PCR和实时荧光PCR法检测华支睾吸虫的比较研究

目的 利用PCR技术建立快速、灵敏、特异的检测华支睾吸虫的方法,并比较PCR和实时荧光PCR检测华支睾吸虫的灵敏性和特异性,探讨其在华支睾吸虫检测中的应用价值.方法 根据华支睾吸虫的特异性基因序列,设计了PCR引物及实时荧光PCR的特异性引物和探针,分别进行灵敏性和特异性实验.结果 设计的引物能够扩增华支睾吸虫DNA,而且探针的特异性很高.实时荧光PCR对华支睾吸虫的检测阈值为3 fg/μl,灵敏度比PCR高两个数量级.结论 PCR和实时荧光PCR检测华支睾吸虫的灵敏性和特异性均很高,操作简便,为华支睾吸虫的检测提供了有效的技术手段和方法.     

实时荧光定量PCR检测胆囊结石中华支睾吸虫DNA的研究

目的运用基于Taqman探针实时荧光定量PCR技术检测胆囊结石中的华支睾吸虫DNA。方法选取2012年3～4月份40例实施内镜取石保胆手术患者的胆囊结石,通过傅里叶红外光谱法分析结石成分,对结石研磨涂片镜检观察,并提取其DNA,运用实时荧光定量PCR技术检测华支睾吸虫基因。结果 40例患者的胆囊结石按主要成分可分为胆色素性结石(25例),胆固醇性结石(6例),混合性结石(9例)。结石涂片镜检有23例发现华支睾吸虫虫卵(阳性率57.5%),其中胆色素性结石19例,混合性结石4例。实时荧光定量PCR检测华支睾吸虫DNA阳性率为65.0%(26/40),其中包括23例镜检虫卵阳性标本及3例镜检阴性标本。结论运用实时荧光定量PCR在胆囊结石中检测出华支睾吸虫DNA,敏感性高于镜检法查虫卵。这不仅为华支睾吸虫感染诱发胆囊结石形成提供了分子生物学证据,同时也提供了一种诊断华支睾吸虫感染的有效手段,对胆囊结石病人的病因诊断、临床治疗以及术后预防复发等具有重要的指导意义。     

重组酶介导的华支睾吸虫特异性核酸等温扩增方法的建立及初步评价

目的　建立一种可用于华支睾吸虫检测的重组酶介导的等温核酸扩增方法（RAA）。方法　以华支睾吸虫18S rRNA基因序列作为靶序列，设计、合成、筛选特异性引物和探针，建立快速检测华支睾吸虫的荧光RAA检测方法。分别以含不同拷贝数DNA片段的重组质粒和不同浓度华支睾吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增，评价其检测敏感性；分别以似蚓蛔线虫、细粒棘球绦虫、日本血吸虫、十二指肠钩虫、曼氏血吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增，评价其检测特异性；通过抽提含华支睾吸虫虫卵的粪便及含囊蚴的淡水鱼肉样本DNA并进行荧光RAA扩增，初步评价其检测现场样本的能力。结果　成功建立了华支睾吸虫检测荧光RAA法，其可在39 ℃ 20 min内实现对华支睾吸虫DNA的特异性扩增。以含不同拷贝数DNA片段的重组质粒为模板，该方法最低检出限为10 拷贝/μL；以不同浓度华支睾吸虫基因组DNA为模板，该方法最低检出限为3 pg/μL；以似蚓蛔线虫、细粒棘球绦虫、日本血吸虫、十二指肠钩蚴及曼氏血吸虫基因组DNA为模板，检测结果均为阴性。该方法可成功检出感染华支睾吸虫的人体、大鼠粪便样本以及麦穗鱼样本，具备较好的现场样本检测能力。结论　成功建立了一种简便、快速、敏感、特异的可用于华支睾吸虫检测的RAA法。     

