mBD1-mBD3融合基因真核表达载体构建及体外抗流感病毒初步研究

目的构建小鼠β防御素1和β-防御素3（mBD1,mBD3）融合基因的真核表达载体,研究mBD1-mBD3融合蛋白的抗流感病毒作用。方法通过RT-PCR和重建PCR方法构建mBD1-mBD3融合基因;经EcoRI和Xho工双酶切后插入相同酶切的pcDNA3．1（＋）,构建成重组质粒pcDNA3．1（＋）／mBD1-mBD3,对重组质粒进行PCR、酶切和测序鉴定;将构建好的真核表达载体转染MDCK细胞,G418筛选稳定表达株,RT—PCR和免疫荧光染色法鉴定胞内mBDl-mBD3的表达。用流感病毒感染稳定表达细胞株,TCID50测定并分析抗流感病毒作用。结果成功克隆到mBD1-mBD3基因,并构建了真核表达载体pcDNA3．1（＋）／mBD1—mBD3。RT—PCR和间接免疫荧光证实重组质粒可以在细胞内表达。实验组的TCID50显著高于对照组,初步显示出mBD1-mBD3的抗流感病毒作用。结论本研究成功构建了pcDNA3．1（＋）／mBD1-mBD3真核表达载体,且能在MDCK细胞中稳定表达,表达产物具有-定的抗流感病毒作用。为进-步深入研究mBDI-mBD3的生物学特性及其抗流感病毒作用机制奠定了基础。     

Rap2c基因真核表达质粒的构建与表达

目的：为了探讨Rap2c基因与肺癌发生的关系,克隆人Ras家族小G蛋白Rap2c的cDNA,构建其真核表达质粒并在人肺癌细胞株A549和H1299中表达。方法人骨肉瘤细胞株U2OS提取细胞总RNA,经逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）逆转录成cDNA,PCR扩增Rap2c,酶切后插入pcDNA3．1（＋）构建真核表达质粒 pcD-NA3．1（＋）-Rap2c,采用酶切及测序鉴定。重组质粒转染A 549和H 1299细胞,Western blot 检测其目的基因表达。结果双酶切及测序结果显示重组质粒pcDNA3．1（＋）-Rap2c成功构建,Werstern blot 检测到 A549和H 1299细胞有相应蛋白表达。结论成功构建人Rap2c基因真核表达质粒,为后续研究奠定了基础。     

HPV16 E5蛋白原核表达、鉴定及真核表达稳定株的筛选

目的研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其细胞转化机制,对HPV16 E5蛋白原核和真核表达质粒进行构建、表达和鉴定。方法以临床确诊的HPVl6感染患者子宫颈细胞DNA为模板,采用PCR方法扩增HPV16 E5基因,经BamHⅠ和HindIⅡ双酶切后插入相同酶切的pET32a（＋）载体,转染JMl09感受态细胞,并进行阳性克隆筛选。经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS-PAGE和Wlescem blotting检测目标蛋白表达情况。将BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pET32（＋）,E5质粒后取得的E5全基因片段转入pcDNA3．1（＋）空质粒,构建pcDNA3．1（＋）m5真核表达质粒并对NIH3T3细胞进行转染,最后用G418进行稳定表达株的筛选,并采用RT．PCR鉴定细胞内HPV16 E5基因表达情况。结果成功构建了原核表达质粒pET32/E5,在1mmol／LPTG、28℃诱导条件下BL21（DE3）菌体中HPVl6E5．TRX融合蛋白占菌体总蛋白的10％左右。真核表达质粒pcDNA3．1（＋）／E5在成功转染NIH3T3细胞后于250μg/mlG418浓度时筛选21d得到了E5基因稳定表达株,RT-PCR产物测序得到了HPV16 E5基因全序列。结论成功构建了pET32／E5原核和pcDNA3．1（＋）／E5真核表达质粒,HPV16 E5蛋白在大肠杆菌和NIH3T3细胞中的稳定表达．这些结果为进一步深入研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用奠定了坚实基础。     

