胎鼠表皮干细胞的体外分离培养及rAAV2/eGFP转染的研究

目的 对表皮干细胞(ESCs)进行分离培养和鉴定,利用携带绿色荧光蛋白(eGFP)基因的重组腺相关病毒(rAAV)转染表皮干细胞,探索不同滴度rAAV2/eGFP的转染效率.方法 1.获取胎鼠表皮单细胞悬液.2.利用层黏连蛋白(laminin)和Ⅳ型胶原(Collagen Ⅳ)筛选ESCs,在体外进行培养和鉴定.3.将ESCs按5×104个/孔接种入24孔培养板中,按照不同的病毒基因数与转染细胞数之比(MOI)加入所需rAAV2/eGFP病毒,计数绿色荧光细胞数目,并计算转染效率. 结果 1.ESCs对Laminin和Collagen Ⅳ的吸附性很好,克隆形成率较高.2.对ESCs进行β1整合素(Integrinβ1)单抗、角蛋白19(Keration 19,K19)单抗的免疫细胞化学染色,均呈阳性表达.3.利用rAAV1eGFP病毒体外转染ESCs,可稳定表达eGFP.结论 用Laminin和Collagen Ⅳ快速黏附法可从胎鼠皮肤分离和富集ESCs.     

ES细胞源性表皮干细胞与类真皮构建组织工程皮肤的体内分化

目的以ES细胞源性表皮干细胞为种子细胞与类真皮构建组织工程皮肤,探讨其在体内的分化。方法胎鼠皮肤成纤维细胞和大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs),分别与复合凝胶-明胶海绵构建类真皮(类真皮Ⅰ、Ⅱ),植入小鼠全层皮肤缺损创面,以生物膜为载体,把羊膜诱导后带有核标记的表皮干细胞覆盖在类真皮上,术后1～8周连续取材,苏木精-伊红染色,β1整合素、CK15、CK19、CK10和CEA免疫荧光双标和免疫组化观察。结果两组组织工程皮肤植入皮肤缺损3～4周后,创面完全长合,较厚新生皮完全覆盖创面,基底层细胞增生,形成短的细胞柱突向真皮层。新生表皮中可见核标记的细胞呈β1整合素、CK15、CK19阳性,真皮中的管腔样结构呈核荧光和CEA免疫组化双标阳性,4～8周新生表皮基底层细胞呈CK19、CK10阳性,新生表皮下可见毛囊样、皮脂腺样结构。结论ES细胞源性表皮干细胞为种子细胞与类真皮构建的两种组织工程皮肤在体内具有修复缺损皮肤及分化为表皮及毛囊样、皮脂腺样和汗腺样等皮肤附属结构的潜能。     

胚胎组织提取液影响表皮干细胞表型变化的初步研究

目的： 模拟表皮干细胞周围生态微环境,研究表皮干细胞在此环境中的表型变化,表皮干细胞微环境在表皮干细胞"命运"决定过程中的作用。方法:分离、培养表皮干细胞,观察其形态,并进行免疫组织化学鉴定及免疫荧光检测。制备小鼠胚胎组织匀浆液,荧光活细胞示踪法和逆转录聚合酶链式反应检测胚胎组织提取液对表皮干细胞表型变化的影响。结果: 原代分离培养的表皮基底层干细胞表达α6、β1整合素、K19、K14、p63、Nestin、PCNA为阳性,而K10不表达。激光共聚焦检测显示α6整合素和CD71在表皮干细胞中的分布存在着区域性差异。此外,流式细胞检测显示胚胎组织提取液作用后α+6CD71-表达细胞由细胞总数的22.49%减少至10.92%,而α+6CD71+、α-6CD71+表达细胞则分别由诱导前的62.29%及0.19%增加至诱导后的68. 34%及4.51%。RT-PCR结果表明胚胎组织提取液作用后,表皮干细胞中β1整合素、K19、K10表达增强,而K14表达减弱。结论: Ⅳ型胶原黏附法分离的表皮干细胞具有干细胞的特点。α6整合素、CD71在表皮干细胞中分布的区域差异及CD71表达位点的空间变化可以作为区分表皮干细胞及其子代细胞标志之一。胚胎组织提取液对表皮干细胞的增殖分化具有促进作用。胚胎组织提取液中的某些因子可能抑制了K14表达的TA细胞的终末分化,甚至诱导其发生逆向分化,导致诱导后K14的总体表达水平下调。     

