冻存前后骨髓间充质干细胞的生物学特性和支持造血的研究

为了了解冻存复苏过程对骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcell,MSC)生物学特性和支持造血能力的影响,采用常规方法分离培养骨髓MSC,将传代后的细胞用含10%二甲亚砜、40%胎牛血清的IMDM细胞冻存液保存在-196℃液氮中,观察短期(4周)和中期(9-15月)复苏后MSC的活性、免疫表型、多向分化能力和支持造血的能力,并同冻存前的MSC进行比较。结果表明:中短期冻存后的MSC的细胞活性分别为(90士3.75)%和(93士2.51)%;冻存后细胞的增殖能力、免疫表型、体外分化为脂肪和骨细胞的能力、支持集落(CFU-GM,CFU-E,CFU-GEMM)的生长作用和冻存前MSC相似。结论:骨髓MSC在液氮中短期和中期保存后,细胞活性略有下降,但是并不影响MSC的增殖、分化和支持造血能力。     

分离培养方法及冻存技术对犬骨髓间充质干细胞生长和增殖的影响

背景：骨髓间充质干细胞在体外长期培养易发生自发分化，而失去多分化潜能，因此必须对培养的细胞及时冻存，需要时再进行复苏。目的：建立犬骨髓间充质干细胞体外分离、培养、增殖、冻存的方法。设计、时间及地点：对照观察细胞学实验，于2005-06／2008—06在浙江中医药大学附属第一医院骨伤研究所完成。材料：健康成年雄性Beagle犬用于骨髓间充质干细胞的提取。方法：采用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化骨髓间充质干细胞，并进行传代扩增培养。将第2代骨髓间充质干细胞与12．5％DMSO混匀置于冻存管中，采用慢冻快融法进行冻存和复苏：将冻存管置于-4℃冰箱2h，然后移入-30℃冰箱2h，再置于厚壁塑料泡沫盒中，扎紧密封，置-80℃冰箱过夜后，取出冻存管直接放入液氮中保存，或放入-80℃冰箱保存。复苏时将冻存管从液氮或80℃冰箱中取出，立即置37℃水浴并轻轻摇动，1-2min内迅速解冻。主要观察指标：复苏前后细胞成生长活性及形态变化。结果：分离的骨髓间充质干细胞为以均一的梭形的成纤维细胞样贴壁生长，贴壁及增殖能力强，传代细胞贴壁较快。经过液氮长期冻存后，将复苏后的骨髓间充质干细胞再培养，细胞形态及生长状态与冻存前无差异，均呈长梭形均匀分布生长，细胞生长增殖旺盛。结论：采用密度梯度离心法结合贴壁培养法町获得犬骨髓间充质干细胞，应用慢冻快融技术进行冻存和复苏，较好的保持了冻存细胞的活力和功能。     

优化骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的研究

目的:探讨全骨髓贴壁培养大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的优化方法.方法:全骨髓贴壁法分离、体外培养原代大鼠骨髓MSC,种植后3h首次换液,培养前72 h内频繁换液;通过流式细胞学方法检测原代培养细胞的MSC特征性表面标记的表达及比例;通过体外培养诱导成脂、成骨、成软骨分化,确立原代培养骨髓MSC的多向分化潜能.结果:早期、频繁换液的方法分离培养大鼠骨髓MSC,P0 MSC以单克隆生长,呈典型漩涡状排列,细胞形态均一;P1细胞均一表达CD29、CD44,不表达CD34、CD45;原代培养骨髓MSC具有成脂、成骨、成软骨分化潜能.结论:全骨髓贴壁法分离培养大鼠原代骨髓MSC,早期、频繁换液有助于在早期获得高纯度细胞,原代细胞具有多向分化潜能.早期、频繁换液的全骨髓贴壁法是体外分离培养骨髓MSC的优化方法.     