人乳头瘤病毒16型E2蛋白真核载体的构建与表达

目的构建人乳头瘤病毒16型（HPV16）E2蛋白真核载体,为研究其基因疫苗免疫活性奠定实验基础。方法 PCR扩增HPV16 E2基因片段,将其连接到真核表达载体pcDNA3.1（＋）,双酶切及测序鉴定。将质粒pcDNA3.1（＋）与pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2分别转染HeLa细胞,RT-PCR鉴定E2基因在HeLa细胞中的表达。结果 HPV16 E2基因片段插入到pcDNA3.1（＋）相同酶切位点,即构建了真核表达载体pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2;转染pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2的细胞,检测到HPV16 E2 mRNA。结论构建的真核表达载体pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2能在HeLa细胞内有效表达。     

小鼠β防御素2、3融合基因载体构建及其抗流感病毒作用

目的构建mBD2与mBD3融合基因的真核表达载体,检测其在MDCK细胞中的表达情况,并探讨其抗病毒特性。方法利用PCR方法分别扩增mBD2与mBD3基因片段,通过重叠延伸PCR技术（SOE—PCR）将mBD2与mBD3通过一段多肽接头Gly4Ser连接为融合基因mBD2与mBD3。将该融合基因插入真核表达载体pcDNA3．1（＋）获得重组质粒pcDNA3．1（＋）／mBD2-mBD3,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,用脂质体转染MDCK细胞,通过免疫荧光检测融合蛋白表达情况,最后采用CCID50测定并分析抗流感病毒作用。结果经鉴定后证实,构建真核表达质粒pcDNA3．1（＋）／mBD2-mBD3正确,该重组质粒能在MDCK细胞中稳定表达,CCID50实验结果说明有较好的抗流感活性。结论本研究成功构建mBD2-mBD3融合基因的真核表达质粒,并证实其融合蛋白能在MDCK细胞中稳定表达,该结果为进一步研究防御素抗病毒机制奠定了坚实的基础。     

人CD40分子基因转染人脐静脉内皮细胞ECV-304

目的 构建人CD40的真核表达载体，建立持续、稳定高表达CD40的人脐静脉内皮细胞ECV-304。方法 将含有CD40的克隆载体pUCD40酶切后，再克隆到真核表达载体pCDNA3．1中，构建重组质粒pCDNA3．1（＋）／CD40，并对重组质粒进行酶切鉴定。然后用脂质体法将重组质粒转染ECV-304，G418筛选转染的细胞。RT-PCR、Western-blotting和流式细胞仪定性定量检测转染后的ECV-304的CD40的表达情况。结果 经酶切鉴定，重组体中已插入目的基因片段CD40。RT-PCR和Western-blotting证实，重组质粒转染的ECV-304中有CD40基因的表达，流式细胞仪检测转染后的ECV-304的CD40的表达率为95％。结论 成功构建了真核表达载体pCDNA3．1（＋）／CD40．并建立了高表达CD40的ECV-304，为筛选抗动脉粥样硬化药物奠定了基础.     

人EPO基因真核表达载体的构建及其在人脐血间充质干细胞中的表达

目的: 构建人EPO基因真核表达载体并转染人脐血间充质干细胞,获得稳定表达人EPO的人脐血间充质干细胞.方法: 从人胎肝细胞中提取总RNA,经过RTPCR方法扩增人EPO全长cDNA,应用基因重组技术将EPO cDNA基因亚克隆至pcDNA3真核表达载体内,以酶切和测序方法鉴定重组质粒pcDNA3-EPO构建的正确性,再将pcDNA3-EPO经脂质体介导转染人脐血间充质干细胞,经G418筛选后获得稳定转染EPO基因的人脐血间充质干细胞,用RT-PCR,Western Blot和细胞免疫化学方法鉴定外源人EPO基因在人脐血间充质干细胞中的表达.结果: 酶切和测序结果均证实pcDNA3-EPO构建正确,RT-PCR,Western blot和细胞免疫化学结果显示转染人EPO基因的人脐血间充质干细胞体外能表达EPO.结论: 构建成功人EPO基因真核表达载体,转染人脐血间充质干细胞后在体外可获得稳定表达.     

