调控Pyk2-PI3K-AKT信号通路抑制CVB_3感染CMVECs发生EndMT。     

血管紧张素Ⅱ和坎地沙坦对小鼠骨骼肌细胞C2C12胰岛素敏感性的影响

目的研究血管紧张素Ⅱ和坎地沙坦对小鼠骨骼肌细胞(C2C12)胰岛素敏感性的影响及其机制。方法 C2C12诱导分化成熟后,分为对照组(C组)、模型组(M组,AngⅡ0.1μmol/L)、坎地沙坦低剂量组(Can1组,坎地沙坦0.1μmol/L+AngⅡ0.1μmol/L)、坎地沙坦中剂量组(Can2组,坎地沙坦1μmol/L+AngⅡ0.1μmol/L)、坎地沙坦高剂量组(Can3组,坎地沙坦10μmol/L+AngⅡ0.1μmol/L)。各组细胞给予相应药物及胰岛素处理后,使用二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)检测细胞内活性氧(ROS)的生成水平,使用2-脱氧葡萄糖(2-NBDG)检测细胞对胰岛素的敏感性,并用RT-PCR法和Western印迹法分别检测各组细胞内的核转录因子-2(Nrf2)的m RNA及蛋白表达水平。结果与C组比较,M组ROS生成水平显著升高(P<0.01),摄取2-NBDG量显著降低(P<0.01);与M组比较,Can3组ROS生成水平显著减少(P<0.05),摄取2-NBDG量则显著增加(P<0.05)。M组Nrf2的m RNA及蛋白表达较C组显著降低(P<0.01),Can2组及Can3组Nrf2的m RNA及蛋白表达较M组显著升高(P<0.01或P<0.05)。结论 AngⅡ通过下调C2C12中Nrf2的m RNA及蛋白表达,抑制Nrf2的抗氧化效应,增加ROS生成,引起骨骼肌细胞胰岛素抵抗;而坎地沙坦通过抑制AngⅡ的这种作用改善骨骼肌胰岛素抵抗。     

氯沙坦对血管紧张素Ⅱ损伤RIN-m细胞胰岛素分泌功能的保护及机制探讨

目的观察氯沙坦对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)损伤β细胞(RIN-m)功能的保护,并对其机制进行探讨。方法常规培养RIN-m细胞,分为空白对照组、100nmol/LAngⅡ组和氯沙坦预处理组,各组干预24h后使用放射免疫法检测基础(3.3mmol/L)和葡萄糖(16.7mmol/L)刺激下RIN-m细胞胰岛素分泌量;DCFH-DA染色流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS)水平;RT-PCR和Western blotting分别检测RIN-m细胞解偶联蛋白2(UCP2)mRNA和蛋白的表达。结果①各组基础胰岛分泌没有显著差异(P>0.05),在高糖刺激下,100nmol/LAngⅡ组胰岛素分泌量明显低于空白对照组(P<0.001),氯沙坦预处理组胰岛素分泌量与空白对照组无显著差异(P>0.05),但较AngⅡ组明显增加(P<0.001);②100nmol/LAngⅡ组细胞内ROS水平、UCP2mRNA和蛋白表达均较空白对照组明显增加(P<0.001),氯沙坦预处理组与空白对照组无显著差异(P>0.05),但较100nmol/LAngⅡ组显著降低(P<0.001)。结论AngⅡ损伤β细胞葡萄糖刺激胰岛素分泌(GSIS)功...     

加味青蒿鳖甲汤含药血清对白血病CEM细胞株增殖及凋亡的研究

目的:观察加味青蒿鳖甲汤含药兔血清对CEM细胞株增殖周期及凋亡的影响。方法:用加味青篙鳖甲汤含药兔血清与CEM细胞共同孵育24 h,用流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡。结果:不同剂量复方含药兔血清干预后CEM细胞G0/G1期的比例明显增高,高剂量组与低剂量组比较,有统计学意义(P0.05)。高、中剂量组的S、G2/M期的比例明显下降,与正常兔血清组比较,有统计学意义(P0.05)。低剂量组的S期的比例亦较低,与正常兔血清组比较,无统计学意义(P0.05)。不同剂量复方含药兔血清组PI、SPF与正常兔血清组比较,有统计学意义(P0.05),以高剂量组最优。不同剂量复方含药兔血清组细胞凋亡率与正常兔血清组比较有统计学意义(P0.05),高剂量组与低剂量组比较,有统计学意义(P0.05)。结论:加味青蒿鳖甲汤含药兔血清可抑制CEM细胞的增殖,并提高CEM细胞的凋亡率。     

