RNAi抑制NF—KB基因增强肺癌细胞对TRAIL敏感性的研究

目的:探讨RNAi靶向沉默NF-κB基因对TRAIL诱导肺癌细胞凋亡的影响.方法:使用NF-κB p65 siRNA转染肺癌A549细胞48 h,实验分为空白对照、脂质体对照以及干扰实验3组.采用RT-PCR法测定肺癌A549细胞内NF-κB p65 mRNA的表达,MTT法检测siRNA转染前后TRAIL对A549细胞生长抑制作用的变化.结果:与空白对照和脂质体对照组相比,siRNA组具有明显抑制肺癌A549细胞NF-κB p65mRNA表达的作用(P<0.01).MTT实验表明,转染siRNA后TRAIL对A549细胞的生长抑制作用明显增强,但在同一浓度,转染NF-κB p65 siRNA的细胞与未转染组相比,细胞增殖活性明显下降(P<0.05).结论:应用RNAi技术可有效干扰NF-κB p65的表达,抑制肺癌A549细胞的增殖,并可增加肺癌细胞对TRAIL的敏感性.     

小干扰RNA沉默NF-κB P65基因表达对胰腺癌细胞株PANC-1增殖与凋亡的影响

目的:运用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术阻断胰腺癌细胞株PANC-1中NF-κB P65基因表达,并研究该基因沉默后对细胞增殖与凋亡的影响.方法:利用阳离子脂质体LipofectamineTM2000将化学合成的人NF-κB P65的小干扰RNA转染入胰腺癌细胞株PANC-1中.RT-PCR法测定胰腺癌细胞内NF-κB P65mRNA与细胞周期素D1(cyclinD1)mRNA的表达.ELISA法检测NF-κB亚单位P65的DNA结合活性的改变.MTT法测定细胞生长曲线观察细胞增殖的抑制情况.流式细胞仪测定细胞凋亡率及细胞周期的变化.结果:化学合成的人NF-κB P65 siRNA能有效地抑制PANC-1细胞中NF-κB P65与cyclinD1基因在mRNA水平上的表达(P＜0.01),同时ELISA结果显示,RelA siRNA组的p65亚单位与DNA结合活性明显低于阴性对照组和空白对照组(P＜0.05).RelA siRNA组中细胞增殖减慢,凋亡率较对照组明显增加(P＜0.01),同时G1期细胞所占的比例较对照组增加了10%,S期和G2/M期细胞则分别减少了4%与6%.结论:体外实验初步证明NF-κB P65基因在胰腺癌细胞株增殖分化与凋亡方面扮演重要角色,通过沉默其表达可抑制胰腺癌细胞株PANC-1增殖并诱导其凋亡.     

RNA沉默HMGN5基因对肺癌A549细胞增殖的影响及意义

目的 通过RNA干扰技术(RNAi)沉默HMGN5基因,探讨其对肺癌A549细胞增殖的影响.方法 培养人肺癌A549细胞株,HMGN5基因合成慢病毒载体感染A549细胞,RT-PCR和Western blot检测A549细胞中HMGN5沉默率;设阴性对照组及RNA干扰组,MTT法检测A549细胞的增殖能力;Brdu法检测沉默HMGN5的表达;流式细胞仪检测其细胞周期.结果 与对照组比较,RNA干扰组HMGN5基因的mRNA及蛋白表达均降低,差异有统计学意义(P＜0.05);A549细胞的增殖能力明显下降,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05);细胞增殖率为29.70％,较对照组降低,差异有统计学意义(P＜0.05);G1期细胞为53.50±0.30,高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 采用RNAi能够沉默HMGN5基因,人肺癌A549细胞增殖能力显著降低,HMGN5基因可能参与肺癌的发生、发展、增殖过程.     

沉默人肺癌A 549细胞中期因子基因表达对细胞凋亡的影响

目的：研究RNA干扰（RNAi）人肺癌A549细胞中期因子（MK）基因表达及对肿瘤细胞凋亡的影响。方法构建含MK siRNA真核表达载体,将其转染到人肺癌A549细胞株中（实验组）,另有阴性对照组（转染阴性对照质粒）和空白对照组。应用RT‐PCR的方法检测各组细胞中MK mRNA的表达情况;采用Western blot法检测MK蛋白的表达情况;用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。结果实验组MK蛋白和mRNA表达都下降,分别下降了89．3％和83．3％。转染实验组A549细胞有自发性凋亡的发生,早期凋亡比阴性对照组和空白组分别提高了15．5倍和9．34倍。实验组caspase‐3活性明显高于阴性对照组和空白对照组（P＜0．05）。结论 RNAi下调人肺癌A549细胞株MK的表达,可诱导肿瘤细胞的自身凋亡。     