携带FLAG标签的人BTG2真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达 

目的：构建人B细胞易位基因2（BTG2）真核表达载体,并在HeLa细胞中表达携带FLAG标签的BTG2蛋白,为阐明BTG2基因的功能提供实验工具。方法：利用PCR法获得全长BTG2片段,将扩增得到的片段插入真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆位点;然后按照FLAG序列设计并合成寡核苷酸片段,插入pcDNA3.1(+)-BTG2载体,构建pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2载体;将以上重组质粒转染HeLa细胞,将细胞分为转染pcDNA3.1(+)空载体组、转染pcDNA3.1(+)-BTG2组和转染pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2组,采用抗FLAG抗体的Western blotting法,检测FLAG-BTG2融合蛋白在HeLa细胞中的表达水平。结果：将全长BTG2片段链接于pcDNA3.1(+)质粒,经限制性核酸内切酶BamH Ⅰ酶切分析及DNA测序证实载体序列准确;该载体转染HeLa细胞后用抗FLAG 抗体进行Western blotting法检测,在空载体组和pcDNA3.1(+)-BTG2组HeLa细胞中检测不到FLAG融合蛋白的表达,而在转染pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2组中检测到FLAG-BTG2融合蛋白的表达。结论：成功构建了pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2真核表达载体,并能在HeLa细胞中有效表达携带FLAG标签的BTG2蛋白。     

HNF4α真核表达载体的构建及其在人脐带间充质干细胞中的表达

目的:构建pcDNA3.1/HNF4α重组质粒,转染人脐带间充质干细胞 (human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUMSCs),并检测其在HUMSCs中的表达?方法:采用基因重组技术构建载体pcDNA3.1/HNF4α,经酶切和DNA测序鉴定,通过脂质体法转染HUMSCs后,进行RT-PCR和Western blot分析,免疫荧光检测转染后1周肝特异性生化指标?结果:成功构建真核表达质粒pcDNA3.1/HNF4α,转染人脐带间充质干细胞后,RT-PCR示转染后HNF4α mRNA表达,Western blot分析见HNF4α蛋白表达,免疫荧光示转染1周后HNF4α促进了HUMSCs向肝细胞方向分化?结论:成功构建真核表达载体,并在HUMSCs中正确表达,为进一步研究HNF4α在干细胞向肝细胞分化中作用提供了实验基础?     

Granulysin真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建颗粒溶解素(granulysin)cDNA真核表达载体。方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC)中扩增出颗粒溶解素蛋白cDNA,经限制性核酸内切酶消化后,插入真核表达载体pcDNA3.1(-)的相应酶切位点,将此重组质粒进行序列测定,并将重组质粒转染COS7细胞,进行基因表达鉴定。结果:重组质粒插入基因序列测定证实为颗粒溶解素cDNA,并能在COS7细胞稳定表达。结论:成功构建颗粒溶解素真核表达载体,为进一步研究其抗结核作用奠定了基础。     

人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立

目的 构建人MCHR2真核表达载体,转染CHO细胞,建立稳定转染的CHO细胞系.方法 采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染CHO细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的CHO细胞系,用RT-PCR、Western blot及免疫荧光法检测MCHR2的表达.结果 成功构建了pcDNA3.1( )/MCHR2真核表达载体,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达目的基因.结论 真核表达载体成功构建和稳定转染CHO细胞系的建立为进一步研究MCHR2的功能奠定良好的实验基础.     