当归补血汤含药血清对血管紧张素Ⅱ诱导肥大心肌细胞能量代谢的影响

目的:探讨当归补血汤含药血清对心衰后心肌能量代谢的影响。方法:体外培养心肌细胞,实验分为空白对照组、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)组、AngⅡ+缬沙坦组、AngⅡ+含药血清组;分别用塞唑蓝(MTT)法检测各组心肌细胞总蛋白含量和细胞活力;酶联免疫法检测乳酸脱氢酶(LDH)、琥珀酸脱氢酶(SDH)活性;激光共聚焦显微镜观察线粒体膜电位(MMP)变化。结果:与空白对照组比较,AngⅡ组心肌细胞总蛋白含量、细胞活力、LDH、SDH活性及MMP显著升高(P0.05);与AngⅡ组比较,AngⅡ+含药血清组心肌细胞总蛋白含量、细胞活力、LDH、SDH活性及MMP显著降低(P0.05)。结论:当归补血汤含药血清能通过抑制肥大心肌细胞LDH、SDH活性及MMP的病理性升高起到改善心肌能量代谢障碍,保护心肌细胞的作用。     

鳖甲煎丸对肝细胞癌中Wnt/β-catenin信号通路及抑制基因DKK-1、FrpHe表达的影响

目的通过研究鳖甲煎丸对肝细胞癌中Wnt 信号通路及抑制基因DKK-1、FrpHe 表达的影响,探讨其抗肝细胞癌转移
侵袭的作用机制与Wnt/β-catenin 信号通路的关系。方法24 只Wistar 大鼠随机分为3 组（8 只/组）,分别以临床剂量的20 倍、
10 倍的鳖甲煎丸和生理盐水灌胃3 d,3 d 后采血,离心,获取血清。分别将3 组血清加入DMEM培养液中培养肝癌细胞
HepG2,48 h 后采用流式细胞术检测细胞中的β-catenin 蛋白含量,qRT-PCR法检测DKK-1、FrpHe基因的表达情况,以进一步
阐明药物的作用机制与Wnt/β-catenin 信号通路的关系。结果流式细胞术结果：高剂量组和中剂量组含药血清均可显著降
低细胞中β-catenin 蛋白表达,且该作用与药物浓度有关。RT-PCR结果：高剂量组和中剂量组含药血清均可显著下调DKK-1
基因的表达,且该作用与药物浓度有关。而高剂量组和中剂量组含药血清对FrpHe 基因的表达影响不明显。结论鳖甲煎
丸能显著抑制肝细胞癌的生长、粘附和转移,且这种抑制作用与显著降低肝癌细胞中β-catenin 蛋白表达、显著下调DKK-1 基
因的表达,从而阻断Wnt/β-catenin 信号通路有关。
     

