人胰岛素样生长因子腺病毒表达载体构建及其在C17．2神经干细胞的表达

目的：构建人胰岛素样生长因子腺病毒表达载体、并观察其在C17．2神经干细胞的表达。方法：实验于2004-03／11在中山大学附属第二医院林百欣医学中心完成。将胰岛素样生长因子克隆人复制缺陷性腺病毒穿梭质粒得到含胰岛素样生长因子的腺病毒穿梭质粒，再与腺病毒骨架质粒在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组得到含胰岛素样生长因子的整合质粒，在HEK293A细胞中包装加膜，聚合酶链反应鉴定，大量扩增病毒。将含目的基因的病毒转染C17．2神经干细胞，原位杂交检测胰岛素样生长因子mRNA，蛋白印迹检测胰岛素样生长因子蛋白的表达，酶联免疫吸附实验检测胰岛素样生长因子蛋白的表达曲线：结果：经酶切鉴定及聚合酶链反应鉴定证实腺病毒载体构建正确。原位杂交检测到胰岛素样生长因子mRNA，蛋白印迹分析检测到胰岛素样生长因子蛋白在转染了重组腺病毒的C17．2神经干细胞内表达。酶联免疫吸附实验结果显示胰岛素样生长因子蛋白在病毒转染5～7d达高峰，13d仍高于转染前。结论：成功构建了含胰岛素样生长因子的重组腺病毒载体．转染了该腺病毒的C17．2神经干细胞可稳定表达胰岛素样生长因子。     

人HSP75基因重组腺病毒载体构建及在C17.2神经干细胞的表达

目的构建HSP75基因重组腺病毒载体,观察HSP75蛋白在C17.2神经干细胞中的表达。方法采用PCR方法从含人HSP75基因质粒中扩增HSP75基因,连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点区域,构建重组穿梭质粒p HBAd-MCM-HSP75-GFP,在LipofiterTM转染试剂的介导下与腺病毒辅助骨架质粒p HBAd-BHGloxΔE1,3 Cre共转染HEK293细胞,整合包装成重组腺病毒,TCID50法测定病毒滴度。使用荧光显微镜、流式细胞仪和Western blotting观察重组腺病毒在C17.2细胞中的感染情况及HSP75蛋白的表达水平。结果通过酶切鉴定、测序、PCR鉴定,HSP75基因已正确插入穿梭质粒中,并与病毒骨架质粒整合包装成重组腺病毒;重组腺病毒滴度为1.0×1010PFU/ml;Western blotting检测,转染后的神经干细胞表达HSP75蛋白。结论 HSP75重组腺病毒载体成功构建,对C17.2神经干细胞具有较高的表达效力。     

人Persephin基因重组腺病毒载体构建及在C17．2神经干细胞的表达

目的:Persephin是近年来发现的对多巴胺神经元的发育与分化起调控作用重要基因,单纯神经干细胞系C17.2移植治疗帕金森病在体内分化为多巴胺能神经元比例不高。实验构建了人Persephin基因重组腺病毒载体,并观察其在C17.2神经干细胞的表达。方法:实验于2005-06/12在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成(广东省重点实验室)。①实验材料:流产胚胎由中山大学附属第二医院妇产科提供,产妇及其家属均签署知情同意书。病毒骨架质粒载体pAdEasy-1、穿梭载体PAdTrack-CMV(含绿色荧光蛋白基因)、大肠杆菌菌株BJ5183和DH5α、人胚肾293细胞均为本室保存。C17.2神经干细胞由美国哈佛大学医学院Snyder教授惠赠。②实验方法:采用反转录聚合酶链式反应从人胚胎脑获得PersephincDNA。将重组质粒pAdTrack-CMV-Persephin与骨架质粒pAdEasy-1共转染大肠杆菌BJ5183,获得重组腺病毒质粒。将重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得重组腺病毒AdCMVPersephin,转化体外培养的C17.2神经干细胞。③实验评估:用原位杂交、免疫组化、Westernblot法检测Persephin在C17.2神经干细胞中的表达。结果:①人Persephin基因的克隆与测序分析:琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,其Persephin基因片段长约310bp,与预期分子量相符。Persephin基因被克隆于载体pMD18-T,以SaiⅠ和XhoⅠ双酶切可回收长约310bp的克隆片段,测序结果证实所克隆的为人PersephincDNA。②大肠杆菌同源重组获得克隆化重组腺病毒基因组及鉴定:Persephin重组腺病毒质粒pAdTrack-CMV-Persephin用PacⅠ酶切可切出4.1kb的目标片断,PCR鉴定可从重组腺病毒质粒中可扩增出PersephincDNA片断(310bp)。病毒滴度在脂质体转染后为1.9×107pfu/L。用收集的上清4次重复感染293细胞扩增重组腺病毒后,病毒滴度经绿色荧光蛋白检测达3.0×1011pfu/L。③Persephin基因在C17.2神经干细胞中的表达:免疫组化与原位杂交显示转染pAdPersephin的C17.2神经干细胞胞浆中有Persephin蛋白和mRNA表达。提取感染病毒的C17.2神经干细胞的总蛋白,经Westernblot检测可见一特异性蛋白条带存在。结论:采用RT-PCR法成功克隆人PersephincDNA并构建其腺病毒载体,获得了稳定表达Persephin的神经干细胞克隆,为进一步分析转基因神经干细胞治疗神经退行性疾病提供可行的操作方法。     

