神经干细胞向多巴胺能神经元诱导分化研究进展

在帕金森病的细胞移植治疗研究中 ,如何在体外获得足够的多巴胺能神经元一直是一个难以解决的问题。干细胞的研究让人们看到了希望的曙光 ,利用干细胞不仅能在体外大量得到相关的神经元 ,而且也可能解决胎脑移植引发的伦理问题。本文就神经干细胞向多巴胺能神经元诱导分化及相关因素的研究进展作一综述。     

AngⅡ诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的时间效应

目的:体外分离培养神经干细胞(NSCs),探讨血管紧张素II(AngII)诱导NSCs向多巴胺(DA)能神经元分化的时间效应。方法:取第二代NSCs在含有AngII的诱导分化液中培养,根据诱导持续时间不同,分为A(10d),B(14d),C(17d)和D(21d)四组。终止诱导后,用免疫学法检测分化细胞中DA能神经元标志物酪氨酸羟化酶(TH)的表达,半定量-PCR测定THmRNA的相对表达量。结果:在AngII作用下,B,C组分化细胞数量均比A组增多,细胞胞体饱满,突起粗长,而D组细胞部分开始老化、脱壁悬浮。其中,C组TH阳性细胞率最高(15.64%),且THmRNA相对表达量(0.5047±0.0212)明显高于其他三组(P0.05)。结论:AngII诱导NSCs分化成DA能神经元存在分化的时间效应,诱导持续达17d时分化细胞中DA能神经元的比例最高。     

低氧促进hMSCs 向多巴胺能神经元分化

目的观察低氧对体外培养的人骨髓间充质干细胞(hMSCs)向多巴胺能神经元分化的影响。方法采用细胞免疫化学法、流式细胞分析和高效液相色谱—电化学法,检测多巴胺能神经元的数量以及诱导分化后培养基中多巴胺的含量。结果低氧处理后,低氧分化组酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元数量明显增多,为常氧分化组的3倍(P<0.01),并且分化后的神经细胞合成的多巴胺(DA)及其代谢产物高香草酸(HVA)含量也高于常氧分化组(P<0.05)。结论低氧可促进hMSCs向多巴胺能神经元方向分化,这为hMSCs临床应用于治疗帕金森病提供了新的思路。     

影响多巴胺能神经元体内外分化的因素

帕金森病是神经系统变性疾病,以黑质多巴胺能神经元变性缺失为特征。现在,人们通过对多巴胺能神经元体内外分化条件的研究,获得利于其分化和存活的最佳条件,为帕金森病的细胞替代治疗提供充足的多巴胺能神经元。本文对体内外神经干细胞向多巴胺能神经元诱导分化的影响因素做一综述。     

银杏内酯B体外诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化

目的:探讨银杏内酯B(GKB)对大鼠中脑神经干细胞(NSCs)体外诱导分化为多巴胺能神经元的作用。方法:采用无血清培养技术从大鼠胚胎中脑组织中分离培养出神经干细胞克隆球,然后分为2组诱导分化,对照组分化培养液中仅含10%FBS,银杏内酯B组在对照组分化培养液的基础上加入终浓度为40μg/ml的银杏内酯B。2周后免疫印迹检测分化的细胞中多巴胺能神经元发育和分化调节因子Nurr1蛋白的表达情况;免疫荧光检测分化神经元中酪氨酸羟化酶(TH)标记的多巴胺能神经元数量和分化情况。结果:对照组Nurr1蛋白相对表达量很低,仅有极少量的神经干细胞分化为不成熟的多巴胺能神经元;银杏内酯B组Nurr1表达显著升高,分化的多巴胺能神经元较多,且细胞形态较成熟,突起较丰富。结论:银杏内酯B具有诱导中脑NSCs向多巴胺能神经元分化的作用,其作用机制可能与上调Nurr1表达有关。     

神经营养因子对中脑黑质多巴胺能神经元的作用

神经营养因子对帕金森氏病等神经退行性疾病的治疗显示出诱人的前景。在对中脑黑质多巴胺能神经元有作用的神经营养因子当中 ,以胶质细胞系源性神经营养因子和脑源性神经营养因子的效应更强大。此外 ,中脑黑质多巴胺能神经元的主要靶区纹状体细胞以及该神经元局部的胶质细胞可产生对此神经元有作用的神经营养因子。本文概述了有关的研究成果 ,并对神经营养因子运用于帕金森氏病的治疗研究提出了展望     