氯胺酮对人肺癌A549细胞生长的影响及相关机制研究

目的:探讨麻醉类药物氯胺酮和吗啡对人肺癌A549细胞生长的影响及相关作用机制?方法:体外培养肺癌细胞系A549,细胞培养24 h后,随机分为3组:对照组(NC组,加0.9% NaCl处理)?氯胺酮组(K1?K2?K3组,分别加氯胺酮100?200?400 ?滋g/mL处理)和吗啡组(M1?M2?M3组,分别加吗啡25?50?100 ?滋g/mL处理)?持续作用24 h后,Transwell小室培养体系测定肿瘤细胞的迁移率;双荧光素酶报告基因法测定NF-κB转录活性;48 h后MTT法测定细胞增殖抑制率;Western blot技术测定NF-κB P65的蛋白表达;QPCR技术检测细胞内IL-1β和COX-2的mRNA表达?结果:①与NC组比较,M1?M2组表现为促进A549细胞迁移(P < 0.05),M3组作用不明显;K1?K2?K3组表现为抑制A549细胞迁移(P < 0.05);②与NC组比较,M1?M2组表现为促进A549细胞增殖(P < 0.05),M3组作用不明显;K2?K3组表现为抑制A549细胞增殖(P < 0.05),K1组不明显;③与NC组比较,M1?M2?M3组表现为促进IL-1β?COX-2的mRNA表达(P < 0.05);K2?K3组表现为抑制IL-1β?COX-2的mRNA表达(P < 0.05),K1组不明显;④与NC组比较,M1?M2?M3组表现为促进P65的转录和蛋白表达(P < 0.05),K1?K2?K3组表现为抑制P65的转录和蛋白表达(P < 0.05)?结论:与阿片类药物不同,氯胺酮通过NF-κB信号通路及其下游因子IL-1β和COX-2抑制人肺腺癌细胞A549的迁移和增殖,可能更适用于肺癌患者的术后镇痛?     

RNA干扰her2／neu基因表达抑制肺癌A549细胞增殖的研究

目的:HER2/neu表达对肺癌细胞生物学的影响尚不明了,文中运用RNA干扰技术抑制HER2/neu表达,并观察对肺癌A549 细胞体外增殖的影响.方法:构建针对her2/neu基因的RNA干扰真核表达载体,运用脂质体介导转染A549 细胞并用G418筛选出阳性克隆株;半定量RT-PCR和Western检测转染后HER2/neu mRNA及蛋白的表达水平;FCM检测细胞周期分布; MTT法绘制细胞生长曲线观察体外细胞的增值能力.结果:成功构建针对her2/neu基因的RNA干扰真核表达载体(命名为psilence 3.1-HER2),转染后使A549 细胞HER2/neu mRNA和蛋白的表达较未转染组和阴性对照质粒转染组均显著下调;细胞G0/G1期细胞增加,S期细胞减少;细胞生长曲线右移、增殖速度明显减慢.结论:psilence 3.1-HER2能够稳定、高效、特异地抑制肺癌A549内her2/neu基因的表达,可显著抑制细胞增殖.针对her2/neu基因的RNAi策略有望成为肺癌的基因治疗的新选择.     

RNA干扰介导ABCE1基因沉默对人肺腺癌A549细胞增殖的影响

目的ABCE1在人肺腺癌A549细胞增殖中的作用进行初步探讨。方法以人肺腺癌A549细胞系为研究对象,针对其ABCE1基因序列设计小干扰RNA片段,重组其短发夹状RNA（shRNA）表达载体,转染入细胞。用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫印迹（Western blot）方法分别检测转染后ABCE1的mRNA和蛋白的表达水平,MTT法检测增殖能力。结果RT-PCR和Western blot显示shRNA对ABCE1基因和蛋白水平均有显著的下调作用。人肺腺癌A549细胞的生长速度减慢。结论下调ABCE1基因后,A549细胞的增殖能力得到了明显的抑制,有可能成为临床治疗A549的靶点之一。     