多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2真核表达载体的构建及在SHG-44细胞的表达

目的：为探讨O-糖基化在肿瘤发生发展及转移中的作用和功能，构建pcDNA3／ppGalNAc-T2真核表达质粒并转染人神经胶质瘤细胞SHG-44。方法：采用PCR技术从pDONR201-T2得到ppGalNAc—T2全长编码序列，亚克隆至真核表达载体pcDNA-3．1，脂质体介导基因转染人神经胶质瘤细胞SHG-44细胞，采用RT—PCR法检测重组质粒的表达。结果：酶切图谱分析和基因测序证实pcDNA3．1-T2真核表达质粒构建成功。RT-PCR显示转染细胞有12的表达。结论：成功构建了真核表达载体pcDNA3．1-T2，并成功转染入SHG-44细胞，为进一步研究ppGalNAcT2的功能奠定了基础。     

表达载体sHLA-A2-IgG1-Fc的构建与鉴定

目的构建表达载体pcDNA3.0-sHLA-A2-IgGl-Fc,为进一步真核表达可溶性HLA-A2-IgG1-Fc蛋白奠定基础。方法从T2细胞中提取总RNA,借助RT-PCR技术扩增包括信号肽的可溶性HLA-A2的cDNA序列并把其插入真核表达载体pcDNA3.0,然后经酶切和测序法鉴定;用PCR的方法从含IgG1-Fc基因的PIG质粒中扩增目的基因IgG1-Fc段,然后经酶切后插入前面构建好的表达载体pcDNA3.0-sHLA-A2中,最后经酶切和测序法鉴定。结果经酶切鉴定及测序分析,证实已将目的基因HLA-A2和IgG1-Fc片段插入载体pcDNA3.0。结论本研究成功构建表达载体pcDNA3.0-sHLA-A2-IgG1-Fc。     

小鼠cyclin A2正义和反义真核表达载体的构建及鉴定

目的构建小鼠cyclin A2的正义和反义真核表达载体。方法采用小鼠胚胎组织取材,提取总RNA。设计引物,采用RT-PCR方法扩增小鼠cyclin A2 mRNA得到cyclin A2的DNA,将此DNA插入pGEM-T载体,转化入JM109感受态细菌。将鉴定得到的重组质粒进行扩增,EcoRⅠ酶切后,回收cyclin A2目的片段亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体。酶切筛选鉴定重组的真核表达载体pcDNA3.1-cyclin A2。结果将小鼠基因的开放阅读框(ORF)重组到真核表达载体pcDNA3.1内,用EcoRⅠ酶切重组质粒后可得到一接近1660 bp的DNA条带,核酸测序证实和GenBank所公布序列相符。HindⅢ酶切鉴定重组质粒后,证明分别为正向和反向插入载体的质粒。DNA测序证明构建的真核表达载体pcDNA3.1-cyclin A2的序列是正确的。结论成功构建了小鼠cyclin A2的正义和反义真核表达载体。     

THY1基因对上皮性卵巢癌细胞SKOV3生长的抑制作用

目的 构建THY1真核表达质粒,并探讨THY1基因对上皮性卵巢癌细胞系SKOV3生长的影响.方法 通过RT-PCR方法,从人正常卵巢组织中获得THY1基因,将其插入真核表达质粒pcDNA3.1( )中,构建成重组质粒pcDNA3.1( )-THY1,并转入大肠杆菌JM109,筛选出含有正确插入片段的克隆,经PCR、酶切及DNA测序鉴定;脂质体介导法转染SKOV3细胞并筛选稳定表达(SKOV3-THY1组),同时设空质粒转染组(SKOV3-Null组)和空白对照组(SKOV3组),RT-PCR和Western blotting鉴定重组质粒的表达情况;MTT法和流式细胞术检测THy1对SKOV3细胞生长和凋亡等生物学行为的影响.结果 经过PCR、酶切及DNA测序证实,外源性THY1基因正确插入到真核表达质粒pcD-NA3.1( )中,RT-PCR和western blotting证实此重组质粒已整合于SKOV3细胞并获稳定表达;MTT法结果提示SKOV3-THYl组的细胞抑制率(第5天的细胞抑制率为56.6%)明显高于SKOV3-Null组(12.5%)(P＜0.05);流式细胞术检测结果显示,SKOV3-THY1组凋亡率(31.8%)明显高于SKOV3-Null组(10.5%)和SKOv3组(9.8%),差异有统计学意义(P＜0.05),SKOV3-Null组和SKOV3组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 成功构建了THY1真核表达质粒pcDNA3.1( )-THY1,该质粒转染SKOv3细胞可抑制其生长,THY1基因可能在上皮性卵巢癌发生、发展的过程中起重要作用.     

