增殖细胞核抗原与bc1-2在培养的人视网膜色素上皮细胞的表达

目的观察培养的人视网膜色素上皮细胞（ｒｅｔｉｎａｌｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｓ，ＲＰＥ）的增殖细胞核抗原（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｃｅｌｎｕｃｌｅａｒａｎｔｉｇｅｎ，ＰＣＮＡ）和ｂｃ１－２的表达。方法用ＳＡＢＣ法对培养的人ＲＰＥ作鼠抗人ＰＣＮＡ单抗及兔抗人ｂｃ１－２抗体免疫组织化学染色。结果ＲＰＥ在接种后２４小时和４８小时，ＰＣＮＡ的阳性率分别为３１．２％和５０．６％，阳性染色位于细胞核内，斑块状。ｂｃ１－２的表达为７６％～９０％，阳性染色在细胞浆，细颗粒状。结论培养中一半ＲＰＥ有ＰＣＮＡ抗原表达，提示这些细胞处于Ｓ期；ｂｃ１－２抗原在大多数ＲＰＥ表达阳性。这些生物标记物可能与培养的ＲＰＥ生长活性有关。     

缺氧对牛视网膜色素上皮细胞增生和凋亡基因bcl-2表达的影响

目的 观察缺氧对培养的牛视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞增生和凋亡基因bcl-2表达的影响。 方法 用四甲基偶氮唑蓝［3-(4,5-dimethylthiazole-2yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromid, MTT］比色法和免疫组织化学的方法，将培养的RPE细胞接种于24孔板，每孔细胞密度为5×10 4，分成4组：A组置入缺氧环境中培养(3%O 2 ，5%CO 2，92%N 2，37℃)；B组置入正常环境中培养(5%CO2，95%空气，37℃)；C组：将缺氧环境培养24 h的细胞上清液加到正常环境培养的牛 RPE细胞中培养；D组：将正常环境培养24 h的细胞上清液加到正常环境培养的牛 RPE细胞中培养。24 h后分别取出行MTT比色法及抗bcl-2蛋白抗体染色。 结果 A组与B组、C组与D组比较，前者细胞MTT实验吸光度(A)值［旧称光密度(OD)］均高于后者(P＜0.05); 抗bcl-2蛋白抗体染色，A、B组阳性率分别为72.60%、38.64%； C、D组阳性率分别为83.20%、21.80%。阳性染色在细胞浆，近核膜处染色尤深，部分呈细颗粒状。 结论 缺氧促进牛RPE细胞增生及凋亡基因 bcl-2表达。 (中华眼底病杂志, 2002, 18: 293-295)     

人视网膜色素上皮细胞与T淋巴细胞的激活

目的 观察人视网膜色素上皮（RPE）细胞人类白细胞抗原(HLA)-DP、-DQ、-DR抗原和CD40抗原的表达，以确定它们在免疫应答过程中的分子表达和刺激T淋巴细胞活化的能力。方法 人RPE细胞分别在γ-干扰素诱导和无诱导的条件下培养，免疫组织化学染色方法测定HLA-DP、-DQ、-DR抗原和CD40抗原在RPE细胞中的表达。体外共同培养人RPE细胞和外周血单个核细胞，荧光活化细胞分类仪测定其中活化的T淋巴细胞CD69的表达。结果 γ-干扰素能够诱导HLA-DP、-DQ、-DR抗原表达升高和CD40在人RPE细胞上的表达，CD69阳性的T淋巴细胞，在人RPE细胞与外周血单个核细胞的共同培养系统中的含量增加。结论 人RPE细胞能够激活外周血中T淋巴细胞，是一种具有免疫学特性潜能的抗原递呈细胞。     

增生细胞核抗原在视网膜色素上皮细胞表达及其反义寡核苷酸的抑制作用

目的 研究视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞中增生细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表达及其反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides,AS ODN)对其表达和细胞增生的抑制作用，为增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)治疗探索基因治疗新途径。 方法 (1)体外培养兔眼RPE细胞，在不同时间采用链霉亲合素-生物素化过氧化物酶复合物(streptoavidin-biotin enzyme complex,SABC)免疫组织化学法检测PCNA的表达;(2)脂质体介导下不同浓度的PCNA AS-ODN和正义寡核苷酸(sense oligodeoxynucleotides,S-ODN)分别作用于体外培养的RPE细胞，采用免疫组织化学方法检测PCNA的表达;(3)四唑盐比色法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)检测在不同浓度的PCNA AS-ODN和S-ODN作用下RPE细胞生长活性及其生长抑制率。 结果 (1)体外培养兔眼RPE细胞表达PCNA，表达高峰为培养后48 h ;(2)在0.28、1.12 μmol/L AS-ODN 作用下，PCNA的表达明显受抑制;(3)0.28、1.12 μmol/L的PCNA AS-ODN 能明显抑制RPE细胞增生活性，并呈剂量依赖性，其生长抑制率分别达53%、81%。 结论 一定浓度PCNA AS-ODN能序列特异性地抑制RPE细胞PCNA表达和增生活性，有望进一步用于PVR的治疗实验研究。 (中华眼底病杂志, 2002, 18: 231-233)     