人血管内皮生长因子165基因转染对C17.2神经干细胞体外增殖分化的影响

目的:构建含有人血管内皮生长因子165基因的重组腺病毒载体,并观察其对C17.2神经干细胞体外增殖和分化的影响.方法:将血管内皮生长因子165基因克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,经酶切线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy共同转染大肠杆菌BJ5183同源重组获得重组腺病毒质粒,将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得有感染能力但复制缺陷的重组腺病毒pAdCMV血管内皮生长因子165,转染体外培养的C17.2神经干细胞.以单纯携带绿色荧光蛋白腺病毒转染为对照1组.通过酶联免疫吸附测定检测其在C17.2神经干细胞中不同时间段的表达.C17.2神经干细胞培养24 h后,将pAdCMV GFP和pAdCMV血管内皮生长因子165转染C17.2神经干细胞(pAdCMV绿色荧光蛋白和pAdCMV血管内皮生长因子165转染组),24,48,72 h后每孔加入四氮唑盐10μL,检测pAdCMV转染对C17.2神经干细胞增殖的影响.将未进行pAdCMV绿色荧光蛋白,pAdCMV血管内皮生长因子165转染C17.2神经干细胞设为对照2组.收集C17.2神经干细胞(C17.2神经干细胞组)和已经转染pAdCMVVEGF165的C17.2神经干细胞(pAdCMV血管内皮生长因子165的C17.2神经干细胞组),对两组细胞进行培养,将上述细胞爬片进行多聚甲醛固定,行巢蛋白和神经元特异性烯醇化酶免疫组化法检测.结果:①重组腺病毒AdCMV血管内皮生长因子165在293细胞中包装成功,病毒滴度达2×1011efu/L.酶联免疫吸附检测转染pAd血管内皮生长因子165的C17.2神经干细胞上清VEGF浓度显示转染后第3天为(710±82)ng/L,明显高于转染前(118±20)ng/L,第5天和第7天血管内皮生长因子165达分泌高峰,分别为(1110±126),(1135±138)ng/L,此后渐下降,于第13天(355±35)ng/L仍显著高于对照1组(¨0±22)ng/L和转染前(t=5.87,P＜0.01).②C17.2神经干细胞培养24,48,72 h后对照2组干细胞增殖率分别为(0.1367 ±0.018 6)%,(0.330 0±0.013 4)%,(0.660 3±0.020 7)%,pAdCMV绿色荧光蛋白转染组C17.2神经干细胞24,48,72 h后干细胞的增殖率分别为(0.139 9±0.018 3)%,(0.373 0±0.013 6)%,(0.671 3±0.233)%;pAdCMV血管内皮生长因子165转染组C17.2神经干细胞24,48,72 h后干细胞的增殖率分别为(0.146 9±0.0171)%,(0.363 1 ±0.013 6)%,(0.635 3±0.024 7)%.两个实验组神经干细胞增殖率与对照组1组比较,P＞0.05.pAdCMV血管内皮生长因子165转染组C17.2神经干细胞增殖率与pAdCMV绿色荧光蛋白转染组比较,P＞0.05).③C17.2神经干细胞组和pAdCMV血管内皮生长因子165转染C17.2神经干细胞组的巢蛋白阳性细胞率分别为(15.72±1.003)%,(17.63±1.082)%,神经元特异性烯醇化酶阳性细胞率分别为(17.63±1.082)%,(21.49±1.022)%,两组比较无明显差异(P＞0.05).结论:成功构建pAdCMV血管内皮生长因子165重组腺病毒,获得了稳定表达血管内皮生长因子165的神经干细胞克隆,体外pAdCMV血管内皮生长因子165未对C17.2神经干细胞增殖和分化产生影响.     