益心解毒方对大鼠心肌细胞内活性氧水平及信号转导通路的影响

目的 研究益心解毒方含药血清抑制血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的大鼠心肌细胞内活性氧(ROS)水平及信号转导通路相关分子的变化。 方法 取对数生长期的大鼠H9c2心肌细胞,同步化后进行实验,实验分为正常组:无造模刺激,无干预;模型组:10^-6mol/L的AngⅡ刺激24h,1%正常大鼠血清干预;益心解毒方组:10^-6mol/L的AngⅡ刺激24h,1%益心解毒方含药血清干预;二亚苯基碘(DPI)对照组:10^-6mol/L的AngⅡ刺激,10μmol/L的NADPH氧化酶抑制剂DPI干预24h,采用乙酰乙酸双氯荧光素(DCFH-DA)法测定H9c2心肌细胞ROS水平; Western blot法测定各组H9c2心肌细胞信号转导通路相关分子的变化。 结果 研究发现AngⅡ诱导的H9c2心肌细胞中ROS水平显著提高,而益心解毒方含药血清对增高的ROS水平都有明显的抑制作用,与模型组相比,低剂量组作用最为显著(P< 0.05);在给予AngⅡ培养24h后,低剂量组信号转导通路上的血管紧张素受体(AT1受体)、信号转导子和转录激活子3(STAT3)蛋白、基质金属蛋白酶(MMP9)蛋白表达水平低于模型组,差异有统计学意义(P< 0.01,P< 0.05)。 结论 益心解毒方通过降低心肌ROS水平;抑制AngⅡ引起的交感神经系统、肾素-血管紧张素系统(RAAS)过度激活、降低AT1受体的表达水平,抑制STAT3的作用而延缓心肌肥厚的过程,发挥其在心肌肥厚过程中的心肌保护作用;同时抑制MMPs的活性,减缓心肌重构。     

鳖甲煎丸对Wnt信号通路中β-catenin/TCF4复合物活性及信号分子cyclin D1、MMP-2的影响

目的探讨鳖甲煎丸抗肝细胞癌转移侵袭的分子机制。方法使用含鳖甲煎丸药物血清培养肝癌细胞HepG2,48 h后采用
免疫荧光技术检测Wnt/β-catenin通路信号分子β-catenin蛋白表达水平,双荧光素酶检测法检测β-catenin/TCF4复合物的活性,
采用RT-PCR技术检测cyclin D1 与MMP-2 基因转录水平,Western blot 技术检测cyclin D1 与MMP-2 的蛋白表达水平。结果
含鳖甲煎丸药物血清可降低肝癌细胞HepG2细胞核中β-catenin蛋白的表达水平,抑制β-catenin/TCF4复合物的活性,明显下调
cyclin D1、MMP-2的基因转录及其蛋白的表达水平。结论鳖甲煎丸可抑制Wnt/β-catenin信号通路,从而抑制肝癌细胞HepG2
的生长、粘附和转移。
     

参芪益心方抑制阿霉素诱导心肌细胞凋亡作用研究

目的:证实参芪益心方可以抑制阿霉素诱导的心肌细胞凋亡。方法:用SD大鼠制备含药血清,用阿霉素诱导H9c2心肌细胞凋亡建立模型,将细胞设置为空白对照组、模型组、含药血清高剂量组(8%)、含药血清中剂量组(4%)、含药血清低剂量组(2%)和卡托普利组。含药血清提前预处理,阿霉素造模72 h后进行试验检测,倒置显微镜下观察H9c2心肌细胞形态,MTT法检测细胞增殖活性;Annexin V-FITC/PI双染法检测H9c2心肌细胞凋亡。结果:H9c2心肌细胞形态:参芪益心方含药血清高、中、低剂量组及卡托普利组可改善细胞凋亡现象,其中以含药血清高剂量组、卡托普利组改善最为明显。MTT法检测H9c2心肌细胞增殖率:模型组OD值、增殖率与空白对照组比较差异具有统计学意义(P0.01);含药血清高、中、低剂量组及卡托普利组OD值、增殖率与模型组比较差异具有统计学意义(P0.05,P0.01);含药血清高剂量组与卡托普利组OD值比较,差异无统计学意义(P0.05)。流式细胞仪测得结果示:与空白对照组比较,模型组细胞凋亡数量(Q2+Q4)明显增多;含药血清预处理后(Q2+Q4)明显降低,含药血清高、中剂量组及卡托普利组与模型组比较差异具有统计学意义(P0.01)。结论:参芪益心方可以抑制阿霉素诱导的细胞凋亡。     