黄体酮诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞实验研究

目的：体外定向诱导大鼠骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞。方法：通过贴壁法分离大鼠MSC，体外扩增培养，黄体酮定向诱导。MSC分化为类神经元样细胞。光镜下观察细胞形态，免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志。结果：大鼠骨髓间质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。黄体酮诱导3h后大部分MSC转变为神经元样细胞，出现胞体和突起，免疫细胞化学染色NSE、Nestin呈阳性、GFAP阴性。结论：大鼠骨髓间质干细胞可在体外诱导分化为神经元样细胞。     

成人和胎儿骨髓间充质干细胞的比较研究

目的 比较成人和胎儿骨髓间充质干细胞（MSC）的表型和生物学性状差异，为临床选择使用MSC提供实验依据。方法 取正常人和胎儿骨髓单个核细胞，在SF培养基中进行MSC培养，测定生长曲线。电镜观察MSC形态，利用流式细胞仪进行SMC表型测定和细胞周期分析；SA方法测定Ⅰ，Ⅲ型胶原和vWF因子表达。通过碱性磷酸酶染色，苏丹黑染色及骨钙蛋白和脂蛋白酯酶mRNA的表达等来检测细胞向成骨，成脂肪细胞分化情况。结果 从成人和胎儿骨髓中可培养出MSC，并保持多向分化潜能。两者在细胞形态，生长特性，表面抗原表达等方面是相似的。胎儿骨髓MSC的扩增潜力及多向分化能力明显强于成人MSC。成人骨髓MSC的粘附功能则强于胎儿。结论 从成人及胎儿骨髓中可分离培养出MSC，在体外有效扩增且保持其低分化状态和多向分化能力。胎儿MSC较成人MSC更原始，具有更大的多向分化和体外扩增潜能，可作为组织工程的种子细胞；而成人MSC支持造血，促进造血功能恢复和重建造血的功能则强于胎儿，具有更广泛的临床移植应用前景。     

兔骨髓间充质干细胞体外分离培养及冻存研究

目的:寻求体外培养、冻存、复苏兔骨髓间充质干细胞(mensechymalstemcells,MSCs)的方法,为兔MSCs进一步的实验研究打下基础。方法:取新西兰白兔胫骨穿刺获取骨髓液,以贴壁筛选法分离、纯化、培养和扩增获得MSCs,并行液氮冻存,通过倒置显微镜观察其生物学表现。结果:MSCs为贴壁生长,形态为均匀成纤维细胞样,增殖能力强,传代及冻存后细胞仍然保持其生物学特性。结论:MSCs可采取贴壁筛选法进行较好的纯化和扩增,并可长期保存于液氮中,在一定的条件下可复苏存活。     

人骨髓及脐血间充质干细胞体外大量扩增及建库的质量控制

目的:研究人骨髓和脐血间充质干细胞(MSC)的体外培养特性及建立细胞库的可行性。方法:Ficoll离心剂法分离人骨髓及脐血来源单个核细胞,进行体外培养并大量扩增,观察细胞生长特性,流式细胞术检测MSC表面分子标志物表达情况。结果:骨髓样本比脐血标本的MSC更易于体外短期培养扩增,骨髓样本(5×106)体外培养2周约获得MSC3×107～1.2×108,成功率达100%,而脐血样本的MSC较难培养,成功率低(12.9%),细胞数扩增有限。对冻存复苏前后的细胞进行流式细胞术检测提示MSC表面标志物CD29、CD44、CD59、CD90、CD105、CD166等均阳性表达,造血细胞标志物CD34、CD14和CD45为阴性表达,提示MSC对本室的冻存复苏程序耐受能力较好,可获得复苏后扩增培养。结论:本研究表明对成人骨髓MSC建库的条件较成熟,获得成功培养的MSC分子表型在冻存复苏前后无明显改变。而脐血来源的MSC培养条件有待改善方能提高MSC培养成功率。     

大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及向神经元样细胞分化的实验研究

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(marrowstromalstemcell,MSC)的分离培养和体外扩增方法及生物学特性,研究其在诱导因子诱导下向神经元细胞分化的能力。方法:取大鼠骨髓,采用贴壁培养筛选法分离MSC,进行培养扩增,观察其生物学特性;用β-巯基乙醇(β-mereaptoethanol,β-ME)和丹参注射液诱导MSC向神经元样细胞分化,并通过细胞免疫化学法鉴定分化细胞。结果:大鼠MSC可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增,经丹参注射液和β-ME诱导,MSC可向神经元样细胞分化,出现胞体和突起,细胞免疫化学染色神经元特异性烯醇化酶(NSE)和巢蛋白(Nestin)呈阳性。结论:MSC易分离和培养,体外培养条件下生长良好,可连续传代,诱导剂作用下可分化为神经元样细胞。     

