细菌内毒素体外刺激小鼠腹腔巨噬细胞分泌一氧化氮实验模型的条件优化

目的优化细菌内毒素刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生NO实验模型的条件。方法采用Hank’s液灌洗小鼠腹腔,收集腹腔留
居巨噬细胞,利用铜绿假单胞菌脂多糖（LPS）作为内毒素刺激巨噬细胞产生NO,以Griess法检测培养上清液中NO的浓度,考
察细胞浓度、LPS浓度、LPS刺激时长、培养液体积等因素对巨噬细胞产生NO的影响,优化实验条件,并用已知药物验证模型的
可靠性。结果本实验条件下,细胞浓度对NO的产生具有关键性影响,最适浓度为6×10
6个细胞/ml,96孔板中每孔100μl;LPS
浓度<1μg/ml时,NO的产生随LPS浓度的增加而增加（P<0.001）,LPS浓度>1μg/ml时,NO的增加的幅度明显下降,当LPS
浓度为10μg/ml时,NO产生达到峰值;NO的产生随LPS刺激时间的延长,其含量相应增加,24与48h之间的增加幅度大于
48h与72h之间的增加幅度（P<0.05）;培养上清中NO的含量与培养液的体积有一定关系,100μl时的NO含量最高。阿司
匹林(1mmol/L)、地塞米松(10μmol/L)、环孢霉素A(10μmol/L)均能明显抑制LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生NO（P<0.001）。
结论巨噬细胞浓度、LPS浓度、LPS刺激时长是建立内毒素刺激小鼠腹腔巨噬细胞分泌一氧化氮实验模型的主要影响因素。推
荐方案为：巨噬细胞浓度5×10
6个细胞/ml,100μl/孔;LPS浓度10μg/ml;LPS刺激时长24h或48h;培养液体积100~200μl。
     

内毒素诱导小鼠腹腔巨噬细胞凋亡的机制探讨

细胞凋亡在形态学上表现为染色质浓缩,生长化学上则表现为核酸酶酶切ＤＮＡ。本研究试图探讨内毒素（脂多糖）诱导小鼠腹腔巨噬细胞凋亡的机制。结果显示,内毒素能诱导巨噬细胞凋亡,与对照组比,细胞吞噬机能显著下降（Ｐ〈０．０１）,腹腔灌洗液中ＮＯ２＾－／ＮＯ３＾－浓度显著升高。ＮＯ阻断剂ＡＧ和活性氧阻断剂ＰＤＴＣ均能部分抑制巨噬细胞凋亡,细胞吞噬机能也获得部分恢复。用ＬＰＳ和ＩＦＮ模拟在体情况,也能诱导培养     

聚岩藻多糖对小鼠巨噬细胞分泌炎症因子的影响及其机制

目的：探讨聚岩藻多糖对脂多糖（LPS）诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌炎性因子的影响,并阐明其免疫调节作用。方法：取对数生长期RAW264.7细胞,分为对照组、LPS组和LPS+聚岩藻多糖组,采用CCK-8法检测各组细胞存活率,酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测各组细胞培养上清中白细胞介素6 (IL-6)、肿瘤坏死因子α (TNF-α)、单核细胞趋化因子1 (MCP-1)、巨噬细胞炎性蛋白（MIP）-1α和MIP-1β水平。结果：与对照组比较,LPS组和LPS+聚岩藻多糖组细胞存活率明显升高（P<0.01）,细胞培养上清中IL-6、TNF-α、MCP-1、MIP-1α和MIP-1β水平均明显升高（P<0.01）。与LPS组比较,LPS+聚岩藻多糖组细胞存活率明显降低（P<0.01）,细胞培养上清中IL-6、TNF-α、MCP-1、MIP-1α和MIP-1β水平明显降低（P<0.01）。结论：聚岩藻多糖可抑制小鼠巨噬细胞对炎症因子IL-6、TNF-α、MCP-1、MIP-1α和MIP-1β分泌的影响,具有潜在的免疫调节作用。     