PCNA和bcl-2在翼状胬肉成纤维细胞中的表达及蝮蛇抗栓酶的影响

目的研究增殖细胞核杭原(PCNA)和bcl-2在人翼状胬肉成纤维细胞(HPF)中的表达以及蝮蛇抗栓酶(AF)对二者表达的影响。方法应用免疫组织化学方法检测体外培养的第3~6代人翼状胬肉成纤维细胞的PCNA和bcl-2表达情况以及用AF处理HPF后PCNA和bcl-1的表达情况。结果未经任何处理的HPF的PCNA阳性表达率为(60·28±0·37)%;bcl-2阳性表达率为(83·33±1·56)%。用不同含量AF(0·016、0·04和0·1U/ml)处理HPF48h后,HPF的PCNA和bcl-2均有不同程度下降,以PCNA阳性表达率下降为明显,经统计学分析,均有显著统计学意义(P<0·01)。结论体外培养的HPF有较高的PCNA阳性表达及bcl-2阳性表达。AF能抑制PCNA和bcl-2在HPF上的表达。     

实验性视网膜脱离及复位后视网膜色素上皮细胞抗增殖性细胞核抗原的表达

目的 观察视网膜脱离和复位过程中抗增殖性细胞核抗原(proiferating cell nuclear antigen, PCNA)表达的状况，以评价其在接触抑制机制中的意义。 方法 对72只猫眼行晶状体 囊外摘除和玻璃体切除手术。3周后，利用微穿刺技术制作视网膜脱离和复位动物模型，在不同时间取眼球并制成组织切片。采用免疫组织化学方法，观察视网膜脱离后视网膜色素上皮(retinal pigment-epithelium, RPE)细胞PCNA的表达。光镜下确定PCNA阳性的RPE细胞并量化增殖反应。采用方差分析(ANOVA)方法 ，对脱离组的脱离区和非脱离区及复位组复位区RPE细胞层PCNA的表达水平进行比较。 结果 在视网膜脱离后24 h，脱离组脱离区视网膜RPE细胞层出现PCNA阳性细胞 ，5～6 d达到高峰，20 d后逐渐回落。在复位组复位区，PCNA标记的RPE细胞明显少于脱离组脱离区。脱离组非脱离区视网膜很少有PCNA标记的RPE细胞。3组PCNA标记的RPE细胞数比较，差异有显著性的意义。 结论 视网膜脱离诱导RPE细胞增殖，而视网膜复位后这种增殖受到抑制。表明视网膜复位过程中，接触抑制的机制在发挥作用。（中华眼底病杂志，2003，19：20-23）     

bcl-2基因和增殖细胞核抗原在人晶状体上皮细胞中的表达

目的：观察正常胚胎、儿童和老年人晶体上皮细胞中bcl-2基因和增殖细胞核抗原（proliferating cell nuchlear antigen,PCNA)的表达状况,探讨其与晶状体上皮细胞增殖潜能的关系。方法采用免疫组织化学染色法光谱下检测胚胎组（胎龄5－10个月）、儿童组（7个月至13岁）及老年组（＞50岁）晶状体上皮细胞中bcl-2基因和PCNA的表达状况。结果：bcl-2基因和PCNA在胚胎组和儿童组晶状体上皮细胞中表达的阳性率显著高于老年组（P＜0．01）,且以晶状体赤道部明显,结论日 状体上皮细胞的增殖潜能以及后发性白内障的发生与晶状体上皮细胞内bcl-2基因及PCNA的表达有关。     

视网膜色素上皮细胞凋亡中bax和bcl-2的表达

目的 探讨视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞凋亡的分子机制。 方法 将柔红霉素加入培养的人RPE细胞培养液中(终浓度为180μg/L)作用12小时,撤药后继续培养24小时。通过光镜观察、酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测和末端脱氧核苷酸转移酶介导的生物素化脱氧尿苷三磷酸末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated biotin-dUTP nick end labelling,TUNEL)染色观测细胞凋亡状态。同时行bax和bcl-2免疫细胞化学染色和定量分析。 结果 柔红霉素作用后,部分细胞皱缩、核浆比例增大;TUNEL染色显示散在的阳性细胞;ELISA检测结果表明培养细胞中凋亡细胞比例随药物剂量增加而增大。与正常对照组相比,bax表达的积分光密度由69.4±6.3升至84.7±6.1(P<0.05);对照组和实验组细胞bcl-2染色的积分光密度分别为34.4±3.7和31.0±6.6(P>0.05)。 结论 在柔红霉素引发的人RPE细胞凋亡过程中,bax表达增强,bcl-2/bax 相对比率降低,提示bax和bcl-2在RPE细胞凋亡的调控中具有一定作用。 (中华眼底病杂志, 1999, 15: 153-156)     