重组酶介导的华支睾吸虫特异性核酸等温扩增方法的建立及初步评价

目的　建立一种可用于华支睾吸虫检测的重组酶介导的等温核酸扩增方法（RAA）。方法　以华支睾吸虫18S rRNA基因序列作为靶序列,设计、合成、筛选特异性引物和探针,建立快速检测华支睾吸虫的荧光RAA检测方法。分别以含不同拷贝数DNA片段的重组质粒和不同浓度华支睾吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测敏感性;分别以似蚓蛔线虫、细粒棘球绦虫、日本血吸虫、十二指肠钩虫、曼氏血吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测特异性;通过抽提含华支睾吸虫虫卵的粪便及含囊蚴的淡水鱼肉样本DNA并进行荧光RAA扩增,初步评价其检测现场样本的能力。结果　成功建立了华支睾吸虫检测荧光RAA法,其可在39 ℃ 20 min内实现对华支睾吸虫DNA的特异性扩增。以含不同拷贝数DNA片段的重组质粒为模板,该方法最低检出限为10 拷贝/μL;以不同浓度华支睾吸虫基因组DNA为模板,该方法最低检出限为3 pg/μL;以似蚓蛔线虫、细粒棘球绦虫、日本血吸虫、十二指肠钩蚴及曼氏血吸虫基因组DNA为模板,检测结果均为阴性。该方法可成功检出感染华支睾吸虫的人体、大鼠粪便样本以及麦穗鱼样本,具备较好的现场样本检测能力。结论　成功建立了一种简便、快速、敏感、特异的可用于华支睾吸虫检测的RAA法。     

淡水鱼华支睾吸虫囊蚴 LAMP 检测方法的建立

目的 建立一种高效灵敏的环介导等温扩增(LAMP)方法检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴。 方法 以华支睾吸虫 ITS2 基因序列为靶序列,合成 Cs-1、Cs-2、Cs-3 三组 LAMP 引物体系。 以华支睾吸虫囊蚴 DNA 样本为模板,日本血吸虫成虫、带绦虫成虫、蛔虫虫卵及其他吸虫囊蚴 DNA 样本为参考,比较三组引物体系的特异度;以不同浓度的华支睾吸虫成虫基因组 DNA 为模板,比较三组引物体系的灵敏度;用 LAMP 法及 PCR 法平行检测 16 份华支睾吸虫囊蚴样本和 23 份其他吸虫囊蚴样本,评价 LAMP 法的敏感性和特异性。 结果 三组引物体系的灵敏度及特异度以 Cs-3 为最优,以其建立的 LAMP 法反应体系,检测华支睾吸虫成虫 DNA 的最低检出浓度可达到 3. 33×10^-4ng / μL,敏感性和特异性与 PCR 法一致,均为 100%。 结论 成功建立了一种可用于检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的 LAMP 方法,为淡水鱼寄生虫病监测工作提供了便捷高效的检测手段。     

改良加藤厚涂片法和PCR法检测华支睾吸虫感染的 效果比较

目的　比较改良加藤厚涂片法（Kato?Katz法）和PCR法对现场人群粪便样本中华支睾吸虫感染的检出率,为华支睾吸虫感染检测方法的选择提供依据。方法　在2016年广西壮族自治区藤县人体华支睾吸虫感染流行病学调查的基础上,随机抽取133份粪便样本,-20 ℃保存。分别采用Kato?Katz法（1粪3检）和PCR法检测华支睾吸虫感染,比较两种方法对华支睾吸虫感染的检出率,采用Kappa分析评价两种检测方法结果的一致性。结果　133份人群粪便样本中,华支睾吸虫感染总检出率为77.44%（103/133）,其中Kato?Katz法检出率为57.14%（76/133）,PCR法检出率为70.68%（93/133）, PCR法检出率显著高于Kato?Katz法（[χ2] = 26.15,P <0.01）。76份Kato?Katz法阳性粪便样本中,88.16%（67/76）的样本PCR法扩增阳性;57份Kato?Katz法阴性样本中,47.37%（27/57）的样本PCR法扩增阳性。PCR法对每g粪便虫卵数（EPG）> 1 000的粪便样本中华支睾吸虫感染的检出率（94.7%,18/19）高于EPG < 1 000的样本（85.96%,49/57）,但差异无统计学意义([χ2] = 1.05,P = 0.436)。两种方法检出率一致性检验结果一般（Kappa = 0.73）。结论　PCR法对人群华支睾吸虫感染的检出率显著高于Kato?Katz法。建议在华支睾吸虫感染度较轻的地区,采用Kato?Katz法结合PCR法进行检测,以提高检出率。     

基于线粒体细胞色素C氧化酶亚单位1基因鉴别华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫的双重PCR法的建立