脂肪干细胞的急慢性炎症模型的建立

目的:在体外建立脂肪干细胞的急慢性炎症模型,为研究microRNAs在成体干细胞免疫功能中的调控作用及信号机制的研究提供实验模型。方法:对所分离的脂肪干细胞进行流式细胞仪表面抗原鉴定。加入3个浓度(1,10,100 mg/L)的脂多糖(LPS)于不同时间(2,6,12 h)刺激脂肪干细胞建立急性炎症模型,用LPS(1 mg/L)间断刺激脂肪干细4周建立慢性炎症模型,对照组加完全培养液。CCK8测定细胞增殖活性,ELISA法检测上清液中IL-6、TNF-α、IL-1β含量,Western Blot检测TLR2、TLR4蛋白表达,qPCR检测上述相关分子基因水平表达。结果:流式细胞仪分析脂肪干细胞的细胞表型:CD29、CD44、CD105阳性,CD34、CD45为阴性。与对照组比较,上述检测结果差异均具有统计学意义(P<0. 05)。结论:1 mg/L LPS刺激人脂肪干细胞6 h可以建立急性炎症模型,间断刺激4周人脂肪干细胞可以建立慢性炎症模型。     

辛伐他汀对小鼠炎症型巨噬细胞极性的影响

目的 观察辛伐他汀对炎症型M1型巨噬细胞极性的影响,探讨他汀类药物在细胞水平的抗炎作用.方法 以γ-干扰素及脂多糖刺激小鼠骨髓来源巨噬细胞诱导成M1型炎症性巨噬细胞模型,给予辛伐他汀1.0、2.5、5.0 μmol/L分别干预9h,以流式细胞仪检测巨噬细胞膜CD16/23、CD206标志分子的表达,用ELISA检测白细胞介素(IL)-10和IL-12的分泌.结果 γ-干扰素及脂多糖刺激的巨噬细胞CD16/32表达阳性率为86.39％±2.24％,IL-12分泌量为(1562±217) pg/ml,符合M1型巨噬细胞表型特点;与辛伐他汀1.0、2.5、5.0 μmol/L孵育9h后测定的CD206表达阳性率分别为68.10％±2.48％、75.28％±1.66％、86.32％±2.19％,IL-10浓度分别为(500±5)、(675±28)、(916±15) pg/ml,均高于M1型巨噬细胞[9.67％±5.48％、(298±11) pg/ml,均P＜0.01],且与M2型巨噬细胞的表型特点类似.结论 辛伐他汀可通过诱导炎症型M1型巨噬细胞转化为抗炎型的M2型巨噬细胞而发挥抗炎作用.     

小鼠皮下气囊慢性炎症模型的建立

目的:探索建立小鼠皮下慢性炎症模型的方法.方法:在小鼠皮下制作气囊,然后向气囊内注入不同致炎物(脂多糖和卡介苗),建立两种慢性炎症模型,观察皮下慢性炎症发生、发展情况及慢性炎症生成率.对照组小鼠气囊内注入生理盐水.结果:实验组小鼠皮下气囊壁慢性炎症生成率均为100％,对照组小鼠气囊壁无慢性炎症反应发生.使用t检验对各组小鼠皮下气囊壁的重量进行统计分析.脂多糖组与对照组相比,在造模后第5、7、12、14和16天时差异有统计学意义(P＜0.05)；卡介苗组与对照组相比在第5天时差异无统计学意义(P＞0.05),在造模后第7、12、14和16天时差异有统计学意义(P＜0.05).脂多糖和卡介苗组的气囊壁均在造模后第7天出现典型的慢性炎症表现.脂多糖和卡介苗组气囊灌洗液的中性粒细胞在造模5d逐渐为淋巴细胞和单核巨噬细胞取代,对照组灌洗液未检出炎细胞.结论:在小鼠皮下制作气囊,注入脂多糖或卡介苗可以成功地建立小鼠皮下气囊慢性炎症模型.此模型能较好地模拟在单一致炎因子存在情况下引起的慢性炎症状态.     