NF-κB基因RNA干扰质粒的构建与鉴定

目的构建转录因子NF-κB的RNA干扰(RNAi)质粒,为研究NF-κB参与的细胞信号通路及以其为靶点的基因治疗提供稳定转染的RNAi质粒。方法设计针对NF-κB的shRNA特异性序列,应用基因重组技术克隆到pSilencer 1.0-U6表达载体,EcoRⅠ和ApaⅠ双酶切及DNA测序鉴定重组克隆;脂质体转染RNAi重组载体至前列腺癌细胞PC-3后,Western blot分析各组NF-κB蛋白表达水平。结果双酶切和DNA测序证实shRNA正确插入pSilencer 1.0-U6质粒;Western blot结果显示与空质粒对照组比较NF-κB转染组细胞NF-κB表达明显下调。结论成功构建人NF-κB基因RNAi质粒,为研究NF-κB参与的细胞信号通路提供了稳定转染细胞的干扰质粒,为靶向NF-κB的基因治疗提供了有力工具。     

人AURKA基因RNA干扰慢病毒载体的构建及其对A549细胞增殖的影响

目的:针对AURKA基因构建RNA干扰重组慢病毒质粒并进行慢病毒包装,初步探讨AURKA基因的功能。方法:应用pGCLV-GFP慢病毒载体构建针对AURKA的shRNA载体,转染包装293T细胞,收集病毒上清液,转染肺腺癌细胞株A549。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况确定转染效率,应用Western blot技术检测AURKA基因在蛋白水平表达的变化,以明确RNAi的抑制率。应用BrdU法分析干扰AURKA前后A549细胞增殖情况的变化,运用克隆形成实验检测干扰AURKA后A549细胞株对长春新碱敏感性的变化。结果:针对AURKA基因的RNAi慢病毒表达载体构建成功,PCR和DNA测序鉴定实验表明插入位点与干扰片断的碱基序列完全正确。在293T细胞中进行慢病毒包装,获得高滴度病毒上清液。通过重组慢病毒载体将AURKA shRNA转导入A549细胞中,转染效率为100%。Western blot检测证实LV-AURKA慢病毒显著抑制AURKA的表达,BrdU检测显示AURKA基因表达下调抑制了A549细胞的增殖。克隆形成实验表明AURKA基因表达增强A549细胞对长春新碱的敏感性。结论:慢病毒载体介导的靶向AURKA的RNA干扰可有效抑制AURKA表达,降低肺腺癌A549细胞的增殖能力,并且增强A549细胞对长春新碱的敏感性。     

发卡样NF-κB特异性RNA干扰表达载体的构建及体外效应研究

目的采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,通过构建人NF-κB p65基因的特异性siRNA真核表达载体,体外观察对NF-κB基因的沉默作用,以及对内毒素(LPS)刺激后NF-κB活性的调控作用.方法采用基因克隆技术,将合成的发卡样特异性p65 RNA干扰寡核苷酸序列插入真核表达载体(pPUR/U6),构建p65 siRNA的表达载体,转染体外ECV-304细胞,48h后观测胞内NF-κB p65亚单位蛋白水平(Western blotting)、及对LPS(10 μg/ml)刺激后NF-gB活化的抑制作用.结果①成功构建发卡样p65 siRNA(small interfere RNA)真核表达载体(pPUR/U6-p65 siRNA);②pPURyU6-p65 siRNA转染(脂质体法)ECV-304细胞,48 h后明显下调胞内P65蛋白水平;③转染pPUR/U6-p65 siRNA的细胞,明显抑制LPS(10μg/ml)刺激后NF-κB的活化.结论该RNA干扰真核表达载体能明显干扰p65蛋白的表达、释放,进而抑制NF-κB的活化,可望进一步抑制细胞的过度炎症反应,减轻创伤组织的受损程度,促进创伤后组织的修复.     

氯化锂对A549肺癌细胞增殖及核因子-κ Bp65表达的影响

目的使用糖原合成酶激酶-3抑制剂氯化锂作用肺癌A549细胞后,观察对细胞增殖和核因子-κBp65（NF-κBp65）表达的影响。方法不同浓度氯化锂作用A549细胞48h后,以噻唑蓝（MTT）比色试验为指标观察氯化锂对人肺腺癌A549细胞增殖的影响;免疫细胞化学实验检测核因子-κBp65表达情况。结果不同浓度的氯化锂对A549细胞均具有抑制增殖的作用,并且这种增殖抑制作用呈剂量依赖关系;NF-κBp65表达随氯化锂浓度增加而减弱。结论氯化锂可抑制A549人肺腺癌细胞增殖,这种作用可能是通过作用NF-κB信号系统完成的。     

