miR-21真核表达载体的构建及其活性鉴定

目的:构建miR-21的真核表达载体, 并使其在骨肉瘤MG63细胞中表达, 为研究miR-21对骨肉瘤细胞MG63的作用打下基础.方法:根据miRNA的成熟序列以及附近约200多碱基共433个碱基序列, 设计PCR引物, PCR扩增, 退火后用T4连接到线性化的pcDNA3.1(+)质粒中, 并对重组质粒进行双酶切、菌落PCR及测序分析, 鉴定完全正确的重组质粒转染骨肉瘤细胞MG63, G418(400 mg/L)筛选4周获得miR-21稳定表达细胞系, 用Northern blot及real time RT-RCR法鉴定pcDNA3.1(+)-miR-21可在真核细胞中过表达.结果:成功构建了miR-21的真核表达载体, 并获得稳定转染重组质粒的细胞系.结论:miR-21的真核表达载体在骨肉瘤细胞MG63中稳定高表达, 为进一步研究miR-21在骨肉瘤MG63中的功能及基因调控机制奠定了实验基础.     

人RASSF1A基因的真核表达载体的构建及其表达

目的 通过构建人RASSF1A基因的真核表达载体,为研究其在肿瘤细胞凋亡、细胞周期阻滞、细胞增殖抑制等方面奠定基础.方法 采用RT-PCR从人外周血的单个核细胞RNA中扩增出人RASSF1A基因的全长cDNA,利用DNA重组技术将其插入到真核表达栽体pcDNA3.1(+)中获得重组质粒.利用脂质体将重组质粒转染入人鼻咽癌细胞株CNE-2中,采用RT-PCR.westem-blot检测RASSF1A的瞬时表达.结果 酶切图谱分析及基因测序证明人RASSF1A基因已被完整、正确地插入到pcDNA3.1(+)质粒载体中,RT-PCR及Western-blot结果显示转染细胞的RASSF1A表达水平上调.结论 成功构建了RASSF1A基因的真核表达栽体pcDNA3.1(+)/RASSF1A.     

人PRMT1真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建人PRMT1基因真核表达载体,并进行表达检测及鉴定。方法:采用RT-PCR技术扩增人PRMT1全长cDNA;经过双酶切、连接等反应,构建pcDNA3.1(+)-PRMT1真核表达载体,并转化DH5α感受态细胞;用含氨苄青霉素的LB培养基筛选阳性克隆;经菌液PCR及测序鉴定重组质粒;瞬时转染A549细胞,采用实时定量PCR检测重组质粒的表达水平及PRMT1对eotaxin-1和ccr-3表达的影响。通过Western blot从蛋白水平检测重组质粒在真核细胞内的表达。结果:RT-PCR扩增的人PRMT1全长cDNA为1136 bp;所筛选出的pcDNA3.1(+)-PRMT1重组载体中插入片段与NCBI GenBank文库中人PRMT1 cDNA的序列完全一致;实时定量PCR和Western blot检测证实重组质粒在A549细胞内可高效表达;并且PRMT1与eotaxin-1和ccr-3的表达呈正相关性。结论:成功构建了pcDNA3.1(+)-PRMT1重组载体,为进一步研究PRMT1基因的作用机制奠定基础。     

抗mdr1 RNA干扰真核表达载体的构建

目的：构建抗mdr1 RNA干扰真核表达栽体。方法：根据Reynolds的设计原则．针对mdr1的序列及二级结构选择了三条靶序列,人工合成三条shRNA序列的编码DNA序列,重组入Pgenesil-1栽体中．转化大肠杆菌DH5α,碱裂解法提质粒,酶切及测序鉴定。结果：用PstⅠ和SalⅠ酶切鉴定质粒Pmdr1sh1、Pmdr1sh2、Pmdr1sh3均符合设计要求,测序证实序列完全正确。结论：通过酶切和测序鉴定重组质粒Pmdr1sh1、Pmdr1sh2、Pmdr1sh3插入位点正确,与设计序列一致．预期可用于逆转mdr1所致耐药。     

日本血吸虫卵壳蛋白基因的克隆及真核表达载体的构建

血吸虫卵壳蛋白基因是探讨血吸虫病免疫预防的重要靶标。本研究根据已发表的多个血吸虫卵壳蛋白基因的核苷酸序列,设计合成了特异引物,体外扩增和克隆了编码日本血吸虫中国大陆株卵壳蛋白基因SjESG的cDNA,测序结果表明与已发表的卵壳蛋白基因序列有较高同源性。为进一步研究该基因的功能,将其克隆入pcDNA3中,成功构建了真核表达载体,为SjESGDNA疫苗的研究打下了基础。     