RORα在脂多糖所致小鼠巨噬细胞炎症反应中的表达变化与作用实验研究

目的:探讨RORα在脂多糖所致小鼠巨噬细胞炎症反应过程中的表达变化与作用。方法:取小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs),加入100 ng/ml脂多糖(LPS)处理不同时间点后,利用荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测细胞中炎症因子白介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α),以及RORα的转录水平变化,进一步利用Western blot检测RORα蛋白水平变化;分别采用RORα激动剂SR1078和拮抗剂SR3335预处理细胞24 h后,LPS处理2 h,利用ELISA法检测细胞上清中炎症因子IL-1β,TNF-α和IL-6的含量。结果:100 ng/ml LPS在不同时间点均可显著促进BMDMs炎症因子IL-1β和TNF-α的转录水平表达(P<0.05),而在LPS处理1～12 h显著抑制了RORα的转录水平(P<0.05),同时蛋白表达水平也明显降低(P<0.05)。与LPS处理组相比,SR1078预处理,可显著抑制炎症因子的释放,而SR3335进一步激活了细胞炎症因子的释放(P<0.05)。结论:RORα对脂多糖所致小鼠巨噬细胞炎症反应具有调节...     

大鼠脑水肿模型中脑组织巨噬细胞炎症蛋白-2、IL-10含量测定

目的:探讨巨噬细胞炎症蛋白2(MIP-2)、白介素10(IL-10)在脂多糖(LPS)致大鼠脑水肿发病过程中的表达及意义.方法:SD大鼠56只,随机分为2组.对照组(NS组)28 只,0.2 ml生理盐水颈内动脉注射;脂多糖组(LPS组)28只,颈内动脉注射LPS 200 μg.于注射后4 h、6 h、12 h、24 h分别测定2组大鼠脑组织含水量、MIP-2、IL-10、伊文思蓝(EB)的含量.结果:LPS组不同时间点脑组织含水量、EB含量、MIP-2和IL-10的含量显著高于NS组(P＜0.05).LPS组脑组织含水量和EB含量、IL-10含量呈正相关(r=0.743,0.467, P＜0.05),IL-10含量与MIP-2含量呈正相关(r=0.619,P＜0.05).结论:在内毒素致中枢神经系统炎症中,MIP-2、IL-10表达量增高,2者参与脑水肿的发生发展.     

骨髓间充质干细胞对巨噬细胞分泌炎症因子的影响

目的 探讨骨髓间充质干细胞对脂多糖(LPS)刺激巨噬细胞分泌炎症因子IL-10、TNF-α的影响.方法 体外分离、培养、鉴定骨髓间充质干细胞与巨噬细胞,分PBS、BMSCs、Macrophage、Macrophage+ BMSC、BMSCs+ LPS、Macrophage+ LPS、Macrophage+BMSCs+LPS 7组进行细胞共培养实验.收集不同时间点培养基上清液,ELISA检测其炎症因子IL-10、TNF-α的含量.结果 B(BMSCs)组与E(BMSCs+LPS)组相比,IL-10与TNF-α的含量没有明显变化;F(Macrophage+LPS)组IL-10、TNF-α的含量均高于C组(Macrophage);G(Macrophage+BMSCs+LPS)组与F(Macrophage+LPS)组相比,TNF-α明显降低、IL-10明显升高.结论 BMSCs可以减轻LPS对巨噬细胞分泌炎症因子的刺激作用,减轻炎症反应的程度.     

miR-203对LPS诱导的肺泡巨噬细胞释放炎症因子和氧化应激的影响

目的 研究miR-203对脂多糖(LPS)诱导的肺泡巨噬细胞释放炎症因子和氧化应激的影响.方法 将肺泡巨噬细胞分为Control组(空白对照)、LPS组(LPS处理)、LPS+NC组(转染mimics control,LPS处理)、LPS+miR-203组(转染miR-203 mimics,LPS处理).采用qRT-P...     

体外细胞炎性损伤模型的建立

目的 体外复制细胞炎性损伤模型用于体外炎症研究.方法 将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养后分组,用不同浓度(0、0.1、1、10、20μg/ml)的脂多糖(LPS)刺激,在不同时间点(4、12、24、48h)收样品,检测细胞上清中的白介素-6(IL-6)水平.结果 每个时间点的HUVEC:LPS(0.1、1、10、20μ,g/ml)比LPS(0μg/ml)刺激后IL-6分泌明显增高(P＜0.05);48h内随时间增加,IL-6分泌增加,呈线性关系;相同时间点不同LPS浓度(0.1、1、10、20 μg/ml)刺激细胞产生的IL-6分泌差异无统计学意义(P＞0.05).结论 体外LPS刺激HUVEC是理想的细胞炎性损伤模型.     