NF-κB基因RNA干扰载体的构建

目的:构建核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)基因的RNA干扰载体,观察其抑制NF-κB蛋白的效率.方法:分别构建大鼠NF-κB基因的pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO-NF-κB重组真核表达载体和pSilencer 1.0-U6-siRNA-NF-κB重组载体,用两种重组载体转染COS-7细胞,在荧光倒置显微镜下观察大鼠NF-κB-绿色荧光融合蛋白的表达,并用Western免疫印迹方法检测.结果:荧光倒置显微镜观察及Western免疫印迹检测结果均显示随着pSilencer 1.0-U6-siRNA-NF-κB重组载体浓度的增加,NF-κB-绿色荧光融合蛋白表达量逐渐减少.结论:成功构建NF-κB基因的RNA干扰载体.     

PDTC对A549细胞增殖、细胞周期、凋亡及星形细胞上调基因-1表达的影响

目的:观察NF-κB特异性抑制剂PDTC对人肺腺癌A549细胞增殖、细胞周期、凋亡及星形细胞上调基因-1(AEG-1)表达的影响。方法:用不同浓度(25、50、100、200μmol/L)的PDTC分别处理A549细胞,对照组不给PDTC。应用MTT法检测处理24、48、72h后细胞增殖抑制率,流式细胞术检测处理24h后细胞周期的变化,Ho-echst33342荧光染色检测处理24h后细胞的凋亡情况,RT-PCR和Westernblot检测处理24h后细胞AEG-1mRNA和蛋白的表达。结果:经PDTC处理的A549细胞增殖明显受抑,呈时间和浓度依赖性(F时间=531.981,F浓度=388.475,P<0.05);与对照组相比,PDTC处理24h后A549细胞G0/G1期细胞比例上升(P<0.05),细胞形态出现明显凋亡改变;随着PDTC浓度的增加,癌细胞内AEG-1mRNA和蛋白的表达水平降低(F=275.162、59.473,P<0.05)。结论:PDTC可抑制A549细胞的增殖,诱导其凋亡,其机制可能与PDTC抑制NF-κB、AEG-1的表达有关。     

siRNA阻断NF—κB信号通路对肝癌细胞增殖的影响

目的：通过阻断肝癌细胞中NF—kappaB（NF—κB）信号通路，研究它与肿瘤细胞增殖、耐药的关系。方法：利用RNA干扰（RNAi）技术阻断NF—κB亚单位p65的表达，RT—PCR和Westernblotring法检测p65的mRNA及蛋白表达，MTT法检测细胞的增殖情况，以及联合应用不同浓度化疗药5-Fu对肿瘤细胞增殖的影响。结果：NF—κB的亚单位p65在肝癌细胞质中高表达，p65siRNA可有效地阻断蛋白表达。结论：应用RNAi技术可以有效地干扰p65表达，抑制肝癌细胞增殖，增强对化疗药5-Fu的敏感性。     

呼吸道合胞病毒诱导A549细胞凋亡的机制研究

目的:通过呼吸道合胞病毒(RSV)感染人肺Ⅱ型腺上皮癌细胞(A549)及人肺成纤维细胞(IMR-90)后核转录因子(NF-κB)变化,探讨RSV诱导肿瘤细胞凋亡机制,为临床肿瘤治疗提供新方向。方法:RSV以感染复数(MOI)3感染A549及IMR-90细胞,观察感染后24,48,72h细胞形态变化、细胞存活率及细胞内病毒滴度,Western-blot方法检测Caspase-3,8,9蛋白表达变化,并在RSV感染A549细胞后2,4,8,24,36h,采用Western-blot方法检测NF-κB蛋白表达变化。结果:RSV感染A549及IMR-90细胞后,A549细胞存活率较IMR-90低,细胞内病毒滴度较IMR-90高,差异有统计学意义(P<0.05),细胞呈现明显凋亡改变。Caspase-3,8,9呈时间依赖性增强,以Caspase-3,9表达为主。A549细胞内NF-κB表达8h内先增高并达高峰,24h开始下降,36h表达明显下调,与未感染RSV细胞相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论:RSV可通过内源性及外源性途径引起A549细胞凋亡,以NF-κB介导的内源性途径为主。     