毛囊干细胞的分离及培养方法研究

目的建立一种分离效率高、创伤小的毛囊干细胞分离方法，筛选毛囊干细胞体外培养的最优条件，考察毛囊干细胞的体外增殖活性。方法获取兔胡须部皮肤全层，比较2种不同分离方法获得细胞的贴壁、增殖及克隆形成情况。通过免疫组化的方法检测毛囊干细胞β1整合素、CK19表达情况。选用MTT法和乳酸脱氢酶来间接反映毛囊干细胞的增殖能力。分析细胞周期考察细胞增殖过程中各期细胞的分布。观察血清浓度梯度条件培养液对毛囊干细胞增殖的影响。结果“两步酶”法的分离能获得大量细胞且细胞迅速贴壁，克隆迅速形成。获取的毛囊干细胞胞浆中有β1整合素、CK19的阳性表达。毛囊干细胞生长曲线及细胞周期都表明毛囊干细胞有高增殖能力。毛囊干细胞增殖表现出血清浓度的依赖。结论“两步酶”法是一种分离效率高、创伤小的方法，能够获取大量高表达β1整合素、CK19的毛囊干细胞。毛囊干细胞在适当条件下表现为高增殖能力，其生长有一定的血清依赖性。     

猴表皮干细胞的分离和培养

目的： 探索猴表皮干细胞分离纯化和培养方法。 方法: 将猴皮肤标本剪成皮条,加入0.25％胰酶浸泡过夜；然后去除角质层，刮上皮面获取表皮细胞进行培养。取第2-4代的细胞,经消化后，用Ⅳ型胶原黏附法获得为快吸附的表皮细胞。对快吸附的表皮细胞行流式细胞仪、免疫组化和RT-PCR检测。 结果: 快吸附细胞从mRNA转录水平及蛋白表达水平均呈现表皮干细胞的特性：β1整合素、K15和α6整合素阳性，而CD71和K1/K10阴性。 结论: 所采用的分离纯化方法和培养条件适合猴表皮干细胞的分离纯化及生长。     

成人毛囊干细胞分选及β-连环蛋白表达的研究

目的寻找一种快速简便的分离毛囊干细胞的方法,探讨β-连环蛋白（β-catenin）信号分子在毛囊干细胞增殖分化中的调节作用.方法利用毛囊干细胞黏附性强的特点,通过将毛囊细胞悬液黏附于包被有人胶原的平板而使富集毛囊干细胞分离.利用毛囊干细胞标志物Keratin 19（K19）及体外集落形成能力进行鉴定.采用免疫细胞化学及原位杂交技术检测分选后的毛囊干细胞β-catenin的表达情况.结果毛囊干细胞悬液黏附于人胶原20 min后,K19的表达增加1.6倍,集落形成能力增加3.5倍.β-catenin在细胞核中的蛋白表达增加. 结论快速黏附法可以使富集毛囊干细胞分离,β-eatenin参与了毛囊干细胞的增殖及分化调控.     