转染Zn2+诱导表达反义bcl-2基因对人视网膜色素上皮细胞的影响

目的:观察转染Zn2 诱导表达的反义bcl-2 基因对人视网膜色素上皮(RPE)细胞的影响。方法:培养的正常RPE细胞与转染反义bcl-2 RPE细胞采用免疫组化,克隆形成试验、MTT,流式细胞仪,TUNEL分别予以观察。结果:转染后RPE细胞细胞骨架角蛋白表达阳性;硫酸锌诱导表达的安全剂量为160μmol/L;诱导表达反义bcl-2 RPE大部分细胞bcl-2 表达为阴性,部分弱阳性;在第10d细胞克隆形成率分别为(4.65±0.043)%与(4.85±0.085)%(P >0.05),诱导表达反义bcl-2 的RPE生长曲线在5d后表现为低增生率(P <0.01);柔红霉素作用后G2期细胞由9.9%增加至30.4%;180μg/L柔红霉素作用反义bcl-2转染组TUNEL阳性细胞可见典型凋亡小体。结论:转染可诱导表达的bcl-2 基因的RPE细胞可以进行细胞凋亡的后续研究。     

体外培养的猪眼色素上皮细胞屏障功能的研究

目的 研究体外培养的猪眼视网膜色素上皮（RPE）细胞的血视网膜外屏障功能。 方法 对猪眼RPE细胞进行原代培养，第3代细胞接种于微孔滤器，微孔滤器的滤膜为无聚乙烯吡咯酮（PVP）聚碳酸脂膜（polycarbonate），分别于培养1、2、3、4周对滤膜表面行光学显微镜观察，于培养后2周对膜切面行光学显微镜和透射电子显微镜观察;行跨膜电阻测定并用荧光素钠和辣根过氧化物酶（HRP）进行通透性检测。 结果 成功原代培养了猪眼RPE细胞。光学显微镜观察结果显示，RPE细胞接种1周后，细胞基本汇合，接种后2、3周时RPE细胞密度无明显变化，接种后4周时细胞密度下降;滤膜及细胞标本切面观察结果显示，RPE细胞可在滤膜表面表现出单层有极性生长的特性;接种于微孔滤器2周后，RPE细胞跨上皮细胞电阻达（97.44±11.36） Ω/cm2，并至少持续到接种后3周;通透性检测结果显示，孵育30 min后只有0.27%的荧光素钠和0.17%的HRP从滤膜上方到达下方，分子量小的荧光素钠比分子量大的HRP通透率高。 结论 应用无PVP聚碳酸脂膜的微孔滤器可以建立体外RPE细胞有极性单层生长的模型，并用于屏障功能的研究。 (中华眼底病杂志, 2006, 22: 188-191)     

培养人视网膜色素上皮细胞增生的抑制与Ki-67表达

目的 探讨柔红霉素对视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞增生的抑制及其与Ki-67表达的关系。 方法 用180μg/L柔红霉素作用培养的人RPE细胞12h，之后24 h用氚-标记脱氧胸苷(tritium-labelled thymidine deoxyribose,³H-TdR)掺入法测定DNA合成抑制率，免疫细胞化学染色和定量分析观察Ki-67表达，流式细胞术检测细胞周期变化。 结果 培养人RPE细胞DNA合成抑制率与柔红霉素剂量成正比，对照组和柔红霉素组Ki-67阳性细胞率分别为89.3%和45.6%(P＜0.01)，两组中阳性细胞胞核积分光密度值分别为68.1±6.2和27.3±5.5 (P＜0.01)。柔红霉素组^G₂期细胞比例由8.9%增至29.5%。 结论 柔红霉素使培养人RPE细胞阻滞于^G₂期，抑制了细胞增生；Ki-67表达可以反映RPE细胞的增生抑制。（中华眼底病杂志，2000，16：1-70）     

猪视网膜色素上皮细胞的体外培养与鉴定

目的建立猪视网膜色素上皮（RPE）细胞体外分离、纯化培养体系并进行鉴定,为研究RPE细胞的功能及治疗相关眼底疾病提供细胞来源。方法采用胰蛋白酶消化法获取猪RPE细胞进行原代及传代培养,倒置显微镜观察细胞生长过程及形态变化并计算生长数据,角蛋白和RPE65蛋白抗体免疫细胞化学染色鉴定细胞。结果用胰蛋白酶消化法分离培养的猪RPE细胞生长良好,表现为多边形和梭形两种形态,原代细胞胞浆内含有丰富的色素颗粒,传代细胞内色素颗粒较原代细胞少。免疫组织化学法证实RPE细胞均为鼠抗人角蛋白染色阳性。结论培养的细胞可作为体外猪RPE细胞的来源,体外分离、纯化和培养猪RPE细胞的成功,为RPE细胞功能和相关视网膜疾病的深入研究提供了细胞来源。     