低氧条件下中脑神经干细胞向多巴胺能神经元的分化

传统的帕金森氏病(Parkinson’s disease,PD)以药物治疗为主,随着病程进展治疗效果逐渐下降并出现精神和行为等方面的副作用。由于PD的病理变化是中脑黑质多巴胺能神经元特异性的坏死,导致多巴胺(dopamine,DA)及其代谢物释放的减少。故补充足够量的DA能神经元就     

IL-1仅及与IL-11、LIF和GDNF联合诱导胚鼠皮质、中脑神经干细胞向多巴胺神经元分化的比较

为比较皮质和中脑来源的神经干细胞(NSCs)定向分化为多巴胺神经元的情况,应用无血清和单克隆培养技术,分别从皮质和中脑组织中分离克隆、扩增NSCs,然后分成3组诱导分化:①对照组用10%胎牛血清诱导分化;②IL-1α组在10%胎牛血清的基础上加IL-1α诱导分化;③联合因子组在10%胎牛血清的基础上加IL-1α、IL-11、LIF及GDNF进行诱导分化。用酪氨酸羟化酶(TH)免疫组化染色检测多巴胺神经元。在100倍镜下随机取5个视野,计数每个视野中的TH阳性神经元数;并用图像分析软件处理TH阳性神经元的胞体面积和细胞周长;用STATA7.0统计软件进行统计处理。结果显示,皮质对照组中仅见极少的TH阳性神经元(0.25±0.163),中脑对照组中见少量TH阳性神经元(2±0.378);而皮质IL-1α组有较多的TH阳性神经元(15.5±0.866),中脑IL-1α组中的TH阳性神经元则为皮质IL-1α组的150%(22.875±1.517);皮质联合因子组中的TH阳性神经元数(25.75±0.940)与中脑联合因子组中的TH阳性神经元数(28.875±2.125)接近,无显著差异。胞体面积和细胞周长的结果显示出IL-1α组和联合因子组大于对照组、而联合因子组又优于IL-1α组的趋势。上述结果提示,中脑来源的NSCs本身具有一定的分化为多巴胺神经元的区域特异性,而皮质来源的NSCs在IL-1α、IL-11、LIF及GDNF等细胞因子的诱导下可改变其区域特异性而分化为较多较为成熟的多巴胺神经元。     

体外诱导脂肪基质干细胞向多巴胺能神经元的分化

背景：鉴于脂肪干细胞具有来源丰富、取材简便、易分离纯化和扩增、可进行自体移植并有多项分化潜能等特点,有学者认为其可作为治疗帕金森病的种子细胞来源。 目的：观察大鼠脂肪基质干细胞体外向多巴胺能神经元诱导分化及分泌功能。 方法：利用胶原酶消化法获得SD 大鼠脂肪干细胞,体外培养至第 3代时用碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和抗坏血酸联合诱导作为实验组,以单纯加入体积分数5%血清为对照组。 结果与结论：实验组诱导3 d后,免疫荧光法和免疫组织化学法均可检测到诱导后的细胞表达酪氨酸羟化酶。实验组分化出多巴胺能神经元比例显著高于对照组(P < 0.01)。ELISA法检测实验组连续诱导3 d上清中有多巴胺分泌,诱导的第一二天中多巴胺浓度呈上升趋势,第3天有所下降。说明脂肪干细胞具有向多巴胺能神经元分化的能力。     

MMS2在血管紧张素Ⅱ诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化过程中的作用

目的 探讨甲基磺酸敏感蛋白2(MMS2)在血管紧张素Ⅱ(AⅡ)诱导神经干细胞(NSCs)向多巴胺(DA)能神经元定向分化过程中的作用.方法 体外分离培养新生鼠大脑来源的NSCs.通过巢蛋白免疫细胞化学方法对神经前体细胞进行鉴定;在此基础上,将第2代的NSCs按实验设计分成6组:A:对照组;B:AⅡ组;C:AT1受体拮抗...     