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性及优势

背景：骨髓来源的间充质干细胞含量极低,体外纯化、扩增活性好、分化潜能高的骨髓间充质干细胞,对进一步研究至关重要。目的：进一步验证全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化骨髓间充质干细胞的生物学特性、表型及多向分化潜能。方法：通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,流式细胞仪检测细胞标记物表达,分别进行成骨、成脂诱导分化。结果与结论：成功纯化、扩增了高细胞活性、高分化潜能的骨髓问充质干细胞。所得细胞呈成纤维细胞样;表达CD29、CD90,不表达CD45;成骨、成脂诱导分化后,茜素红染色、油红O染色阳性。证实全骨髓贴壁法操作简单、对细胞活性损伤小,可以得到高纯度、高活性、高分化潜能、生物学形态和特征稳定的骨髓间充质干细胞。     

急性白血病儿童骨髓间充质干细胞的生物学特点的初步研究

本研究探讨密度梯度离心法加贴壁法方式培养白血病儿童骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcell,MSC）的条件并观察其体外增殖能力、生长曲线、多向分化等生物学特性。通过密度梯度离心、贴壁法分离白血病患儿的MSC,观察细胞的形态变化及生长曲线、流式细胞术测定其CD29、CD105、CD45、CD34、CD14、HLA—DR等表达,通过成脂、成骨诱导研究其多向分化能力。结果表明：密度梯度离心法联合贴壁法可以培养出白血病儿童骨髓来源的MSC,初诊白血病儿童骨髓来源的MSC培养成功率为57．1％,缓解白血病儿童骨髓来源的MSC成功率为41．2％,接种密度越大成功率越高,初诊白血病儿童的MSC形成集落数目较多且生长较快。形态学观察显示,骨髓间充质干细胞接种24小时即贴壁,呈集落生长,形态多样;3天后贴壁细胞增殖,逐渐以梭形细胞为主;2—3周细胞基本达80％-90％融合,第3代后细胞呈均匀一致的长梭形。细胞传代后3天内处于潜伏期,3天后进入生长期,8天后进入平台期。检测第2代后细胞免疫表型显示,MSC的CD29、CD105表达率达95％以上,CIM5、CD34、CD14、HLA．DR极低表达或不表达。MSC能成功诱导成脂肪细胞及成骨细胞,油红O染色和茜素红染色为阳性。在合适的条件下冻存对细胞影响不大。结论：①白血病患儿骨髓培养出的贴壁细胞是MSC,骨髓含量在1ml以上且方法得当可以培养出MSC;②初诊的白血病患儿的骨髓相对容易培养出骨髓间充质干细胞,形成的集落较缓解期白血病患儿多,增长速度较快;⑧白血病儿童来源的MSC具有MSC的共同生物学特性。     

大鼠骨髓间充质干细胞的纯化、冻存及成瘤性分析

背景：骨髓间充质干细胞在骨髓中的含量极低,体外的长期培养过程中易丧失干细胞潜能以及体内移植后安全性等问题的存在,限制了骨髓间充质干细胞在临床上的广泛应用。目的：探索体外分离纯化、冻存大鼠骨髓间充质干细胞的最适方法,并观察以此方法培养的骨髓间充质干细胞移植体内后是否具有成瘤性。方法：分别采用差速贴壁结合24h首次换液、24h首次换液、48h首次换液的方法纯化培养骨髓间充质干细胞,筛选最适纯化方法进行后续实验。配制含体积分数为10%,20%,30%,40%,50%胎牛血清的细胞冻存液冻存细胞,复苏后计算细胞存活率,测定复苏后细胞的生长曲线及成脂诱导能力。将第3,15代骨髓间充质干细胞进行裸鼠肌肉、肝脏局部注射体内移植,45d后取注射部位行病理组织标本检查。结果与结论：差速贴壁结合24h首次换液法所获得骨髓间充质干细胞纯度最高,而细胞增殖能力与其他两组无明显差别,因此选用该方法纯化骨髓间充质干细胞,然后进行传代培养;含体积分数为30%血清冻存液既可保证细胞活性与增殖能力,又可保证干细胞特性及多向分化潜能。骨髓间充质干细胞传至15代仍保持间充质干细胞特性,骨髓间充质干细胞移植入裸鼠肝脏45d后仍可在肝脏局部存活,生长状态与体外培养相似,无异型性及向周围浸润生长,提示体外长时间培养15代以内的骨髓间充质干细胞可在裸鼠体内存活且无成瘤性。     