糖原诱出小鼠腹腔巨噬细胞的形态学及细胞化学研究

本实验用电镜及定量细胞化学技术证明糖原诱出的小鼠腹腔巨噬细胞(Mφ)体积增大,皱折和伪足增多。细胞质中吞噬体和溶酶体增多。酸性磷酸酶(AcPase)、非特性酯酶(ANAE)、琥珀酸脱氢酶(SDH)活性增强,而5核苷酸酶(5Nase)活性则与对照组无明显差别。     

Effects of quercetin on hepatocyte stimulating factor production by mouse peritoneal macrophages

Objective:To study the effects of quercetin on hepatocyte stimulating factor production from mouse peritoneal macrophages.Methods:Hepatocyte stimulating factor was evaluated by the amount of fibrinogen synthesized in Hep3B cvells.Interleukin-6 activity was measured by B9 cell proliferation methyl thiazolyl tetrazolium colorimetric method. Hep3B cell supernatant fibrinogen was quantitated with ELISA.Results:LPS induced the synthesis of hepatocyte stimulating factor in mouse peritoneal macrophages,and hepatocyte stimulating factor promotes the synthesis of fibrinogen from Hep3B cells.Quercetin(5 to 40 μmol/L) inhibited the synthesis of hepatocyte stimulating factor stimulated by LPS.Quercetin(5 to 20 μmol/L) inhibited release of interleukin-6 from mouse peritoneal macrophages induced by 0.5g/L fibrin fibrinogen degradation products.Conclusion:Quercetin inhibits the synthesis of hepatocyte stimulating factor in macrophages.     

皮质酮对大鼠腹腔巨噬细胞功能的影响

目的 进一步明确天然糖皮质激素对巨噬细胞免疫功能的影响及其时效和量效关系.方法 收集大鼠腹腔巨噬细胞,分别用10～1 000 ng/ml的皮质酮(corticosterone,CORT)刺激,检测细胞的黏附、趋化和吞噬功能;使用ELISA试剂盒检测细胞培养上清中TNF-α的含量.结果 50 ng/ml的皮质酮显著增强巨噬细胞的黏附功能(P＜0.05),10 ng/ml和50 ng/ml的皮质酮刺激细胞后,其趋化功能均显著增加(P＜0.05).同时,50 ng/ml的皮质酮还可显著增强巨噬细胞的吞噬功能(P＜0.05)和促进巨噬细胞分泌TNF-α(P＜0.01),而使用高浓度皮质酮(500 ng/ml和1 000 ng/ml)处理时,巨噬细胞的上述功能增强趋势减弱或无增强;在0.5～5 h范围内,皮质酮处理1 h时细胞的吞噬功能和分泌TNF-α的功能增强最明显,刺激更长时间后其功能的增强趋势逐渐减弱.结论 一定剂量的天然糖皮质激素急性刺激可明显增强免疫功能.     

刀豆素A诱导小鼠腹腔巨噬细胞内吞与细胞内游离钙的关系

采用电镜和粘附式细胞仪（ＡＣＡＳ５７０）观察了胶体金标记的刀豆素Ａ（ＣｏｎＡ－Ａｕ）与小鼠腹腔巨噬细胞（Ｍφ）表面ＣｏｎＡ受体的结合、内吞及其在Ｍφ中转运的形态学改变，同时分析ＣｏｎＡ刺激后Ｍφ内游离钙（Ｃａ２＋）的变化。ＣｏｎＡ孵育１ｍｉｎ后，配体进入内吞小泡，第２次内吞约需２０ｍｉｎ。粘附式细胞仪分析表明：ＣｏｎＡ刺激后５０ｓ，Ｃａ２＋急剧上升，平均住值达０．５５７Ｕ；约１００ｓ后，恢复到刺激前水平；１８ｍｉｎ后，Ｃａ２＋重新回升，持续约１８ｍｉｎ后开始下降。本实验揭示配体再内吞与Ｃａ２＋重新上升的时间相吻合，其肯定性和机理有待于进一步研究证实。     