神经干细胞定向分化为多巴胺能神经元过程中Mash1及Hes1基因的表达

目的建立神经干细胞(NSCs)分化为多巴胺能神经元的体外模型,并进一步研究此分化过程中Mash1及Hes1基因的表达变化。方法无菌条件下取孕14-16d胎鼠端脑进行NSCs体外培养,将NSCs进行Nestin免疫荧光检测,对照组和实验组(GDNF+IL-1α联合组)诱导2周后进行β-tubulinⅢ和TH免疫荧光染色,计算各组阳性细胞率,荧光定量PCR技术检测P4代NSCs分化1周和2周时Mash1及Hes1基因的表达变化。结果免疫荧光检测结果显示,NSCs的Nestin阳性细胞率为(93.04±3.55)%,诱导分化2周后对照组、实验组β-tubulinⅢ阳性细胞率分别为(12.65±1.58)%和(33.95±2.97)%,两组间比较差异存在统计学意义(P0.05)。对照组、实验组TH阳性细胞率分别为(1.46±0.41)%、(15.51±1.94)%,差异存在统计学意义(P0.05)。荧光定量PCR结果显示,NSCs诱导分化后,Mash1基因表达较未分化状态时升高,各组间比较差异存在统计学意义,实验组高于对照组(P0.05),分化2周高于1周(P0.01);Hes1基因于分化后表达降低,对照组与对实验组之间以及分化1周与2周之间比较差异没有统计学意义(P0.05)。结论 GDNF和IL-1α联合作用能够诱导NSCs定向分化为多巴胺能神经元;Mash1与Hes1基因可能参与NSCs分化为多巴胺能神经元的过程。     

胶质细胞源性神经营养因子促进中脑源神经干细胞增殖和向多巴胺能神经元分化

目的:探讨胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对中脑源神经干细胞(mNSCs)增殖、分化能力和表达垂体同源盒家族因子3(Pitx3)、孤儿核受体相关因子1(Nurr1)和酪氨酸羟化酶(TH)蛋白的影响。方法:取E14.5d大鼠中脑组织体外培养原代mNSCs,增殖培养传三代后进行分化实验;使用免疫荧光方法检测培养分化的mNSCs表达Pitx3、Nurr1和TH蛋白。结果:在GDNF作用下,体外培养的mNSCs克隆球直径增大,数量增多;分化的神经元中Pitx3、Nurr1和TH蛋白表达增加(P0.05)。结论:在体外培养条件下,GDNF有促进mNSCs增殖和向多巴胺能神经元分化的作用。     

巨噬细胞迁移抑制因子促进人胚胎干细胞分化为腹侧中脑多巴胺能神经祖细胞

背景：细胞替代疗法是一种可以治疗帕金森病的非常有前景的方法。目前将人多能干细胞进行神经分化的主要方案是“双SMAD”抑制方案,利用阻断糖原合酶激酶3β来激活WNT通路信号,随后利用音猬因子信号与骨形态发生蛋白信号之间的调控相结合,可以精确地控制人多能干细胞从底板区域到顶板区域特异性的细胞命运。巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)是一类具有独特结构的多效免疫调节细胞因子,在多项研究中证明MIF对神经发育和分化非常重要。然而,MIF是否参与诱导干细胞的分化还是未知的。目的：在“双SMAD”抑制分化方案的基础上,通过在培养基中添加不同浓度MIF及其抑制剂(S,R)-3-(4-羟基苯基)-4,5-二氢-5-异噻唑乙酸甲酯(ISO-1),观察其对人胚胎干细胞分化为中脑多巴胺能祖细胞的影响,以期寻找解决人胚胎干细胞分化为中脑多巴胺能祖细胞过程异质性问题的新途径。方法：CCK8检测添加不同浓度MIF和ISO-1培养人胚胎干细胞的存活情况。免疫荧光法检测人胚胎干细胞上MIF受体CD74、CD44、CXCR7的表达。在胚胎干细胞分化...     

无血清培养条件下诱导胚胎干细胞向多巴胺能神经元定向分化的实验研究

目的 寻求无血清、无饲养层细胞存在的情况下,胚胎干细胞向多巴胺能神经元定向诱导分化的最佳条件。方法 采用阶段诱导的方法,在不同阶段加入不同的生长因子,对新近分离的胚胎干细胞进行分化培养。首先向无血清培养液中分别加入bFGF和LIF,实现由胚胎干细胞向神经前体细胞的定向分化,通过巢蛋白(nestin)免疫细胞化学染色对神经前体细胞进行鉴定;在此基础上,撤除bFGF和LIF,加入B27无血清培养基、IL-1后继续培养,实现由神经前体细胞向多巴胺能神经元的定向诱导分化;通过酪氨酸羟化酶(TH)免疫细胞化学染色对多巴胺能神经元进行鉴定。结果 有85％的细胞团呈nestin免疫阳性着色,多巴胺能神经元的分化比率为13％,较多巴胺能神经元的自然分化比率(4％)有明显提高。结论 在无血清、无饲养细胞的情况下,我们采用阶段诱导的方法,在不同的阶段加入不同的生长因子,可有效诱导多巴胺能神经元的分化,使胚胎干细胞的诱导分化过程更易于操作。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为多巴胺能神经元