Trim6真核表达载体的构建及表达

目的:构建人Trim6的真核表达载体pcDNA3.1(+ )-Trim6,并观察其在HEK293T细胞中的表达.方法:提取HeLa细胞总RNA,用RT-PCR方法扩增出Trim6编码区全长基因片段,克隆到pcDNA3.1(+),通过酶切、菌落PCR及测序进行鉴定.将该载体转染HEK293T细胞,用蛋白印迹检测Trim6蛋白的表达.结果:通过酶切、PCR及测序鉴定,成功构建人Trim6表达载体,该载体可以在HEK293T细胞细胞系中表达Trim6.结论:构建Trim6真核表达载体pcDNA3.1(+)-Trim6,为研究Trim6在固有免疫应答中的作用奠定了基础.     

人生长激素基因真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建人生长激素的真核细胞表达载体,测定并分析目的 基因序列.方法 用PCR方法扩增出人生长激素基因,连接至T克隆载体,然后分别亚克隆至真核细胞表达载体pCDNA3.1、pCEP4中.使用DNA ssist软件分析序列.结果 所构建真核表达载体的酶切鉴定、PCR鉴定、测序鉴定均正确.结论 成功构建出多个人生长激素基因真核细胞表达载体,验证了基因序列的正确性,为下一步基因治疗研究打下基础.     

ABO血型基因及亚型真核表达载体的构建及鉴定CSCD

目的构建人ABO血型A101、B101及其CisAB01、Ae105、B（A）04和Bw03亚型真核表达载体,为研究ABO血型基因及砸型基因的功能奠定基础。方法从已知ABO基因分型的标本中（A101,B101）提取总RNA,将其逆转录合成cDNA,经特异性引物扩增目的基因片段,将其定向连接到pcDNA3．1（＋）真核表达载体;采用定点突变PCR的方法构建CisAB01、Ael05、B（A）04和Bw03亚型真核表达载体,通过测序鉴定其序列正确。将ABO血型A101、B101及其CisAB01、Ael05、B（A）04和Bw03亚型真核表达载体分别转染Hela细胞系,通过免疫荧光和Western印迹检测各ABO基因在细胞中的表达。结果测序结果显示扩增到的A101及B101cDNA以正确序列和方式插入载体,CisAB01、Ael05、B（A）04和Bw03亚型真核表达载体的测序结果显示相应位点均成功突变;免疫荧光和Western印迹结果显示A101、B101及其CisAB0l、Ael05、B（A）04和Bw03亚型在Hela细胞中均有表达。结论成功构建了ABO血型基因及亚型基因真核表达载体,体外转染Hela细胞成功表达糖基转移酶,为后续研究奠定了基础。     

活化的蛋白激酶C受体1真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建活化的激酶C受体1(RACK1)WD1-4真核表达载体,通过细胞转染和Western blot鉴定其是否在细胞中表达。方法:应用PCR法扩增RACK1蛋白中第1～4个WD40区域的片段,将其与PGEM-T载体连接,测序后再将其克隆至pEGFP-N1中。采用脂质体法将重组质粒转染至293T细胞中,观察其在真核细胞中的表达,并用Western blot法进行鉴定。结果:pEGFP-N1-RACK1(WD1-4)重组质粒经酶切鉴定及测序证实,目的基因的序列完全正确。荧光显微镜观察发现,转染了重组质粒的细胞株可见绿色荧光融合蛋白的表达,Western blot结果进一步证实了上述结果。结论:成功构建pEGFP-N1-RACK1(WD1-4)重组质粒且进行了真核表达,为下一步研究RACK1蛋白的功能奠定了基础。     

小鼠pEGFP-Hoxa11真核表达载体的构建及表达

目的 构建和鉴定Hoxa11和EGFP双基因共表达真核载体.方法 采用DNA重组技术,将目的 基因Hoxa11克隆至含有报告基因EGFP的pEGFP-N1真核表达载体中,构建的真核表达载体pEGFP-Hoxa11经PCR,双酶切及基因测序鉴定;转染至CHO细胞,荧光显微镜下观察重组质粒的表达,提取细胞蛋白Western...     