小干扰RNA特异性抑制肺肿瘤细胞A549中绿色荧光蛋白基因表达

目的：探讨绿色荧光蛋白(green fluorescence protein，GFP)特异的小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)对肺肿瘤细胞A549中的GFP基因表达的抑制作用，建立以真核表达载体释放生成特异基因siRNA的方法。方法：构建mU6启动子驱动的含有GFP特异siRNA的真核表达质粒，转染A549肺肿瘤细胞，观察共转染时不同剂量siRNA对GFP的抑制效应。结果：针对GFP核酸序列设计的特异性siRNA GFP-siRNA可有效抑制其表达，并当比例为1：1时效果最佳，而空质粒载体及无关RNAi无此效应。结论：以mU6为启动子的含特异RNAi的质粒可作为抑制特异基因表达的一种新的技术手段，并且为研究基因功能的一条有效途径。     

RNA干扰及厄洛替尼阻断EGFR信号途径对A549细胞抗增殖的影响

目的 研究RNA干扰（RNAi）及厄洛替尼阻断表皮生长因子受体（EGFR）信号途径对肺腺癌A549细胞增殖的影响。方法 肺腺癌A549细胞分为对照组、RNAi组、厄洛替尼组。采用倒置相差显微镜观察EGFR信号阻断前后细胞形态的变化,RT-PCR检测EGFR mRNA表达,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测EGFR及Bcl-2、Bax表达。结果 RNAi阻断EGFR mRNA表达下调。与对照组相比,RNAi组及厄洛替尼组A549细胞凋亡增加, EGFR表达降低,Bcl-2水平表达降低,Bax蛋白表达增高, Bcl-2/Bax比值降低。结论 阻断EGFR信号途径可促进肺腺癌A549细胞凋亡,其机制可能与降低Bcl-2/Bax比值水平相关。     

小干扰RNA干扰核因子κB信号通路对内毒素刺激巨噬细胞释放肿瘤坏死因子α的影响

目的 探讨小于扰RNA(siRNA)抑制核因子κB(NF-κB)信号通路对细菌脂多糖(LPS)刺激的巨噬细胞释放肿瘤坏死因子α(TNF-α)的影响.方法 人单核细胞白血病THP-1细胞经氟波酯诱导为巨噬细胞后分2组,分别感染应用分子克隆技术构建的针对NF-κB P65的siRNA逆转录病毒质粒(siRNA病毒组)及乱序(Scramble)对照序列逆转录病毒质粒(Scramble病毒组).用终浓度50μg/ml的LPS持续刺激2组巨噬细胞,分别应用RT-PCR技术检测LPS刺激不同时间巨噬细胞NF-κB P65 mRNA和TNF-α mRNA表达水平,蛋白质印迹法检测NF-κB P65蛋白表达水平,酶联免疫吸附试验检测巨噬细胞培养上清液TNF-α含量.结果 LPS刺激12和24 h,siRNA病毒组巨噬细胞NF-κB P65 mRNA表达水平(0.97±0.02,0.89±0.01)明显低于Scramble病毒组(1.01±0.03,0.97±0.01,均P＜0.05);LPS刺激24和72 h,siRNA病毒组NF-κB P65蛋白表达水平(0.95±0.04,0.94±0.01)明显低于Scramble病毒组(1.07±0.06,1.03±0.05,均P＜0.05).LPS刺激4、8、12和24 h的各时点,siRNA病毒组TNF-α mRNA表达水平均明显低于Scramble病毒组(0.92±0.02比0.98 ±-0.01,0.86±0.02比1.00±0.01,0.79±0.03比1.01±0.01,0.78±0.03比1.02±0.01,均P＜0.05).LPS刺激2、4、8、24、36、48、54和72 h的各时点,siRNA病毒组巨噬细胞培养上清液TNF-α含量均明显低于Sramble病毒组(均P＜0.01).结论 针对NF-κB P65的siRNA可抑制NF-κB信号通路的功能活性,进而抑制内毒素刺激引起的巨噬细胞活化和TNF-α释放,提示RNA干扰技术在急性肺损伤早期过度炎症反应的防治中具有潜在应用价值.     

CIK细胞对人肺癌细胞A549凋亡作用的影响

目的观察细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer cell,CIK）对人肺癌细胞A549凋亡作用的影响,并探讨机制。方法常规方法体外诱导生成CIK细胞,CIK细胞为效应细胞,人肺癌细胞A549为靶细胞,比较观察人肺癌细胞A549的凋亡情况。结果电镜法观察CIK细胞能诱导人肺癌细胞A549出现凋亡的超微结构变化,annexinV／PI流式细胞分析法检测早期凋亡率发现CIK实验组明显高于对照组。结论体外培养的CIK细胞可明显诱导人肺癌细胞A549凋亡。