骨髓间充质干细胞(BMSCs)是存在于骨髓中的非造血干细胞,在体外一定条件下可向神经细胞分化。本实验通过密度梯度离心获取人骨髓中的单个核细胞,贴壁培养纯化BMSCs,并用脑源性神经营养因子(BDNF)、forskolin(FSK)和多巴胺(DA)联合对BMSCs进行诱导,电子显微镜观察诱导后细胞是否具有成熟神经元的超微结构特点;免疫细胞化学和RT-PCR检测DA能神经元分化过程中的标志物酪氨酸羟化酶(TH)的表达以及转录因子Nurr1、Ptx3、和Lmx1b的表达。结果显示:诱导2周后,电镜下可见细胞浆中有大量密集的呈扁平囊状的粗面内质网及其间的一些游离核糖体,以及神经丝。RT-PCR结果显示NSE(neuron specific enolase)、Nurr1、Ptx3、Lmx1b和TH的mRNA均有表达;免疫细胞化学表明诱导2周后TH阳性细胞的表达较诱导3d后明显提高。上述结果表明BDNF、FSK和DA可以在体外诱导人BMSCs定向分化为DA能神经元。     

定向诱导人尿液细胞源性多能干细胞向多巴胺能神经元的分化

目的探讨定向诱导人尿液来源诱导性多能干细胞(U-iPS)向多巴胺(DA)能神经元分化。方法单层贴壁法体外培养U-iPS,通过时向性添加TGF-β及BMP信号通路抑制剂,SHH细胞因子,GSK3β抑制剂Chir99021将U-iPS诱导为DA能神经前体细胞(NPCs),通过添加BDNF/GDNF等细胞因子将其进一步分化为DA能神经元。在诱导分化的4个时间点(第0天、7天、14天及25天)采用RT-qPCR和免疫荧光检测多能干细胞标志物Oct4与Nanog的表达;NPCs标志物Nestin、Pax6和Foxa2的表达;DA神经前体细胞标志物Lmx1a和En1的表达;神经元标志物Tuj1的表达以及DA能神经元标志物TH的表达情况。以人皮肤成纤维细胞来源的iPS(F-iPS)向DA能神经元的诱导分化作为对照进行分化效率的比较。结果 U-iPS在第0天表达多能干标志物Oct4和Nanog;诱导第7天能转化为Nestin、Pax6及Foxa2阳性的NPCs;第14天转化为Lmx1a和En1阳性的DA能神经前体细胞;第25天分化得到的神经元样细胞表达神经元标志物Tuj1,其中部分细胞表达DA能神经元标志物TH。各时间点神经类细胞标志物的表达与F-iPS诱导分化得到的神经类细胞标志物的表达差异无统计学意义(P0.05)。结论 U-iPS细胞具有向DA能神经元分化的潜力,能在体外经过诱导分化得到TH阳性的DA能神经元,且与F-iPS向DA能神经元分化的效率无明显差异。     

常氧及低氧条件下胶质源性神经营养因子体外诱导中脑神经干细胞向多巴胺能神经元的分化

背景：神经干细胞的定向诱导分化和扩增受细胞自身基因和外来信号的调控。 目的：观察中脑源性神经干细胞在常氧、低氧和胶质源性神经营养因子诱导下向多巴胺能神经元的分化情况。 方法：无菌条件下分离E12小鼠胚胎腹侧中脑组织,胰酶消化和机械吹打制成单细胞悬液,在无血清培养基中培养扩增;Nestin免疫细胞化学染色方法鉴定神经干细胞。在有血清培养基中对纯化神经干细胞自然分化;神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白免疫细胞化学染色方法分别鉴定神经元和星形胶质细胞。建立常氧和低氧环境,设置常氧组、常氧+胶质源性神经营养因子组、低氧组、低氧+胶质源性神经营养因子组,按实验分组在有血清条件下诱导分化。 结果与结论：在低氧条件下,中脑神经干细胞向多巴胺能神经元分化均高于常氧组;尤其是低氧环境和胶质源性神经营养因子诱导下向多巴胺能神经元分化比例更高,表型更成熟。说明低氧环境下胶质源性神经营养因子可明显促进中脑神经干细胞分化为数量足够、形态及功能成熟的多巴胺能神经元。     