鳖甲煎丸含药血清对肝癌细胞Bel-7402增殖的影响及其可能机制

【立题依据及设计思路】 原发性肝癌是一种常见恶性肿瘤,探索行之有效的治疗方法,是一个亟待解决的问题。鳖甲煎丸是医圣张仲景所创,研究表明具有较好的抑制肝癌生长,防止肝癌转移的作用,但其机制不明。本实验拟观察鳖甲煎丸含药血清对肝癌Bel-7402细胞生长的影响,从细胞凋亡和肿瘤血管新生角度探讨其抗癌机制,为临床应用此方治疗肝癌提供理论与实验依据。 【实验内容】 (1)大鼠含药血清的制备;(2)MTT法检测不同剂量鳖甲煎丸含药血清对Bel-7402细胞增殖的影响;(3)流式细胞术检测含药血清对Bel-7402细胞凋亡情况;(4)蛋白质印迹法检测Bcl-2、Bax、ERK1、p-ERK、JNK、p-JNK等相关凋亡蛋白含量的变化,探讨其影响MAPK信号通路传导,促进肿瘤细胞凋亡的作用机制;(5)蛋白质印迹法检测肿瘤细胞VEGF、Delta-4、NICD等蛋白表达变化,探讨鳖甲煎丸影响VEGF-D114-Notch信号通路传导,抑制肿瘤血管生成的作用机制。 【材料】 SD大鼠、胎牛血清、中药、5-FU、相关抗体等。 【可行性】 (1)鳖甲煎丸以活血、补益、散结为主,既有攻伐之效,亦含补益之功。课题组前期在体实验证明鳖甲煎丸具有较好的抑瘤功效。血清药理学对于中药复方制剂的复杂化学成分能更好的反映药物在体内环境中产生药理效应的真实过程,在理论上具可行性。(2)课题组成员已掌握相关实验技术。(3)科研中心仪器设备能满足实验所需。 【创新性】 中药在抑制肝癌细胞增殖、控制瘤体生长等方面具有独特的优势。目前对中药抗肿瘤的研究仍以单味药或药物单体成分及临床经验方为主,而中医经典复方对肿瘤相关信号通路影响的研究则相当少见。本课题在前期鳖甲煎丸抑制S180实体瘤研究的基础上,通过体外实验观察其对人肝癌细胞Bel-7402的影响,并运用血清药理学、形态学、流式细胞术、MTT、蛋白质印迹等方法,试图从促进肿瘤细胞凋亡及阻碍瘤体内血管生成两方面,探讨鳖甲煎丸治疗肝癌的可能机制。本研究在思路上,将传统中医药理论与现代医学分子生物学理论相结合,探讨中药复方治疗肝癌机制。为中医经典复方治疗肿瘤提供理论基础。     

温胆汤含药血清对PC12细胞Bax、Bcl-2mRNA表达的影响

目的:探讨温胆汤含药血清对PC12细胞Bax/Bcl-2mRNA表达的影响.方法:(1)含药血清制备:30只SD大鼠随机分为三组:温胆汤高剂量组(A),温胆汤中剂量组(B),温胆汤低剂量组(C).温胆汤灌胃,一天一次,8天后处死大鼠,股动脉取血,离心取血清,灭活无菌过滤备用.(2) PC12细胞分组培养:将PC12细胞分为4组,即:正常对照组(普通培养基培养)、温胆汤高剂量含药血清组、温胆汤中剂量含药血清组、温胆汤低剂量含药血清组,按照相应的分组更换含药血清进行培养16小时后,提取总mRNA,应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法,检测PC12细胞Bax/Bcl-2mRNA的表达量.结果:温胆汤各组Bax mRNA的表达量较对照组有所降低,有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01);而温胆汤高剂量组和温胆汤中剂量组使Bcl-2 mRNA的表达量比对照组有所升高,有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01).结论:温胆汤能够降低PC12细胞Bax mRNA的表达量,并且可升高Bcl-2 mRNA的表达量.     

