HCV 5‘—NCR序列克隆和转录重组质粒构建

选取ＩＶ基因型ＨＣＶ及中国和台湾代表株ＨＣＶ的５’ＮＣＲ区保守序列合成引物，以ＲＴ－ＰＣＲ从输血后非甲非乙型肝炎病人血浆中扩增一段３００ｂｐ的ｃＤＮＡ片段作目的基因，钝端插入ｐＵＣ１９的Ｓｍａ１切点，构建了ｐＵＨＣＶ－ＮＣ重组质粒。对ｐＵＨＣＶ－ＮＣ分别或混合应用ＨＣＶ序列特异的内外引物和载体序列特异的通用引物进行ＰＣＲ扩增，所得产物分子阳均同预期相符；酶切分析查出ＨＣＶ基因所带和克隆位点融合所产     

HCV 定量 RT-PCR 竞争性参比标准的构建

将克隆的ＨＣＶ５’ＮＣＲ序列反向插入ｐＳＰ７２的ＥｃｏＲＶ切点，构建一种能转录ＨＣＶ－ＲＮＡ的质粒ｐＳｎｃ－２。以ＲＴ－ＰＣＲ从抗ＨＥＶＩｇＭ阳性病人血浆中扩增一段２３８ｂｐ的ＨＣＶ－ｃＤＮＡ，反向插入ｐＳｎｃ－２中克隆的５’ＮＣＲ序列的ＮｃｏⅠ切点，构建插入突变型ＨＣＶ－ｃＤＮＡ重组体ｐＳｎｃ－ｅ。应用限制性酶切和ＰＣＲ对这两种重组质粒进行了鉴定，为ＨＣＶ－ＲＮＡ的定量ＰＣＲ提供有用的内参照模板。     

丙型肝炎病毒NS5B区基因的扩增、克隆及序列分析

目的 对丙型肝炎病毒(HCV)NSSB区基因克隆并测序，研究其变异状况。方法 从HCV RNA阳性血清中抽提病毒RNA，利用巢式RT-PCR对NS5B区基因进行扩增，将扩增获得的靶cDNA克隆至P^KPL-3a质粒载体中，并以内引物为测序引物进行序列测定分析。结果 构建了已克隆HCVNS5B区基因的重组质粒KHC5—1；序列分析表明，与HCV-BDS株同源性最高，属于主要流行于我国的HCV 1b基因亚型。结论 证实了在NS5B区，与RNA依赖的RNA聚合酶(RDRP)活性密切相关的基元结构Gly-Asp-Asp及其相邻序列的同源性非常高。     

HCV重组体转染细胞系的研究

目的：建立ＨＣＶ重组体转染ＳＭＭＣ７７２１肝缲细胞模型。方法：采用ＦＵＧＥＮＥ＾ＴＭ６转染法，然后用ＲＴ－ＰＣＲ法测定细胞内重组体ｍＲＮＡ瞬时表达情况：结果：６７．５％的培养孔可筛选到转染细胞表达重组体ｍＲＮＡ。结论：该转梁法效率高，建立的细胞模型可用于筛选抗病毒转录的药物。     

丙型肝炎患者唾液和尿HCV－RNA检测及其意义

采用套式聚合酶链反应检测丙肝患者血清，唾液和尿各５２份。结果血清ＨＣＶ－ＲＮＡ阳性３９例，２３例分别在尿和唾液中检出ＨＣＶ－ＲＮＡ；１３份血清ＨＣＶ－ＲＮＡ阴性者中，尿和唾液均未检出ＨＣＶ－ＲＮＡ，有非常显著差异（Ｐ＝０．０００１）。血清ＨＣＶ－ＲＮＡ阳性者分ＡＬＴ正常组和异常组，尿和唾液ＨＣＶ－ＲＮＡ阳检率分别为１８％和７５％，亦有非常显著差异（Ｐ＝０．００１）。对照组１３例正常人血清、唾液和尿ＨＣＶ－ＲＮＡ均为阴性。表明丙肝患者尿和唾液中能否检出ＨＣＶ－ＲＮＡ与病毒血症及ＡＬＴ有关，提示丙肝患者的尿和唾液可能为ＨＣＶ感染的传播媒介。     

RT－PCR检测HCV RNA假阳性结果分析

ＲＴ－ＰＣＲ检测ＨＣＶＲＮＡ假阳性结果分析宋燕斌，崔晓红，潘卫，王锦红，戚中田丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）是新近认识的一种单股正链ＲＮＡ病毒，在感染者外周血中的含量低［１］，目前认为逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测ＨＣＶＲＮＡ是诊断ＨＣＶ感染的最敏...     