体外培养表皮干细胞复合高分子支架原位修复深度烧伤创面的研究

目的探讨表皮干细胞联合成纤维细胞-丝素蛋白纳米纤维活性支架体内培养,对Ⅲ度烧伤创面的修复和再生作用。方法（1）表皮干细胞的培养和表征：采用快速贴壁法分离和培养表皮干细胞（Epidermal Stem Cell,ESC）。将表皮干细胞分别在经Ⅳ型胶原蛋白修饰的和未经修饰的培养瓶中,或通过悬浮法培养,研究表皮干细胞的生长特性;以β1整合素和细胞角蛋白CK19免疫荧光染色实验考察细胞表型。（2）活性支架的体外构建和对大鼠Ⅲ度创面的修复作用研究：体外构建成纤维细胞-丝素蛋白纳米纤维活性支架;采取同体对照法,在20只Sprague—Dawley大鼠（sD大鼠）背部制作两个Ⅲ度切痂创面。左侧创面采用体外培养的自体表皮干细胞联合成纤维细胞一丝素蛋白纳米纤维活性支架移植入创面,作为组织工程移植物组;右侧创面采用凡士林纱布敷料覆盖,作为凡士林纱布敷料组。考察组织工程移植物对大鼠Ⅲ度创面的愈合作用。结果以快速贴壁法能够有效地分离得到表皮干细胞,细胞在经Ⅳ型胶原蛋白修饰的培养瓶中生长10d后融合,数目达到5．1×10^5／cm^2。免疫荧光实验表明细胞表面抗原呈β1整合素和角蛋白免疫CK19成阳性,证明分离得到的细胞为表皮干细胞。成纤维细胞能够在丝素蛋白纳米纤维中扩增并分泌细胞外基质,14d后与丝素蛋白纳米纤维形成活性支架。对大鼠Ⅲ度烧伤创面的修复实验表明,组织工程移植物组的创面在第14天和第22天的平均愈合效率为66％和93％,高于凡士林纱布敷料组（32％和69％）,P〈0．05。组织工程移植物组的创面平均愈合天数为21d,低于凡士林纱布敷料组（31d）,P〈0．05。结论通过Ⅳ型胶原蛋白黏附法,能够分离得到表皮干细胞,并且其在Ⅳ型胶原蛋白表面修饰的培养瓶中的生长活力较高。大鼠Ⅲ度创面的修复实验表明,组织工程移植物,即表皮干细胞联合成纤维细胞-丝素蛋白纳米纤维支架,能够修复Ⅲ度创面,再生皮肤表真皮结构完整;并且与凡士林纱布敷料相比,能够提高创面的愈合效率,减少创面的愈合时间。     

胚胎成纤维细胞和Ⅳ型胶原黏附分选表皮干细胞的比较研究

目的比较以Ⅳ型胶原和胚胎成纤维细胞黏附分选表皮干细胞的效率，探索从皮肤中快速表皮干细胞分选的有效方法。方法使用DispaseⅡ和CollagenaseⅠ混合酶、胰酶分步消化皮肤得到的细胞悬液，实验组用胚胎成纤维细胞，对照组使用Ⅳ型胶原，分别作为黏附基质，在细胞培养板中对表皮干细胞进行黏附筛选，培养5d后统计各组表皮干细胞克隆形成数量，评价筛选效率。结果经抗β-整合素单抗和抗角蛋白K19单抗免疫细胞染色确证形成克隆的细胞是表皮干细胞，在两个细胞密度水平，实验组和对照组培养出的表皮干细胞克隆数量差异无统计学意义（P〉0．05）。结论使用成纤维细胞分选表皮干细胞与使用Ⅳ型胶原方法分选效率相当，成纤维细胞条件培养液对黏附效率没有影响，但能促进表皮干细胞生长。     