扶正透毒祛毒复方对髓系MRD-L患者CD34~+细胞源DC诱导过程中IL-2、sIL-2R的影响

【目的】研究扶正透毒祛毒复方(加味青蒿鳖甲汤)中药含药血清对髓系微小残留白血病(minimal residual disease in leukemia,MRD-L)患者CD34+细胞源树突状细胞(DC)诱导培养的不同阶段血清中白细胞介素-2(IL-2)、可溶性白细胞介素-2受体(sIL-2R)的含量变化,探讨扶正透毒祛毒复方影响MRD-L患者CD34+细胞源DC诱导及生物学效应的机制。【方法】将急性髓系白血病缓解期(AML-CR)患者骨髓经Ficoll密度梯度离心获得骨髓单个核细胞(BMNC)后,用免疫磁珠阳性选择法提取CD34+细胞,培养扩增后用不同浓度中药含药血清与细胞因子进行体外培养诱导DC,培养过程中观察细胞的形态,流式细胞仪检测DC表面CD83、CD80、CD86、CD1a、人白细胞DR抗原(HLA-DR)的表达。在培养的第0天、第6天和第9天采用酶联免疫吸附(ELISA)法分别检测、比较各组血清中IL-2、sIL-2R的含量。【结果】(1)各中药含药血清联合细胞因子组能促进CD34+细胞分化为形态特征典型的DC,并高表达CD83、CD80、CD86、HLA-DR等DC的表面标志,与胎牛血清及空白兔血清组比较差异有统计学意义(P0.01),中药中剂量及低剂量含药血清组能促进CD1a的表达提高,与中药高剂量组、细胞因子组比较差异有统计学意义(P0.01)。(2)IL-2含量:含药血清制成后(第0天),各中药含药血清组均高于空白兔血清组;各中药含药血清联合细胞因子组第9天、第6天均高于第0天,中药中剂量联合细胞因子组第9天显著高于第6天(P0.01),中药高剂量联合细胞因子组第9天高于第6天(P0.05);在同一时间内,各中药含药血清联合细胞因子组均高于空白兔血清组。(3)sIL-2R含量:含药血清制成后(第0天),各中药含药血清组均低于空白兔血清组;各中药含药血清联合细胞因子组第9天均显著低于第0天、第6天(P0.01),中药高剂量联合细胞因子组第6天低于第0天(P0.05),其余各组第6天与第0天比较差异无统计学意义(P0.05);在同一时间内,各中药含药血清联合细胞因子组均低于空白兔血清组(P0.05或P0.01)。【结论】扶正透毒祛毒复方能增加血清IL-2的含量和降低sIL-2R的水平,随着DC的不断成熟,其含量变化更加明显,可能对CD34+细胞向DC转化发挥了积极作用。     

鳖甲煎丸药物血清对PDGF诱导大鼠肝星状细胞增殖及迁移的影响

[目的]研究鳖甲煎丸药物血清对PDGF诱导的肝星状细胞(HSC)增殖和迁移的影响,探讨其抗肝纤维化的作用机制。[方法]通过大鼠整体给药,制备浓度分别为1.5 g·kg-1、3 g·kg-1、6 g·kg-1的鳖甲煎丸药物血清,分别处理大鼠肝星状细胞HSC-T6和由PDGF-BB干预的HSC-T6,MTT法观察细胞体外增殖情况,采用Transwell小室检测细胞迁移。[结果]MTT检测结果显示,浓度分别为1.5 g·kg-1、3 g·kg-1、6 g·kg-1的鳖甲煎丸药物血清在不同血清百分比(5%、10%、20%)对HSC细胞体外增殖均有显著的抑制作用(P0.05,P0.01),在不同血清百分比(10%、15%、20%)对10 ng·m L-1PDGF干预24 h的HSC细胞增殖有显著的抑制作用(P0.05,P0.01),未呈现浓度依赖关系;Transwell小室实验结果显示,10%各剂量药物血清对10 ng·m L-1 PDGF诱导的HSC细胞迁移有显著的抑制作用(P0.05)。[结论]鳖甲煎丸药物血清对HSC-T6细胞体外增殖及PDGF诱导的HSC增殖、迁移均有显著的抑制作用,推测鳖甲煎丸可能通过抑制肝星状细胞增殖和迁移发挥抗肝纤维化作用。