基因扩增技术诊断隐原性肝硬化中HCV和HBV感染

应用聚合酶链反应检测35例隐原性肝硬化的血清HCV RNA和HBV DNA,结果两项标志共检出27例,总阳性率77.1％。其中,单项HCV RNA阳性占28.6％(10/35);单项HBV DNA阳性占25.7％(9/25);HCV RNA和HBV DNA双阳性占22.9％(8/35)。表明本地区隐原性肝硬化的发生多与HCV和/或隐匿性HBV感染有关。     

丙型肝炎病毒Ns_3基因区部分序列的PCR克隆和鉴定

选取HCV－1、HCV－J、HCV－BK、台湾株HCV、中国河北株HCV序列的同源性部分，设计Ns3区部分序列的PCR引物．应用RT－PCR技术，从丙型肝炎患者血浆中扩增一长为448bp的cDNA片段作为目的基因，与经过限制性酶切的pUcI9载体连接，构建重组质粒pUHCV－Ns3．分别或混合应用HCV序列特异的引物和载作序列特异的通用引物，以PCR扩增重组质粒，结果扩增产物的分子量均与预期大小一致．限制性酶切位点分析结果也证实，克隆的基因是HCV的Ns3区部分序列的目的基因．克隆序列的特异性和插入方向同时得到了鉴定．     

HCV定量RT—PCR竞争性参比标准的构建

将克隆的ＨＣＶ５‘ＮＣＲ序列反向插入ｐＳＰ７２的Ｅｃｏ ＲＶ切点，构建一种能转录ＨＣＶ－ＲＮＡ的质粒ｐＳｎｃ－２。以ＲＴ－ＰＣＲ从抗ＨＥＶ ＩｇＭ阳性病人血浆中扩增一段２３８ｂｐ的ＨＣＶ－ｃＤＮＡ反向插入ｐＳｎｃ－２中克隆的５’ＮＣＲ序列的ＮｃｏＩ切点，构建插入突变型ＨＣＶ－ｃＤＮＡ重组体ｐＳｎｃ－ｅ。     

HCV E2／NS1基因的PCR检测克隆与序列分析

本文报道了利用ＰＣＲ技术检测了３４例丙型肝炎病毒Ｅ２／ＮＳ１基因的ｃＤＮＡ并与５非编码区基因的ｃＤＮＡ检测技术进行了比较，应用ｐＵＣ１８质粒对此扩增片段进行了克隆与序列分析，结果表明克隆片段ＨＣＶ－Ｓ１为我国主要流行的ＨＣＶ基因亚型－ＩＩ型，其与ＨＣＶ－ＩＩ型的核苷酸与氨基酸的同源性均在９０％以上，序列分析表明该片段富含脯氨酸和胱氨酸，可能具有复杂的空间构型，且与４个糖基化位点一样保持稳定，另外，     

中国HCV一株NS5区部分基因克隆及序列分析

目的：研究ＨＣＶ ＮＳ５基因的结构与功能，为进一步研制适合我国使用的第３代抗－ＨＣＶ试剂打下基础。方法：自行设计引物，从河北固安县慢性丙型肝炎患者血中，用逆转录－聚合酶链反应扩增出ＨＣＶ ＮＳ５基因，并将其克隆到载体ｐＫＰＬ－３ａ，经Ｄｏｔ ｂｌｏｔ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ和限制性内切酶分析筛选出阳性克隆ｐＫＨＣ－５ａ，进行序列测定。结果：核苷酸序列分析表明，克隆的ＨＣＶ ＮＳ５基因与ＨＣＶⅡ     