分别提取华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫的基因组DNA,针对两种吸虫线粒体细胞色素C氧化酶亚单位1(COX1)基因设计引物,进行单重和双重PCR扩增。用针对华支睾吸虫的3对引物进行单重PCR扩增,FC1/RC1和FC3/RC3引物分别扩增出328 bp和356 bp的特异性目的条带,而FC2/RC2引物未扩增出任何条带;用针对扇棘单睾吸虫的FH1/RH1和FH2/RH2引物进行单重PCR扩增,分别扩增出200 bp和190 bp的特异性目的条带。用华支睾吸虫FC1/RC1引物,结合扇棘单睾吸虫的FH1/RH1和FH2/RH2引物,分别进行双重PCR扩增,均能扩增出特异性条带,彼此间无干扰。     

重组酶介导的等温核酸扩增技术检测淡水鱼华支睾吸虫囊蚴的初步应用

目的 评价重组酶介导的核酸等温扩增技术(recombinase-aided amplification,RAA)用于淡水鱼肉样本中华支睾吸虫囊蚴检测效果，为后续该方法标准化及现场应用提供科学依据。方法 2022年6—9月在江苏省泰州市姜堰区、兴化市、泰兴市华支睾吸虫感染阳性人群所在行政村河道内采集野生淡水鱼样本。取6份不含华支睾吸虫囊蚴的鱼肉组织(每份5 g)，分别加入0、1、2、4、8、16个华支睾吸虫嚢蚴，提取鱼肉组织基因组DNA后采用荧光RAA法进行检测，评价该方法检测灵敏度；分别以华支睾吸虫、东方次睾吸虫、钩棘单睾吸虫、台湾棘带吸虫嚢蚴基因组DNA为模板，采用荧光RAA法检测，评价其交叉反应；分别采用荧光RAA法和压片法检测现场采集的淡水鱼样本，比较两种方法检测华支睾吸虫效果。结果 含1、2、4、8、16个华支睾吸虫囊蚴的鱼肉组织样本均出现阳性扩增，荧光RAA法可在20 min内对5 g鱼肉组织中含1个华支睾吸虫囊蚴的样本实现阳性扩增；以东方次睾吸虫、钩棘单睾吸虫、台湾棘带吸虫嚢蚴基因组DNA为模板进行RAA检测，结果均为阴性。对采集的1 735条淡水鱼分别采用荧光RAA法和压...     

重组抗原应用于SPG-ELISA检测华支睾吸虫循环抗体的效果评价

目的评价重组抗原用于SPG-ELISA诊断华支睾吸虫感染的价值。方法分别使用重组华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶（Cs-CysB）与华支睾吸虫成虫可溶性抗原（CAA）,以SPG-ELISA检测华支睾吸虫病患者血清特异性IgG,比较两种抗原包被SPG-ELISA方法的敏感性与特异性。结果检测50份华支睾吸虫感染者血清,重组Cs-CysB与CAA包被的SPG-ELISA阳性率均为94.00%,健康人血清50例均为阴性;检测日本血吸虫病血清20份、并殖吸虫病血清20份、囊虫病血清10份,交叉反应率分别为5.00%、10.00%、20.00%和5.00%、0、20.00%。结论以重组Cs-CysB为包被抗原用SPG-ELISA检测血清华支睾吸虫抗体具有较高的敏感性及特异性,检测效果与CAA包被的SPG-ELISA相当。     

亲和层析法纯化华支睾吸虫抗原的研究

目的 探索华支睾吸虫特异性抗原的纯化方法。方法从华支睾吸虫病流行区的淡水鱼中分离华支睾吸虫囊蚴，接种动物，收集成虫，制备匀浆液（粗抗原），借助偶联华支睾吸虫病人血清抗体的Sepharose4B亲和层析柱，提取特异性抗原，用浓度梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳（CG-PAGE）和免疫印迹方法鉴定纯化抗原的纯度和特异性。结果亲和层析法纯化抗原经CGPAGE显示5条蛋白带，免疫印迹试验鉴定均有抗原性，强阳性带蛋白分子质量单位为31ku，各区带蛋白与并殖吸虫、血吸虫血清抗体无交叉反应。粗抗原有16条蛋白带。结论经亲和层析法纯化的华支睾吸虫抗原特异性高。亲合层析是获取华支睾吸虫诊断用抗原的较佳方法。     

Digital PCR

The identification of predefined mutations expected to be present in a minor fraction of a cell population is important for a variety of basic research and clinical applications. Here, we describe an approach for transforming the exponential, analog nature of the PCR into a linear, digital signal suitable for this purpose. Single molecules are isolated by dilution and individually amplified by PCR; each product is then analyzed separately for the presence of mutations by using fluorescent probes. The feasibility of the approach is demonstrated through the detection of a mutant ras oncogene in the stool of patients with colorectal cancer. The process provides a reliable and quantitative measure of the proportion of variant sequences within a DNA sample.     