人胰岛素样生长因子-1真核表达载体的构建及在神经干细胞中的表达

目的:构建人胰岛素样生长因子-1(IGF-1)真核表达载体,并在人脐血神经干细胞(NSCs)中表达。方法:采用RT-PCR法从人胎肝中克隆IGF-1基因,将其导入真核表达载体pcDNA3.1中,用脂质体转染法将重组质粒转染人脐血NSCs。分别采用RT-PCR和免疫荧光细胞化学法检测转基因NSCs中IGF-1mRNA和蛋白的表达。结果:琼脂糖电泳显示RT-PCR扩增出462bp的条带;重组载体pcDNA3.1-IGF-1经HindⅢ与BamHⅠ双酶切后,得到5428bp和462bp的两个条带;目的基因转染的NSCs经RT-PCR扩增出一条与目的基因一致的条带;免疫荧光细胞化学检测到IGF-1蛋白的表达。结论:成功构建了人IGF-1基因的真核表达载体,转染后IGF-1重组蛋白在人脐血NSCs中能成功表达。     

人真核表达质粒载体pcDNA3.1-hOPG的构建及体外表达

目的 构建表达人骨保护素基因（hOPG）的真核表达质粒pcDNA3．1-hOPG,并检测其在体外的表达,为治疗破骨细胞功能异常引起的骨吸收提供实验基础。方法 从MGC：29565上获得hOPG基因片段并用PCR方法扩增,将其连接于真核表达质粒pcDNA3．1（-）,测定序列后,用脂质体包裹转染C2C12细胞,采用免疫组化和骨吸收抑制实验检测OPG的表达及功能。结果 经酶切和测序鉴定证实本实验构建的重组表达质粒正确,该质粒在体外转染C2C12细胞后可表达功能性OPG蛋白。结论成功构建的pcDNA3．1-hOPG重组质粒能在体外表达OPG蛋白。     

人乳头瘤病毒16型E5蛋白真核载体的构建及表达

目的构建人乳头瘤病毒115型（HPV16）E5蛋白真核表达载体pcDNA3．1（＋）／HPV16E5,分析E5在HeLa细胞及BALB／c小鼠肌肉组织中的表达。方法设计HPV16E5基因引物,PCR扩增E5基因。经Bam-HI、EcoR1酶切后将其连接入pcDNA3．1（＋）,PCR及双酶切筛选阳性克隆并测序。将构建的pcDNA3．1（＋）／HPV16E5转染HeLa细胞,利用RT—PCR测定HPV16E5mRNA表达。将6只BALB／c小鼠分为3组,分别取100mgpcDNA3．1（＋）／HPV16E5、100mgpcDNA3．1（＋）、100mLPBS经肌肉注射小鼠,2周1次,共4次;末次接种后第14天取小鼠股四头肌制成石蜡切片,免疫组织化学法检测E5蛋白在小鼠肌肉组织中的表达。结果PCR扩增得到252bpHPV16E5基因片段,DNA测序结果显示E5基因片段正确地连入pcDNA3．1（＋）。构建的pcDNA3．1（＋）／HPV16E5在HeLa细胞表达大小为252bp的HPV16E5mRNA。小鼠股四头肌细胞膜被染成棕黄色。结论构建的真核表达载体pcDNA3．1（＋）／HPV16E5能在HeLa细胞及小鼠肌肉组织中表达HPV16E5蛋白。