人骨形成蛋白2基因克隆及真核表达载体的构建

在大肠杆菌中克隆人骨形成蛋白2基因并获得真核表达载体。由人成骨瘤细胞中提取总RNA，利用逆转录PCR方法扩增获得人骨形成蛋白2基因cDNA；将此基因片段重组到pGEM-T克隆载体中，转化到大肠杆菌DH5α后，蓝白斑筛选阳性克隆，利用限制性酶切、PCR扩增和核苷酸序列分析鉴定重组质粒；将pGEM-T克隆载体中人骨形成蛋白2基因重组到pcDNA3．1真核表达载体中，用限制性酶切和PCR扩增鉴定重组质粒。结果表明：重组在两种质粒中的基因片段为人骨形成蛋白2基因全编码序列。克隆获得人骨形成蛋白2基因．并得到此基因的真核表达载体，为人骨形成蛋白2的表达打下了基础。     

人α-防御素-1(α-HNP-1)基因真核表达载体的构建及在大鼠骨髓间充质干细胞中的转染表达

目的构建人α-防御素-1(α-HNP-1)基因的真核表达载体,并且转染大鼠骨髓间充质干细胞。方法提取人外周血粒细胞中的总RNA,反转录为cDNA作为模板,采用PCR的方法扩增得到人α-防御素-1(α-HNP-1)的基因片断。将扩增产物连接入pGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,蓝白筛选,对PCR及酶切鉴定含有目的片断的克隆进行测序。经测序证实无误后,将获得的pGEM-T-HNP-1重组质粒上的α-HNP-1基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)上,构建HNP-1的真核表达载体pcDNA3.1-HNP-1。将真核表达载体pcDNA3.1-HNP-1用脂质体法转染原代大鼠骨髓间充质干细胞,用免疫组化法检测α-HNP-1的表达。结果获得预期大小为303bp的RT-PCR产物;经PCR、酶切鉴定和DNA测序分析证实重组质粒载体pcDNA3.1-HNP-1构建正确;免疫组化法显示转染细胞呈阳性反应。结论成功构建HNP-1基因的真核表达载体,并且在大鼠骨髓间充质干细胞中能成功表达。     

表达人白细胞介素10的逆转录病毒载体的构建

目的 建立一个表达人白细胞介素10(human Interleukin 10,hIL—10)的重组逆转录病毒载体基因转移系统,为下一步的研究工作做准备.方法 用限制性内切酶消化,提取和纯化质粒puhIL—10中hIL全长 cDNA,重组到逆转录病毒载体 pLXSN上,采用斑点杂交筛选,限制性内切酶消化,电泳鉴定分析.结果外源性hIL—10基因成功构建到逆转录病毒载体pLXSN上.结论表达人白细胞介素10的逆转录病毒载体的成功构建,为今后研究hIL—10的作用机制及在治疗疾病中的应用打下了基础.     

重组纤溶酶原Kringle 5区基因杆状病毒载体的构建及表达研究

目的克隆人源性纤溶酶原Kringle5(K5)基因,构建K5分泌型杆状病毒载体,并检测其在肌细胞中的表达。方法引物中加入前胰岛素原信号肽基因序列,PCR产物经Age Ⅰ和Acc Ⅰ双酶切后装入pFB载体中构建为pFBK5,将其转染肌细胞C2C12,经Western印迹检测重组蛋白的表达并用MTT试验进行初步活性鉴定。结果成功扩增出了K5基因序列,测序正确,转染了pFBK5的C2C12细胞及上清中均检测到了特异性的14 ku蛋白条带且其对ECV304细胞产生剂量依赖性抑制作用,而转染空载体对照组无相应蛋白表达。结论人源性纤溶酶原K5分泌型杆状病毒载体构建成功,表达的重组蛋白具有生物活性,为进一步的病毒制备奠定了基础。     

稳定表达组织型纤溶酶原激活因子基因的人脐静脉内皮细胞株的建立

为建立稳定表达组织型纤溶酶原激活因子(t-PA)基因的人脐静脉内皮细胞株,为其在基因修饰的组织工程血管中的应用奠定基础。首先构建t-PA基因的真核表达载体pcDNA3.1-Myc-HisB(-)/t-PA,将该表达载体用阳离子脂质体介导,转染人脐静脉内皮细胞系细胞,经G418筛选,获得阳性细胞克隆,扩增后分别用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫印迹(Western-blotting)检测t-PA转录和蛋白表达水平,用底物发色法检测t-PA的活性。逆转录聚合酶链反应检测出了t-PA的稳定转染细胞克隆,免疫印迹证实该克隆细胞有含Myc标签的t-PA蛋白表达,底物发色法检测发现其表达产物的活性增加。结果证明成功建立了稳定表达t-PA基因的人脐静脉内皮细胞株。     