人骨保护素基因重组腺病毒载体在大鼠骨髓基质细胞中的表达效率

目的:构建人骨保护素基因的重组腺病毒载体,并观察在大鼠骨髓基质细胞中的转染能力及表达效率。方法:实验于2004-03/2005-04在第三军医大学完成。采用基因工程技术,将人骨保护素基因片段插入到腺病毒载体质粒pAdTrack-巨细胞病毒上,利用PadEasy系统与骨架质粒在大肠杆菌BJ5183胞内进行同源重组,经293细胞包装、扩增,得到携带人骨保护素基因的重组腺病毒,将携带人骨保护素基因重组腺病毒对大鼠骨髓基质细胞进行感染。采用聚合酶链反应方法对重组腺病毒载体进行鉴定,利用绿色荧光报告基因转染结果,以荧光计数法检测重组腺病毒的滴度,应用Westernblot及酶联免疫吸附法检测骨保护素在大鼠骨髓基质细胞中的表达。结果:①酶切鉴定及聚合酶链反应结果证明人骨保护素基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度可达2.5×109pfu/mL,具有很强感染能力。②人骨保护素基因重组腺病毒载体转染大鼠骨髓基质细胞后48h,Westernblot及酶联免疫吸附法可检测到人骨保护素的蛋白表达。结论:应用细菌内同源重组法,可成功构建含人骨保护素基因重组腺病毒载体,且能高效转染大鼠骨髓基质细胞。     

构建人骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165基因共表达重组腺病毒在兔骨髓基质干细胞中的表达

目的:构建人骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子基因共表达腺病毒并观察其在兔骨髓基质干细胞中的表达。方法:实验于2005-03/12在解放军第四军医大学唐都医院全军骨肿瘤研究所完成。①分别克隆人骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子基因,分别依次亚克隆至穿梭载体构建重组穿梭质粒pAdT-B2V并酶切鉴定;后经PmeI酶切线性化后与骨架质粒感受态细胞AdEasier-1Cells经电穿孔法同源重组得到腺病毒质粒pAdBMP-7并酶切鉴定。②PacI酶切线性化后的pAdBMP-7腺病毒质粒转染293细胞包装后获得复制缺陷型重组腺病毒AdBMP-7,在荧光显微镜下计算表达绿色荧光蛋白细胞个数,测定AdB2V滴度。③将AdBMP-7体外感染兔骨髓基质干细胞后,以荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达及反转录-聚合酶链反应方法鉴定外源基因的表达,以β-肌动蛋白为内参照,未感染细胞为对照。④AdB2V感染兔骨髓基质干细胞后72h以免疫细胞化学染色方法检测外源基因的表达,以未感染组为对照。结果:①酶切鉴定表明外源基因已插入到pAdTrack-CMV穿梭质粒且腺病毒重组质粒pAdBMP-7构建成功。②经293细胞包装3d后可观察到绿色荧光蛋白表达,氯化铯梯度离心法最终获得约3×109efu/L滴度的重组腺病毒。③体外感染兔骨髓基质干细胞后荧光显微镜观察及反转录-聚合酶链反应证实外源基因可在兔骨髓基质干细胞中表达,未感染组为阴性。④AdB2V感染兔骨髓基质干细胞后以免疫细胞化学染色均观察到外源基因的阳性表达,未感染组呈阴性表达。结论:成功构建人骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165基因共表达重组腺病毒,证实了其在兔骨髓基质干细胞的表达,为骨再生的局部联和基因治疗打下基础。     