胚胎干细胞源性表皮干细胞对小鼠全层皮肤缺损的修复

目的 研究129小鼠胚胎干细胞(ES cell)源性表皮干细胞在同种小鼠全层皮肤缺损的生长和分化,探讨Es细胞源性表皮干细胞对全层皮肤缺损的修复作用.方法 以生物膜为载体,将羊膜诱导后带有核荧光标记的ES细胞源性表皮干细胞直接覆盖小鼠全层皮肤缺损创面.术后1～8周连续取材,HE染色,β1整合素、CK15、CK19、CK10、CEA免疫组织化学和荧光双标显色.结果 术后2周,创面完全长合,较厚的新生皮覆盖创面,基底层细胞增生,形成许多大小不一的细胞柱伸向真皮层,真皮层中可见管腔样结构,免疫荧光双标显示,1～3周新生表皮中可见核标记的细胞呈β1整合素、CK15阳性,真皮层中带有核标记的管状或泡状结构呈β1整合素、CK15阳性;4周后新生表皮开始变薄,基底层细胞呈CK19、CK10阳性,汗腺样结构呈CEA阳性,6～8周新生表皮下可见毛囊样、汗腺样、皮脂腺样等结构.结论 ES细胞源性表皮于细胞植入小鼠全层皮肤缺损创面,可修复缺损的表皮,并在其下真皮层内具有分化为汗腺样、毛囊样和皮脂腺样结构的潜能.     

Marjolin's溃疡鳞状细胞癌组织中K19、β1整合素的表达

目的检测Marjolin's溃疡鳞状细胞癌中K19、β1整合素的表达情况,探讨Marjolin's溃疡鳞状细胞癌发生与皮肤干细胞的关系。方法选取10例Marjolin's溃疡鳞状细胞癌组织标本、10例皮肤慢性溃疡伴假上皮瘤样增生组织标本、10例原发性皮肤鳞状细胞癌标本、5例正常皮肤组织标本,采用免疫组织化学染色分析皮肤干细胞标记物K19、β1整合素的表达。结果 Marjolin's溃疡鳞状细胞癌组织中,部分癌细胞K19、β1整合素阳性表达,K19为胞浆染色阳性,β1整合素为胞浆、胞膜染色阳性;皮肤慢性溃疡伴假上皮瘤样增生组织在不典型增生部位部分细胞有K19、β1整合素阳性表达;原发性皮肤鳞状细胞癌组织中无K19、β1整合素的表达;K19、β1整合素在正常皮肤毛囊的隆突部位以及基底层仅有少量细胞呈阳性表达。结论皮肤慢性溃疡可以癌变成Marjolin's溃疡鳞状细胞癌,癌变的种子细胞可能来源于溃疡局部的皮肤干细胞。     

胎肝源性细胞促进人骨髓间充质干细胞向肝细胞的定向分化

目的:探讨人胎肝源性细胞(HFLC)对骨髓间充质干细胞(MSCs)体外诱导分化为肝系细胞的效应和机制.方法:药物流产的胎肝源性细胞和Hoechst33342标记的人MSCs,按培养方式不同,分为HFLC和MSCs直接接触共培养组及transwell共培养组,用倒置显微镜观察细胞形态,在不同时段用免疫细胞荧光法检测肝系细胞标志如AFP、 CK-18和CK-19并进行糖原染色.结果:在直接接触共培养组,免疫细胞荧光法显示分化细胞表达AFP、 CK-18和CK-19,并随分化时间延长表达量增加;同时,分化细胞具有贮存糖原功能,PAS染色显示分化细胞糖原染色阳性.而在transwell共培养组,分化细胞未检测到肝系细胞标志物的表达及糖原的贮存.结论:HFLC与MSCs的直接接触共培养体系的微环境,有利于MSCs定向分化为肝系细胞.     

小鼠胎肝间质干细胞的纯化与分化多能性研究

目的： 分离纯化小鼠胎肝间质干细胞（flMSCs）并探讨其分化潜能。方法： 通过改良贴壁法分离BABL/c小鼠胎肝间质干细胞；流式细胞术测定细胞周期和表型；体外诱导贴壁细胞向脂肪、软骨、骨组织以及神经细胞分化；化学染色、RT-PCR和免疫细胞化学染色鉴定分化。结果： 改进贴壁法分离的flMSCs呈均一梭形，(83.76±2.88)%处于G₀/G₁期,表达CD44、CD29,不表达造血细胞表面标志CD45、CD11b,诱导后能向脂肪、软骨、骨以及神经方向分化。结论： 贴壁法可以分离纯化小鼠flMSCs，小鼠flMSCs具有较强的分化潜能和“可塑性”，可用于干细胞治疗疾病的进一步研究。     