黄芪苷对脂多糖诱导巨噬细胞一氧化氮和一氧化氮合酶表达的影响

[摘要] 目的：研究黄芪苷对小鼠巨噬细胞一氧化氮（NO）生成和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达的影响。方法：体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7,取生长良好的细胞分别加入LPS（终浓度1μg/ml）和不同浓度黄芪苷（终浓度10,50,100μM）进行干预,并设空白对照组。取培养24h细胞上清,用Griess法检测NO生成量;取培养8h和24h细胞,分别提取细胞总RNA和蛋白,用RT-PCR法和Western Blot法检测iNOS基因和蛋白水平表达情况。结果：与空白对照组相比,LPS明显促进了RAW264.7细胞iNOS表达和NO的生成;加入黄芪苷可抑制 LPS诱导的RAW264.7细胞iNOS mRNA和蛋白表达,减少NO的生成,与LPS组有显著性差别。结论：黄芪苷可明显降低LPS诱导的巨噬细胞iNOS表达和NO生成,这可能是其抗动脉粥样硬化斑块形成的作用机制之一。     

腹腔镜手术时不同腹腔环境对大鼠腹腔巨噬细胞的影响

目的 探讨腹腔镜手术时不同腹腔环境下腹腔免疫功能的改变.方法 将32只大鼠雄性SD大鼠随机分为四组:开腹组,无气腹组,CO2气腹组和N2气腹组,每组8只.模拟开腹手术和相应腹腔镜手术时的气腹环境,时间为1小时,于48小时后从大鼠的腹腔中分离出巨噬细胞.RT-PCR检测腹腔巨噬细胞分泌iNOS mRNA、TNF-α mRNA及IL-1 β mRNA的表达.结果 术后四组相比较,腹腔巨噬细胞数四组间无统计学差异(P＞0.05);开腹组腹腔巨噬细胞iNOS mRNA、TNF-α mRNA及IL-1 βmRNA的表达最低(P＜0.01〉; CO2气腹组居中(P＜0.01);无气腹组和N2气腹组较高(P＜0.01);无气腹组和N2气腹组间无明显统计学差异(P＞0.05).结论 CO2气腹对腹腔免疫功能的抑制作用小于开腹组,但大于无气腹组或N2气腹组.     

内毒素和IFN-γ对巨噬细胞的体外调变作用

目的 探讨内毒素（LPS）和INF－γ对巨噬细胞免疫调节功能的影响。方法 LPS或IFN－γ体外处理小鼠腹腔原代巨噬细胞后，采用混合细胞培养结合^H-TdR掺入法，研究巨噬细胞对ConA介导的脾淋巴细胞增殖反应的影响。结果 LPS和IFN－γ作为刺激剂在体外实验中，可以明显地增强与巨噬细胞混合培养的脾脏淋巴细胞的增殖反应。结论 LPS IFN－γ可以体外调变巨噬细胞，影响巨噬细胞的免疫调节功能。     

伊马替尼抑制脂多糖诱导的巨噬细胞炎症表型

【目的】探讨伊马替尼（Ima）在体外对脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症表型的影响。【方法】RAW264.7细胞在LPS（0.1μg/mL）或/和Ima（1μmol/L,5μmol/L）处理后,通过Q-PCR方法检测细胞因子IL-1β、IL-10、CCL2、iNOS、TNF-α和Arg1的mRNA表达变化;采用Western Blot检测iNOS蛋白表达变化以及NF-κB和MAPK信号通路活化情况;利用ELISA法检测细胞上清IL-1β、CCL2、IL-10和TNFα的蛋白表达情况。【结果】与对照组相比较,LPS刺激8h后,RAW264.7细胞内的炎症指标IL-1β、CCL2、iNOS和TNF-α的mRNA水平显著升高（P<0.001）以及抗炎指标IL-10的mRNA水平也明显升高（P<0.001）;LPS刺激24h后,细胞上清中IL-1β、IL-10、CCL2和TNF-α的蛋白水平显著上升（P<0.001）,细胞内iNOS蛋白表达以及p65,p38,ERK和AKT的磷酸化水平显著增加。和LPS组相比,Ima提前处理后,IL-1β、CCL2、iNOS和TNF-α的mRNA及蛋白水平显著下降（P<0.01,P<0.001）而IL-10的mRNA及蛋白水平显著升高（P<0.001）,这种抑制作用具有剂量依赖性。Ima的预处理抑制了LPS诱导的p65,p38,ERK和AKT磷酸化。单独用Ima处理RAW264.7细胞后,细胞的功能状态未见明显的改变。【结论】伊马替尼可抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症表型,这种作用与抑制NF-κB和MAPK信号通路的过度激活有关。