绿色荧光蛋白标记的大鼠胶质细胞源性神经营养因子重组腺病毒载体的构建及其表达

目的:构建大鼠胶质细胞源性神经营养因子基因的重组腺病毒并观察其在神经干细胞上的表达,探索胶质细胞源性神经营养因子作为基因治疗神经病变的价值。方法:实验于2004-8/12在四川大学华西医院眼疾病分子遗传实验室进行。以新生SD大鼠大脑皮层细胞RNA为模板,反转录聚合酶链反应扩增出全长的胶质细胞源性神经营养因子基因,经测序验证后,亚克隆至穿梭质粒pAdTrackCMV中,与骨架质粒pAdEasy1同源重组为腺病毒载体。线形化后转染293细胞进行包装扩增,利用AdEasy1系统上的绿色荧光蛋白鉴定病毒表达,并用病毒上清转化大鼠神经干细胞,检测胶质细胞源性神经营养因子基因的表达。结果:①胶质细胞源性神经营养因子基因扩增后进行测序显示扩增片段为653bp个核苷酸,同源性比较该序列正确。②重组腺病毒载体经酶切验证为阳性克隆,转染293细胞包装后的病毒滴度为1x109PFU/mL。③转入胶质细胞源性神经营养因子的重组腺病毒的神经干细胞扩增出653bp的带。结论:成功构建了胶质细胞源性神经营养因子重组腺病毒并见其在大鼠神经干细胞中进行了表达。     

人骨保护素基因重组腺病毒载体在大鼠骨髓基质细胞中的表达效率

目的：构建人骨保护素基因的重组腺病毒载体，并观察在大鼠骨髓基质细胞中的转染能力及表达效率。方法：实验于2004-03／2005-04在第三军医大学完成。采用基因工程技术，将人骨保护素基因片段插入到腺病毒载体质粒pAdTrack-巨细胞病毒上，利用PadEasy系统与骨架质粒在大肠杆菌BJ5183胞内进行同源重组，经293细胞包装、扩增，得到携带人骨保护素基因的重组腺病毒，将携带人骨保护素基因重组腺病毒对大鼠骨髓基质细胞进行感染。采用聚合酶链反应方法对重组腺病毒载体进行鉴定，利用绿色荧光报告基因转染结果，以荧光计数法检测重组腺病毒的滴度，应用Westernblot及酶联免疫吸附法检测骨保护素在大鼠骨髓基质细胞中的表达。结果：①酶切鉴定及聚合酶链反应结果证明人骨保护素基因重组腺病毒载体构建成功，病毒滴度可达2．5&;#215;10^9pfu／mL，具有很强感染能力。②人骨保护素基因重组腺病毒载体转染大鼠骨髓基质细胞后48h，Westernblot及酶联免疫吸附法可检测到人骨保护素的蛋白表达。结论：应用细菌内同源重组法，可成功构建含人骨保护素基因重组腺病毒载体，且能高效转染大鼠骨髓基质细胞。     

构建人骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165基因共表达重组腺病毒在兔骨髓基质干细胞中的表达

目的：构建人骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子基因共表达腺病毒并观察其在兔骨髓基质干细胞中的表达。 方法：实验于2005-03／12在解放军第四军医大学唐都医院全军骨肿瘤研究所完成。①分别克隆人骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子基因，分别依次亚克隆至穿梭载体构建重组穿梭质粒pAdT-B2V并酶切鉴定；后经PmeI酶切线性化后与骨架质粒感受态细胞AdEasier-1 Cells经电穿孔法同源重组得到腺病毒质粒pAdBMP-7并酶切鉴定。②PacI酶切线性化后的pAdBMP-7腺病毒质粒转染293细胞包装后获得复制缺陷型重组腺病毒AdBMP-7，在荧光显微镜下计算表达绿色荧光蛋白细胞个数，测定AdB2V滴度。③将AdBMP-7体外感染兔骨髓基质干细胞后，以荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达及反转录-聚合酶链反应方法鉴定外源基因的表达，以B-肌动蛋白为内参照，未感染细胞为对照。④AdB2V感染兔骨髓基质干细胞后72h以免疫细胞化学染色方法检测外源基因的表达，以未感染组为对照。 结果：①酶切鉴定表明外源基因已插入到pAdTrack—CMV穿梭质粒且腺病毒重组质粒pAdBMP-7构建成功。②经293细胞包装3d后可观察到绿色荧光蛋白表达，氯化铯梯度离心法最终获得约3&;#215;10^9 efu／L滴度的重组腺病毒。③体外感染兔骨髓基质干细胞后荧光显微镜观察及反转录-聚合酶链反应证实外源基因可在兔骨髓基质干细胞中表达，未感染组为阴性。④AdB2V感染兔骨髓基质干细胞后以免疫细胞化学染色均观察到外源基因的阳性表达，未感染组呈阴性表达。 结论：成功构建人骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165基因共表达重组腺病毒，证实了其在兔骨髓基质干细胞的表达，为骨再生的局部联和基因治疗打下基础。     