人视网膜色素上皮细胞的冻存和复苏培养

目的：建立人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞的冻存和复苏方法。方法：根据慢冻速融的细胞冻存原则，将原代或传代1～2次培养的人RPE细胞，加入10%二甲基亚砜作为保护剂，液氮中冻存。复苏时将冻存细胞在60℃、2分钟内融化，用台盼蓝染色测定细胞存活率，用抗人角蛋白抗体免疫细胞化学染色作细胞鉴定，每日计算细胞数以确定细胞生长曲线。 结果：经冻存复苏后的RPE细胞的存活率达90%，生长状态与对照组无差异，抗人角蛋白染色阳性，细胞对数生长期在1～4天，群体细胞倍增期约为1.55天。 结论：人RPE细胞液氮冻存可保持生物活性，复苏后生长良好，保持了细胞特征。这可提供细胞系，方便了体外实验，并可能作为RPE细胞移植治疗一些眼底病的细胞库。 （中华眼底病杂志，1997，13：157-159）     

高糖下腺苷A_（2A）受体对人视网膜色素上皮细胞血管内皮生长因子表达的影响

目的研究高糖下腺苷A2A受体对人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）表达的影响。方法体外培养人RPE细胞,应用免疫组化的方法检测腺苷A2A受体在人RPE细胞中的表达;用腺苷A2A受体作用培养的人RPE细胞,将其分为高糖（33mM）＋腺苷脱氨酶（ADA,2U/ml）、高糖＋ADA＋腺苷A2A受体特异性激动剂（CGS21680,50μM）、高糖＋ADA＋CGS21680＋腺苷A2A受体特异性拮抗剂（SCH58261,100μM）,药物组合刺激RPE细胞24h后,裂解细胞提取RNA,同时收集细胞培养液,分别应用real-time PCR和ELISA的方法检测高糖下腺苷A2A受体对人RPE细胞VEGF mRNA和蛋白的影响。结果腺苷A2A受体在RPE细胞中有表达,在高糖条件下,50μMCGS21680可以刺激RPE细胞VEGF mRNA水平升高约2.7倍,蛋白水平升高1.5倍,而再加100μMSCH58261反而使RPE细胞VEGF mRNA较前下降约 40%,蛋白水平较前下降60%。结论在高糖条件下,腺苷A2A受体可以刺激VEGF的合成,因此腺苷A2A受体可能参与糖尿病性视网膜病变新生血管的形成。     

缺氧条件下共培养时观察Mtiller细胞对RPE细胞生长的影响

背景视网膜色素上皮（RPE）细胞和Mtiller细胞在维持视网膜的正常代谢中起重要作用,多种生理、病理过程与二者的相互作用有关。目的利用Transwell小室体外共培养兔Mtiller细胞与RPE细胞,观察缺氧条件下Moller细胞对RPE细胞增生和迁移的影响。方法应用组织块培养法和酶消化法分别培养原代兔Mtiller细胞和RPE细胞,免疫组织化学法鉴定2种细胞。取第3代培养良好的细胞进行试验。应用CoCl2培养细胞以建立细胞化学缺氧模型,分为常氧组和缺氧组,每组又分为对照组（RPE细胞单独培养）、共培养组（MOiler细胞与RPE细胞共同培养）。利用Transwell小室建立Mtiller细胞和RPE细胞的共培养模型,各组分别培养3、6、24、48h,利用MTT法和结晶紫染色法对培养存活的RPE细胞进行计数,检测常氧及缺氧条件下Miiller细胞对RPE细胞增生和迁移的影响。结果原代培养的RPE细胞符合RPE细胞的特征,90％以上呈现CK．18阳性反应。培养的Miiller细胞对胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和S-100染色呈阳性反应。与常氧培养条件比较,缺氧条件下单独培养的RPE细胞增生数量增加,细胞迁移数量增加,差异有统计学意义（P〈0．01）;缺氧条件下与MUller细胞共培养的RPE细胞增生数量和迁移数量明显增加,与常氧组和单细胞培养情况下比较,差异均有统计学意义（P〈0．01）。缺氧条件下,与RPE细胞单细胞培养组比较,共培养组RPE细胞的增生和迁移增加,差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论缺氧可以促进RPE细胞的增生和迁移,Mtiller细胞可以加重缺氧引起的RPE细胞的增生和迁移。