血液制品抗HCV酶免疫检测方法探讨

目的通过对各种抗HCV酶免疫试剂检测效果的比对分析,寻求合适的检测方法.方法抗HCV阳性血清,分别用国产第二代抗HCV ELISA试剂、进口第三代抗HCV ELISA试剂进行测定,结果分别与分片段试剂及RT-PCR测定结果进行比较;在此基础上进行配对组合,以达到较高的检出率.结果以RT-PCR测定结果为标准,国产试剂平均检出率为65.24%,进口试剂平均检出率为80.32%,两者比较P＜0.01;以分片段试剂测定结果为标准,进口试剂与国产试剂对HCV-C区、NS5区检出率比较,P＜0.01;二种试剂配对检测提高了检出率.结论进口第三代试剂比国产试剂检出率高,血站进行HCV检测宜用进口试剂;采用二种互补性好的试剂联合检测有助于提高检出率.     

用原位 PCR 研究石蜡包埋肝组织中微量 HCV RNA

为定位分析石蜡包埋肝组织中微量ＨＣＶＲＮＡ，改良建立了原位ＰＣＲ检测技术，并对１７例丙型肝炎相关的肝细胞癌患者癌组织和癌周肝组织石蜡包埋切片进行检测。结果显示：该技术的特异性可靠，敏感性高于原位杂交法；两种组织切片ＨＣＶＲＮＡ阳性率分别为４１．２％和７０．６％，阳性信号主要呈胞浆型分布；在癌细胞中核型和核膜型分布比例较癌周肝组织明显增高，提示ＨＣＶ可能与宿主细胞基因存在着相互作用。     

华南HCV 1b亚型NS5A插入式复制子重组质粒的构建和序列分析

目的构建来自华南不同慢性丙型肝炎(CHC)患者的HCV NS5A的复制子重组质粒并测序分析,探索HCV NS5A在抗病毒应答中生物学特性。方法以能够高效复制的1b型HCV复制子质粒为骨架,构成带有MIuⅠ和BclⅠ双酶切位点的开关质粒,采用逆转录-聚合酶链反应从不同CHC患者血清中扩增获得HCV 1b亚型NS5A全长片段,克隆到pMD-18载体中,测序分析其中的PKRBD、ISDR、V3和IRRDR区域的变异情况。扩增产物中无MIuⅠ和BclⅠ酶切序列的,在引物中引入相关酶切序列后再扩增,双酶切后将NS5A区段置换入HCV 1b复制子骨架中。结果成功扩增出NS5A全长片段并克隆测序,将NS5A区ISDR-V3区域置换入复制子中,测序结果正确。序列比对显示应答株的ISDR和PKRBD氨基酸变异数目比无应答株高;V3和IRRDR区域存在较高氨基酸突变率。结论成功构建包含华南HCV 1b亚型NS5A核心区域的复制子插入式重组质粒,为研究HCV NS5A生物学特性、干扰素抵抗的机制以及难治性CHC患者的个体化抗病毒治疗分析奠定了基础。     

HBV DNA和HCV RNA检测试剂抗干扰能力验证

目的:评估乙型肝炎病毒(HBV)脱氧核糖核酸(DNA)和丙型肝炎病毒(HCV)核糖核酸(RNA)定量检测试剂的抗干扰能力.方法:选择高、低浓度HBV DNA和HCV RNA阳性血清标本,采用实时荧光定量PCR技术检测不同浓度血红蛋白(hemoglobin,Hb),总胆红素(total bilirubin,TBIL)和甘油三酯(triglyceride,TG)对2种阳性血清标本检测的干扰.以偏差<±7.5％ 为可接受范围.结果:HBV DNA检测,当Hb浓度≤4.5 g/L时,各样本均未受到干扰,Hb浓度≥8.1 g/L时,各样本受到不同程度的干扰;当TBIL浓度≤370μmol/L时,高浓度样本检测未受到明显干扰,TBIL浓度≥666μmol/L,各样本受到不同程度的干扰;TG浓度≤12.6 mmol/L时,未对检测造成干扰.HB≤8.1 g/L,TBIL浓度≤666μmol/L,TG浓度≤12.6 mmol/L均未对HCV RNA检测造成干扰.结论:HBV DNA和HCV RN A定量检测试剂具有一定的抗干扰能力.     