人骨髓间充质干细胞分离鉴定方法的改进

本研究的目的是建立一种基于临床移植需要的分离、培养、鉴定人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stemcells,MSC）的方法,为配合造血干细胞移植的临床应用提供实验基础.采用Percoll分离液（1.073/gml）从新鲜成人骨髓穿刺液中分离MSC,应用贴壁筛选法传代培养,流式细胞仪检测细胞表面抗原,成骨诱导体系（地塞米松0.1 μmol/L、β-甘油磷酸钠10 mmol/L、抗坏血酸磷酸盐50μmol/L）及脂肪诱导体系（地塞米松1μmol/L、牛胰岛素5 mg/L、1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤0.5 mmol/L、消炎痛60μmol/L）分别诱导MSC定向分化,通过细胞形态观察及免疫化学染色进行鉴定.结果表明：从成人骨髓液中分离培养出MSC,稳定表达CD73、CD105、CD166,不表达CD34、CD45.定向诱导的成骨细胞表达碱性磷酸酶活性,脂肪细胞内出现明显的脂滴.结论：采用密度梯度离心联合贴壁筛选法并通过流式细胞术检测及定向诱导分化,能够从成人骨髓液中分离出MSC,并完成细胞表型及多向分化潜能的初步鉴定.本操作方案具有一定的临床应用价值.     

骨髓增生异常综合征患者间充质干细胞的生物学特性及其支持造血的体外研究

为了解骨髓增生异常综合征（MDS）患者间充质干细胞（MSC）的生物学特性,探讨其对体外造血的支持能力,采集MDS的骨髓标本,分离、培养和扩增MSC,进行细胞形态观察和免疫表型、成骨分化及增殖能力检测,并对骨髓细胞进行成纤维细胞集落（CFU-F）形成分析.对MDS患者的MSC进行贴壁培养,接种脐血单个核细胞（MNC）,以观察细胞数和CFU-GM的变化,作为MDS患者MSC支持造血体外实验.结果表明：来自MDS患者的MSC呈典型的成纤维样细胞形态,表型鉴定CD34,CD45阴性,SH2（CD105）,SH3（CD73）,Thy-1（CD90）阳性,体外诱导可向成骨细胞分化,其增殖能力和CFU-F形成能力与源于正常供者的MSC相当.支持造血的体外实验显示,实验组培养上清中的细胞总数和CFU-GM计数在第2周后均显著低于对照组（P＜0.05）.结论：来源于MDS患者骨髓的间充质干细胞的生物学特性与正常供者的MSCs无差异,但其体外支持造血的功能较后者显著减弱.     

冷冻前后脐带间充质干细胞造血支持能力的比较

背景：低温冻存脐带间充质干细胞已成为研究热点,但关于冻存后其造血支持能力变化的报道甚少。目的：比较冷冻前后脐带间充质干细胞体外支持成人骨髓单个核细胞造血集落生成的能力。方法：分别将冷冻前后的人脐带间充质干细胞和人骨髓来源的间充质干细胞培养至第3代,经2.5g/L丝裂霉素C处理制备为细胞滋养层,与成人异体骨髓单个核细胞共培养。体外培养至35d应用甲基纤维素法检测造血干/祖细胞集落的增殖状态。结果与结论：冷冻人脐带间充质干细胞组集落形态、大小上与骨髓间充质干细胞组和未冷冻人脐带间充质干细胞组相似,3者均比空白组集落数量多,差异有显著性意义（P〈0.05）。与未冷冻人脐带间充质干细胞组相比,冷冻人脐带间充质干细胞组集落数更少,差异有显著性意义（P〈0.05）。实验结果说明冷冻前后人脐带间充质干细胞与骨髓间充质干细胞对骨髓单个核细胞均有造血刺激作用,但人脐带间充质干细胞冷冻后的造血支持作用有所减弱。     

纳米晶胶原基骨与骨髓间充质干细胞复合培养对表型影响

目的：观察纳米晶胶原基骨（nano-Hydroxyapatite／c011agen，nHAC）与骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cell，MSC）复合培养前后的表型变化。方法：仿生原理制备nHAC，体外培养MSC并与材料复合，通过碱性磷酸酶染色和流式细胞仪观察MSC与材料的前后表型。结果：MSC可以nHAC在上贴附、生长、繁殖、分化，复合前后表型一致。结论：nHAC是良好的支架材料，易与MSC复合，适合种子细胞的贴附、生长、增殖和分化，并对细胞表型无影响，证实纳米晶胶原基骨是组织工程良好的载体材料。     

In vivo gene transfer into adult stem cells in unconditioned mice by in situ delivery of a lentiviral vector.