人羊膜间充质干细胞生物学特征及向多巴胺能神经元样细胞的分化

背景：羊膜间充质干细胞具有类似胚胎干细胞多潜能的特点,在再生医学等多种领域的临床应用具有广泛的实用性和明确的良好前景。 然而,目前对于羊膜间充质干细胞的生物学特性和分化潜能的认识仍然了解甚少。目的：建立体外分离和纯化人羊膜间充质干细胞的方法,检测羊膜间充质干细胞的体外分化特点,确定羊膜间充质干细胞在体外诱导条件下向多巴胺能神经元样细胞分化的潜能。方法：采用胰蛋白酶和胶原酶Ⅱ分步消化法从羊膜中分离羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞;采用percoll梯度离心方法对羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞进行纯化;流式细胞术检测羊膜间充质干细胞的表面标志,确定羊膜间充质干细胞细胞表面抗原的表达特征;对体外培养的羊膜间充质干细胞进行成脂肪和成骨诱导,确定其多向分化的潜能;采用神经细胞条件培养体系诱导羊膜间充质干细胞向多巴胺神经细胞分化,通过免疫荧光染色和激光共聚焦荧光显微镜观察和鉴定诱导后多巴胺神经元样细胞的生成。结果与结论：从羊膜组织成功分离、纯化和培养出羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞。羊膜来源的间充质干细胞不仅具有典型的间充质干细胞标志,而且保留了一些胚胎干细胞的OCT-4,SOX-2和KLF4等特有干细胞标志,可以诱导分化成为脂肪细胞和骨细胞,显示羊膜间充质干细胞保持了较为原始的胚胎干细胞的特点,具有多向分化的潜能。诱导分化之前的原代羊膜间充质干细胞表达固有的多种神经细胞标记,体外诱导后羊膜间充质干细胞可分化成为β-微管蛋白Ⅲ、神经元特异性核蛋白、酪氨酸羟化酶、胶质纤维酸性蛋白、髓鞘碱性蛋白和巢蛋白等阳性表达的多巴胺能神经元样细胞。结果表明人羊膜来源的间充质干细胞所保留的多向分化潜能和有效分化成为多巴胺能神经元样细胞的特性。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

核受体相关因子1基因转染骨髓源性神经干细胞体外诱导向多巴胺能神经元的分化

背景：核受体相关因子1基因修饰是否促进骨髓源性神经干细胞向多巴胺能神经元分化少见报道。 目的：观察核受体相关因子1基因修饰骨髓源性神经干细胞在体外诱导分化为多巴胺能神经元的作用。 方法：体外培养和纯化大鼠骨髓源性神经干细胞,将骨髓源性神经干细胞分为4组,将未转染的骨髓源性神经干细胞随机分为对照组,脑源性神经营养因子组;将筛选出的重组质粒转染阳性的神经干细胞分为核受体相关因子1组和核受体相关因子1+脑源性神经营养因子组。 结果与结论：RT-PCR显示转染的骨髓源性神经干细胞4 d后核受体相关因子1高表达,分化结果显示：核受体相关因子1+脑源性神经营养因子组细胞内酪氨酸羟化酶在mRNA水平上的表达量最高,神经干细胞贴壁分化后各组酪氨酸羟化酶阳性细胞比例均明显高于对照组,其中以核受体相关因子1+脑源性神经营养因子组分化比例最高,为(52.44±15.9)%。提示核受体相关因子1基因修饰可促进骨髓源性神经干细胞向多巴胺能神经元分化,并通过脑源性神经营养因子的诱导作用,在体外可获得大量的多巴胺能神经元。     

P>核受体相关因子1基因过表达诱导神经干细胞分化为多巴胺能神经元/P>

目的 探讨核受体相关因子1（Nurr1）基因对大鼠中脑神经干细胞(NSCs)体外诱导分化为多巴胺能神经元的作用。方法 通过基因重组技术构建pEGFP-N1-Nurr1真核表达载体,用电穿孔法将重组质粒转染第3代NSCs,用荧光显微镜观察转染效率,免疫印迹法检测基因表达效果;并对转染后的NSCs进行体外分化培养3周,用免疫荧光双标技术检测酪氨酸羟化酶（TH）和微管相关蛋白-2（MAP-2）的表达。结果电穿孔法转染NSCs 48h后转染效率达35%,1周后免疫印迹法检测到Nurr1蛋白高表达,约为对照组的5倍;Nurr1基因转染的NSCs分化为TH阳性神经元的比率为15.45%,明显高于对照组,而MAP-2阳性神经元数量与对照组相似。结论Nurr1基因过表达可以诱导NSCs向TH阳性的多巴胺能神经元分化。