PCR循环测序法检测K-ras和HCV 5'非编码区基因变异

目的：建立一种简单、快速、可靠的ＤＮＡ序列分析方法，并利用此方法分析Ｋｒａｓ基因和ＨＣＶ５′非编码区基因的变异情况。方法：ＰＣＲ循环测序法是将ＰＣＲ扩增与核酸序列分析相结合的一种研究方法。根据此技术原理，建立了以ＰＣＲ扩增引物为测序引物，利用ＴａｑＤＮＡ聚合酶、荧光标记的２′，３′双脱氧核苷三磷酸（ｄｄＮＴＰ）直接进行ＰＣＲ扩增产物序列分析的方法。应用该方法对人肺癌组织中的Ｋｒａｓ癌基因和丙型肝炎病毒５′非编码区（ＨＣＶ５′ＮＴＲ）进行了序列测定。结果：肺癌组织中的Ｋｒａｓ基因第１外显子第３５位碱基发生点突变（ＧＧＴ→ＧＡＴ）；属于高度保守区的ＨＣＶ５′ＮＴＲ存在基因变异。结论：ＰＣＲ循环测序法具有简单、快速、结果可靠等特点，为基因突变的检测和病原体的核酸序列分析提供了一个快速实用的方法。     

HCV 广东株5’NCRc DNA的克隆及序列测定

从广东省１例慢性丙型肝炎病人血清中提取ＨＣＶＲＮＡ，随机引物逆转录为ｃＤＮＡ后用ＨＣＶ５’端非编码区（５’ＮＣＲ）特异引物进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）。扩增产物３０２ｂｐ，经补齐和提纯后插入ｐＵＣ１９质粒，获得的重组质粒ｐＵＮ采用双脱氧链终止法测定核苷酸序列，与国内外多个株比较，核苷酸同源性介乎９２．６９％～１００％，其中与ＨＣＶⅡ（１ｂ）型的同源性最大。本文的测序结果可为引物设计提供依据。获得的ＨＣＶｃＤＮＡ在常规ＰＣＲ步骤中用于设立有效的模板对照，对消除假阴性及评估试剂有重要意义。     

血液病儿童输血后HCV感染的分析

对112例血液病儿童输血后用PCR方法进行丙型肝炎病毒检测，阳性率为18．75％．分析男女间、4种病组间无显著性差异．30例无输血史非血液病儿童对照组中皆阴性．     

原发性肝癌78例血清HCVRNA和抗HCV的观察

用逆转录－聚合酶链反应和酶联免疫吸附试验检测了７８例原发性肝癌患者清丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＲＮＡ、抗ＨＣＶ和乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）免疫学标物。     

HCV NS-5区分型引物法检测新疆两城市HCV基因型

目的：了解新疆两城市丙型肝炎病毒感染者中存在哪些基因型，以便为今后防治ＨＣＶ感染提供依据。方法：用ＲＴ－ＰＣＲ技术，选择ＨＣＶＮＳ－５区设计的分型引物（１ａ、１ｂ、２ａ和２ｂ）进行基因分型。结果：我们检测了１２８例（乌鲁木齐市９７例，克拉玛依市３１例）已证实为丙型肝炎病毒感染者的血清，其中基因分型检测出的９８例中可分为１ａ型１４例（１４．３％）、１ｂ型５８例（５９．３％）、２ａ型１１例（１１．８％）、２ｂ型１０例（１０．３％），混合感染５例（５．２％）（１ａ＋１ｂ型４例，１ｂ＋２ａ型１例）。在乌鲁木齐市和克拉玛依市的ＨＣＶ感染者中１ａ型分别为１１／７３例和３／２５例，１ｂ型分别为４６／７３例和１２／２５例。结论：表明新疆至少存在ＨＣＶ１ａ、１ｂ、２ａ和２ｂ基因型，但以１ｂ基因型感染为主。比较乌鲁木齐市和克拉玛依市两城市的ＨＣＶ基因型分布显示１ａ型和１ｂ型分布有明显差别（χ２＝３６，Ｐ＜０．００１）。另３０例用本方法未能检出分型，提示可能还有其它基因型存在