The potential of in vivo lentivirus-mediated bone marrow stem cell gene transfer by bone cavity injection, which could take full advantage of any source of stem cells present there, has not been previously explored. Such an approach may avoid several difficulties encountered by ex vivo hematopoietic stem cell (HSC) gene transfer. We sought to determine if efficient gene transfer could be achieved in HSC and mesenchymal stem/progenitor cells (MSC) by intrafemoral injection of a lentivirus vector in mice. Four months after injection, up to 12% GFP-expressing cells were observed in myeloid and lymphoid subpopulations. Significant transduction efficiencies were seen in Lin(-)c-kit(+)Sca1(+) HSC/progenitors and CFU with multilineage potential, which were also confirmed by duplex PCR analysis of progenitor-derived colonies. Four months after secondary BMT, we observed 8.1 to 15% vector(+) CFU in all recipients. Integration analysis by LAM-PCR demonstrated that multiple transduced clones contributed to hematopoiesis in these animals. We also showed that GFP-expressing MSC retained multilineage differentiation potential, with 2.9 to 8.8% GFP-containing CFU-fibroblasts detected in both injected and BMT recipients. Our data provide evidence that adult stem cells in bone marrow can be efficiently transduced "in situ" by in vivo vector administration without preconditioning. This approach could lead to a novel application for treatment of human diseases.     

多发性骨髓瘤骨髓间充质干细胞生物学特性分析

为了研究多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）病人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）的病理生物学特性，以探讨MSC在MM骨损伤发生中的作用，取11例初治MM病人和5例正常人骨髓，用贴壁法体外分离培养MSC。应用流式细胞术分析MM骨髓MSC表型，MTT法检测MSC增殖能力，组织化学染色测定细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化能力。应用酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）测定细胞培养上清液中白介素-6（interleukin-6，IL-6）和干细胞生长因子（stem cell factor，SCF）浓度。收集MSC培养上清作为条件培养液，按梯度浓度加入人SKO007骨髓瘤细胞系培养体系中，MTT法测定细胞增殖能力差异。结果表明：与正常人骨髓MSC比较，MM患者骨髓MSC的表型无改变，均一表达CD29、CD73、CD166和HLA-ABC，不表达CD45和CD31；MM患者骨髓MSC增殖和分化能力正常，且具有相似的成骨和成脂肪分化功能；MM骨髓MSC分泌IL-6和SCF的水平均明显高于正常；MM来源的MSC培养上清显著促进SKO007细胞的增殖。结论：MM患者骨髓MSC的增殖分化功能正常，MM时骨损伤可能与MSC分化功能无关，而IL-6和SCF高表达为骨髓瘤细胞提供了必要的生存信号。     

人骨髓间充质干细胞神经元样细胞分化中自噬相关基因 Beclin-1 的表达简

背景：骨髓间充质干细胞具有自我更新和多向分化的潜能,但是经过长期体外培养后,骨髓间充质干细胞增殖分化能力逐渐丧失,其机制仍不明确。目的：观察人骨髓间充质干细胞神经元样细胞分化过程中自噬相关基因表达的变化。方法：利用表皮生长因子诱导人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞,观察其形态变化及生长情况。免疫细胞化学法检测神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白表达,采用Western blot检测诱导前后人骨髓间充质干细胞自噬相关基因Beclin-1表达的变化。结果与结论：经诱导后,人骨髓间充质干细胞呈典型神经元样细胞分化,神经元特异性烯醇化酶阳性率为78.7%,胶质纤维酸性蛋白阳性率为8.1%。诱导0.5 h后处理组细胞中Beclin-1的表达水平有所增加,但1 h后开始逐渐降低。说明体外可以诱导人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞,自噬相关基因表达活性在诱导分化早期呈高表达,分化过程中逐渐降低。