绿色荧光蛋白标记的大鼠胶质细胞源性神经营养因子重组腺病毒载体的构建及其表达

目的：构建大鼠胶质细胞源性神经营养因子基因的重组腺病毒并观察其在神经干细胞上的表达，探索胶质细胞源性神经营养因子作为基因治疗神经病变的价值。方法：实验于2004-8／12在四川大学华西医院眼疾病分子遗传实验室进行。以新生SD大鼠大脑皮层细胞RNA为模板，反转录聚合酶链反应扩增出全长的胶质细胞源性神经营养因子基因，经测序验证后，亚克隆至穿梭质粒pAdTrack CMV中，与骨架质粒pAdEasy 1同源重组为腺病毒载体。线形化后转染293细胞进行包装扩增，利用AdEasy 1系统上的绿色荧光蛋白鉴定病毒表达，并用病毒上清转化大鼠神经干细胞，检测胶质细胞源性神经营养因子基因的表达。结果：①胶质细胞源性神经营养因子基因扩增后进行测序显示扩增片段为653bp个核苷酸，同源性比较该序列正确。②重组腺病毒载体经酶切验证为阳性克隆，转染293细胞包装后的病毒滴度为lxl09PFU／mL。③转入胶质细胞源性神经营养因子的重组腺病毒的神经干细胞扩增出653bp的带。结论：成功构建了胶质细胞源性神经营养因子重组腺病毒并见其在大鼠神经干细胞中进行了表达。     

Stathmin特异性siRNA表达质粒抑制stathmin的表达

目的:构建微管解聚蛋白stathmin基因的特异性siRNA质粒表达载体,以便研究stathmin在鼻咽癌中的生物学作用。方法:合成stathmin特异性DNA片段,退火形成的双链DNA片段克隆于质粒表达载体pGenesil-1.3;载体经扩增后,进行酶切和测序鉴定;采用QIAGEN公司脂质体(effectenetransfectionreagent)将鉴定后的重组质粒转入鼻咽癌CNE2细胞;RT-PCR与Westernblot检测stathmin基因表达。结果:酶切和测序分析表明,插入siRNA质粒表达载体中的DNA片段,其碱基序列和插入方向正确。表达分析证实特异性siRNA质粒表达载体能有效抑制鼻咽癌CNE2细胞中stathmin的表达。结论:构建的siRNA质粒表达载体对stathmin的表达有很好的抑制作用。     

SPACR原核表达载体的构建和表达

目的构建Sialoprotein associated with cones and rods（SPACR）原核表达载体并高效表达。方法根据基因文库中SPACR基因的cDNA序列设计引物,采用PCR方法扩增SPACR cDNA片段,并克隆进原核表达载体pGEX-6P-1中,转化于大肠杆菌BL21,测序鉴定后,用IPTG诱导表达出目的蛋白,经谷胱甘肽琼脂糖柱柱层析纯化,收获表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western blot鉴定。结果 PCR后扩增得到的目的片段,经酶切鉴定及DNA序列测定,证实重组载体pGEX-6P-1-SPACR构建正确,表达蛋白分子量约为分别为21.2、22.6、36.2及20.8kDa。结论在大肠杆菌中获得了SPACR片段的高效表达,为研究其蛋白功能奠定了基础。     