龟板有效成分抗紫外线损伤所致的胎鼠表皮干细胞的凋亡

目的确定紫外线损伤所致的胎鼠表皮干细胞凋亡模型,筛选抗凋亡的龟板有效成分,为进一步应用开发打下基础。方法分离培养胎鼠表皮干细胞,用流式细胞仪检测CK19和Integrin β1双标阳性细胞鉴定纯度。用紫外线直接照射细胞造成损伤模型,用龟板各成分对照培养,用流式细胞仪检测FITC-Annexin V和碘化丙锭(PI)双标,根据细胞凋亡率确定紫外线损伤模型和筛选具有抗凋亡作用的龟板有效成分。结果①第3代胎鼠表皮干细胞已达到96.57%以上纯度;②紫外线照射量为100mJ/cm2损伤15min再培养20h可获得稳定的损伤模型,总凋亡率为41.06%;③龟板有效成分2B、S6、S8、S9均有抗凋亡作用。结论龟板有效成分S8具有较好的抗紫外线损伤所致的胎鼠表皮干细胞凋亡作用,应进一步探讨其机制。     

ES细胞源性表皮干细胞在皮肤缺损创面的分化

目的探讨ES细胞源性表皮干细胞移植入小鼠全层皮肤缺损后对创面的修复作用,为组织工程皮肤的研究提供新的思路。方法将羊膜诱导后的带有核荧光标记的ES细胞源性表皮干细胞以生物膜为载体,覆盖小鼠全层皮肤缺损创面。术后1～8周连续取材,HE染色观察,苏丹Ⅲ染色,β1整合素、CK15、CK19、CEA免疫组化荧光双标观察。结果术后2周,创面完全长合,较厚的新生皮完全覆盖创面,基底层细胞增生,形成细胞柱伸向真皮层,真皮层中可见管腔样结构,4周后新生表皮开始变薄,新生表皮下可见毛囊样、汗腺样、皮脂腺样等结构,皮脂腺样结构苏丹Ⅲ染色阳性。免疫双标结果显示,1～4周新生表皮基底层细胞呈β1整合素、CK19阳性,真皮层中带有核标记的管状或泡状结构呈CK15、CEA阳性。结论ES细胞源性表皮干细胞在小鼠全层皮肤缺损创面可分化为表皮样、汗腺样、毛囊样和皮脂腺样等结构的潜能。     

Ontogenic development of macrophage subpopulations and Ia-positive dendritic cells in fetal and neonatal rat spleen.

Development, differentiation, and distribution of macrophage subpopulations and Ia+ dendritic cells in the fetal and neonatal rat spleen were investigated by means of double immunohistochemical staining and immunoelectron microscopy. To characterize these cell populations, a panel of anti-rat macrophage monoclonal antibodies (RM-1, ED2, ED3, TRPM-3, Ki-M2R) and an anti-rat Ia antibody (OX6) were used. In the fetal rat spleen, macrophages were first detected by RM-1 at fetal day 15. ED2+ and/or Ki-M2R+ macrophages appeared at fetal day 16. TRPM-3+ and/or ED3+ macrophages appeared a day later. During the fetal and neonatal development, ED2+ and TRPM-3+ macrophages differentiated independently, maturing into red pulp macrophages and marginal metallophilic and marginal zone macrophages respectively. Intimate topographical relations were observed between ED2+ macrophages and hematopoietic cells and between TRPM-3+ macrophages and marginal zone lymphocytes. Ia+ cells were first observed around arterioles at fetal day 15. In the fetal and neonatal period, the number of Ia+ cells gradually increased, their shape became dendritic, and they matured into interdigitating cells in the inner periarteriolar lymphatic sheath. In ontogeny, Ia+ dendritic cells were not stained with ED2 or TRPM-3. These results suggest that ED2+ macrophages, TRPM-3+ macrophages, and Ia+ dendritic cells are distinct cell lines that pursue independent developmental process in spleen ontogeny.