组织型纤溶酶原激活物基因的DNA改组

目的：探索利用DNA改组（DNAshuffling)技术，获得更高活性tPA的可能性。方法：以人，恒河猴及大白鼠tPAcDNA为一组基因，进行tPA的DNA改组（DNAfamily shuffling)。以改组后构建的tPA多样性文库转染CHO细胞并进行克隆和筛选。结果：得到了两株有意义的克隆；t9和t17，其中t9克隆表达的tPA活性略高于人tPA，初步的比活性测定结果表明，活性约提高4倍。t17克隆表达的tPA虽然有88个氨基酸的缺失，但仍表现出与人tPA相同的活性，两株克隆经测序证明，为改组后的基因，其序列以人和恒河猴的tPAcDNA序列为主，少数序列来源于大白鼠tPAcDNA。结论：这一探索性结果将为后续几轮的tPADNA改组探明道路，为最终从改组后tPA多样性基因库中筛选到比较理想的重组体打下基础。     

小鼠H2B-GFP真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建小鼠H2B-绿色荧光蛋白（GFP）真核表达载体,为动态观察小鼠细胞中染色体的形态变化,进一步研究小鼠耐药细胞中双微体（DMs）的形成机制提供有效的分子工具。方法 利用RT-PCR的方法获得小鼠H2B cDNA,以羧基端插入pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO载体上,构建H2B-GFP真核表达载体,经菌液PCR、酶切及DNA测序鉴定插入片段大小、方向及序列的正确性,提取质粒转染小鼠胚胎成纤维细胞系NIH3T3进行鉴定。结果 经菌液PCR、酶切和测序,证明小鼠H2B-GFP真核表达载体含有大小、方向及序列正确的H2B cDNA片段,转染NIH3T3后在细胞核中表达。结论 作者成功构建了同时携带有G418筛选位点及多酶切位点的小鼠H2B-GFP真核表达载体,为其在小鼠体外培养细胞中的表达奠定了基础。     

尿激酶型纤溶酶原激活因子cDNA的克隆与原核表达

目的构建尿激酶型纤溶酶原激活因子（uPA）原核表达质粒,并在大肠埃希菌BL21中表达,为进一步研究uPA奠定基础。方法应用逆转录RT—PCR,从人肝细胞cDNA中扩增人尿激酶型纤溶酶原激活因子基因序列,与原核表达质粒pET32a重组,获得表达质粒uPA—pET32a。用氨苄青霉素平板筛选转化子。双酶切与DNA测序进行鉴定,用IPTG诱导表达,并用Westernblotting进行鉴定。结果从肝细胞cDNA中扩增的uPA基因片段长1296bp,酶切及DNA测序证实uPA-pET32a重组质粒构建正确,表达融合蛋白分子量约为68900Mr,经Western blotting证实为目的蛋白。结论成功构建了重组原核表达质粒uPA—pET32a。并能在大肠埃希菌内表达,所表达的融合蛋白分子量大小与预期的相一致．为进一步的研究奠定了基础。     

IFITM3真核表达载体的构建和细胞内定位研究

目的构建人干扰素诱导的跨膜蛋白3(IFITM3)的真核表达载体并观察其表达产物的细胞内定位,以研究IFITM3的蛋白功能及作用机制。方法提取人外周血淋巴细胞mRNA,行RT-PCR扩增IFITM3编码序列并经琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小,PCR产物及真核表达载体pEGFP-C2经酶切、连接、转化入Top10菌株进行筛选和扩增,重组的pEGFP-C2-IFITM3载体用酶切及DNA测序鉴定其插入序列的正确性,进而转染该重组真核表达载体进入sy5y细胞,倒置荧光共聚焦显微镜观察融合蛋白在细胞内定位。结果琼脂糖凝胶电泳显示经RT-PCR的扩增产物与IFITM3编码区的实际长度相吻合,重组入绿色荧光载体pEGFP-C2的pEGFP-C2-IFITM3经酶切和测序显示实际连入的DNA片段大小、序列及读码框均正确。经真核表达后,重组蛋白定位于细胞膜和在细胞内存在颗粒样聚集。结论成功构建IFITM3的真核表达载体,该载体表达的IFITM3融合蛋白在细胞内定位清晰,为后续的IFITM3功能研究奠定了基础。     

Tissue- and Urokinase-Type Plasminogen Activators and Type 1 Plasminogen Activator Inhibitor in Melanomas and Benign Skin Pigment Neoplasms

The content of urokinase- and tissue-type plasminogen activators and plasminogen activator inhibitor PAI-1 in the cytosol of primary and metastatic melanomas and benign skin pigment neoplasms was estimated by enzyme immunoassay. It was shown that local growth and invasion of melanomas are related to suppressed expression of tissue plasminogen activator. The content of urokinase plasminogen activator increases in patients with distant metastases and large thickness of the primary tumor.