Real-time PCR

PCR based assays are currently used routinely in most microbiology laboratories. But, with few exceptions, they are restricted to the field of virology, especially to a limited number of viral targets with important economical interest for which commercially well standardized assays are available. For several reasons, it has had a poor implementation of the PCR assays into routine diagnostics for other infectious diseases despite they are advantageous. Combined with automated sample isolation of nucleic acids, real-time PCR gives an ideal platform for the development of molecular assays for a wide range of infectious agents with clinical interest. Because of its advantages, as simplicity, rapidity and minor risk of contamination, real-time PCR will go replace conventional PCR assays and its use will extend to a wide range of applications in clinical microbiology.     

荧光定量PCR与常规PCR检测血清乙型肝炎病毒的对比观察

目的 探讨荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）与常规聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒（HBV）敏感性的差异。方法 对105份乙型肝炎患者血清用两种方法检测HBV。结果 常规PCR对10^6-10^9,10^5-10^4和≤10^3copy/ml的血清检测结果有统计学差异。常规PCR检测10^6-10^9copy/ml的血清假阴性率仅5.0%,10^4-10^5copy/ml时假阴性率达36.8%,10^3copy/ml主要为阴性结果，但有6例为阳性或弱阳性（24.0%)。结论 常规PCR对≤10^5copy/ml的血清有较高的假阴性率，比FQ-PCR灵敏度低10-100倍，弱阳性标本FQ-PCR检测也可能出现假阴性结果。     

Aspergillus PCR testing: results from a prospective PCR study within the AmBiLoad trial

Objectives: Invasive fungal infection (IFI) is a major cause of morbidity and mortality in severely immunocompromised patients and is difficult to diagnose. The significance of molecular methods for diagnosis of IFI is still controversial. In a subset of patients treated within the AmBiLoad Trial, samples were investigated prospectively by a nested Aspergillus PCR assay to re‐evaluate the significance of PCR in this setting. Patients and methods: In the randomized, prospective multicenter AmBiLoad trial, patients with proven or probable IFI were randomized to receive liposomal amphotericin B (L‐AMB) 3 or 10 mg/kg QD for 14 d followed by L‐AMB 3 mg/kg QD. From 91 patients, 459 serial samples (98% blood samples) were investigated by a nested PCR assay for Aspergillus DNA. All samples were investigated in our laboratory with a previously described nested and a quantitative PCR assay. As required by the study protocol, serial Aspergillus antigen galactomannan was performed. IFI was defined according to modified EORTC/MSG 2002 criteria as applied in the AmBiLoad trial. Results: Seven and 52 patients had proven and probable IFI according to modified EORTC/MSG criteria, respectively. The median number of samples investigated per patient was 4. Seventy percent of samples were obtained during treatment with antifungal study medication. Forty‐three samples gave positive PCR results. Patients with an unfavorable outcome had a significantly higher rate of positive PCR results (48% versus 21%). Conclusions: The sensitivity of Aspergillus PCR testing is limited during antifungal therapy. The tendency for persistently positive PCR results to indicate a poor prognosis has to be confirmed in further studies.     

PCR及PCR-ELISA法检测蚊体内马来丝虫幼虫

目的：建立一种检测蚊体内马来丝虫幼虫的灵敏、快速、特异的方法。方法：选择应用PCR及PCR－ELISA法检测马来丝虫幼虫DNA的最佳反应条件，并在该条件下分别以马来丝虫Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期幼虫各1条作模板，测定检测的灵敏度及检测实验室人工感染中华按蚊体内的马来丝虫幼虫。结果：PCR及PCR－ELISA法均能检测出1条Ⅰ期幼虫（L1），而PCR的检测下限为1／10条L1，PCR－ELISA检测下限为1／100条L1；将分离的感染期幼虫加阴性蚊媒进行粗提、扩增及电泳，结果未见明显的扩增条带，扩增产物作ELISA检测，全部为阴 性；个体解剖人工感染的中华按蚊120只，分别收集113只阳性蚊体内的幼丝虫，用两种方法检测，结果均为阳性。结论：初步建立了PCR及PCR－ELISA法检测蚊体内马来丝虫幼虫的方法。