人Regucalcin cDNA真核表达载体的构建及表达

目的构建人regucalcin（RGN）全长cDNA的真核表达载体，观察其在人肾皮质近曲小管上皮细胞（HK-2细胞）中表达。方法用RT-PCR技术扩增获得人HK-2细胞RGN全长cNDA，将扩增的产物连接入pMD18-T克隆载体上。将重绢质粒转化人大肠杆菌DHSa内并提取质粒，双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确，再用双酶切方法将RGN基因定向连接到真核表达载体DECFP-NI中，构成pEGFP-RGN，将pEGFP-RGN转化人大肠杆菌DHSa内并提取质粒，双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确。再用双酶切方法将RGN基因与EGFP定向连接到真核表达载体pcDNA3．1（＋）-zeocin中，构建真核表达pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo的重组体。将pcDNA3．1-RGN．EGFP-zeo转化人大肠杆菌DHSa内并提取质粒，双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确，用脂质体转染入HK-2细胞。荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo表达情况。结果RGNcDNA全长是897bp。以此构建的pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo真核表达载体，经DNA测序与GenBank中的人RGNcDNA序列一致。荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察到pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo转染的细胞中有绿色荧光蛋白的表达。结论本实验成功构建了pcDNA3．1-RGN．EGFP．zeO真核表达质粒，并在HK-2细胞中表达。     

人regucalcin cDNA高表达重组质粒的构建及其在原核细胞中的表达

目的 原核表达获得大量人regucalcin（RGN）蛋白。方法 用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术从人。肾皮质近曲小管上皮细胞（HK-2）中扩增RGN全长cDNA，将扩增的产物连接于测序载体pMD18-T，测序鉴定准确后，进行酶切，将正确的RGN全长cDNA与原核表达载体pET42b（＋）构建成重组质粒pET42b（＋）-RGN。将pET42b（＋）-RGN先转化入大肠杆菌DH5α，提取质粒经双酶切鉴定正确后，再转化入表达宿主大肠杆菌DE3菌株。对转化菌株进行诱导、破菌，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）与免疫印迹分析，鉴定RGN融合蛋白质表达的正确性。RGN重组融合蛋白经Ni^2＋亲和层析纯化，达电泳纯。结果 构建了重组质粒pET42b（＋）-RGN并获得高效表达，RGN重组融合蛋白经异丙基硫化-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导后以包涵体形式存在，表达的蛋白质相对分子质量为34000。结论 人RGN蛋白在pET42b（＋）原核表达载体可获得高效表达，为进一步了解RGN蛋白质的结构、功能及其抗体的制备等奠定了基础。     

人regucalcin cDNA高表达重组质粒的构建及其在原核细胞中的表达

目的原核表达获得大量人regucalc in(RGN)蛋白。方法用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2)中扩增RGN全长cDNA,将扩增的产物连接于测序载体pMD18-T,测序鉴定准确后,进行酶切,将正确的RGN全长cDNA与原核表达载体pET42b( )构建成重组质粒pET42b( )-RGN。将pET42b( )-RGN先转化入大肠杆菌DH5α,提取质粒经双酶切鉴定正确后,再转化入表达宿主大肠杆菌DE3菌株。对转化菌株进行诱导、破菌,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与免疫印迹分析,鉴定RGN融合蛋白质表达的正确性。RGN重组融合蛋白经N i2 亲和层析纯化,达电泳纯。结果构建了重组质粒pET42b( )-RGN并获得高效表达,RGN重组融合蛋白经异丙基硫化-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后以包涵体形式存在,表达的蛋白质相对分子质量为34 000。结论人RGN蛋白在pET42b( )原核表达载体可获得高效表达,为进一步了解RGN蛋白质的结构、功能及其抗体的制备等奠定了基础。     

Imaging gene expression

Genome-wide sequencing and increasing use of microarrays has resulted in the identification of a large number of new genes which may have important functional roles in development and onset of disease. Classical approaches in gene expression studies fall short in providing information about cellular localization of these genes and their relative levels of expression in tissues. Rapid determination of gene expression can be achieved with in situ methods of localization of gene expression in combination with recent developments in imaging technology.     

SARS病毒M蛋白真核表达载体的构建与表达

目的 构建SARS病毒M蛋白片段真核表达载体,并检测其在Vero细胞中的表达.方法 在PCR引物下游引入Flag序列,以PCR从质粒pGEX-6P-1-SARS-M中扩增M蛋白编码基因片段,将酶切后的PCR产物克隆至pcDNA3.1(+)中,构建并鉴定重组质粒pcDNA3.1(+)-SARS-M.重组质粒经Superfect转染Vero细胞,Western blot检测基因表达情况.结果 重组质粒经酶切鉴定和基因测序显示构建正确;Western blot检测表明重组M蛋白片段在Vero细胞中获得正确表达.结论 成功构建SARS病毒M蛋白片段真核表达载体,并在Vero细胞中获得正确表达,为进一步研究M蛋白的功能奠定了基础.