硫化镍转化人支气管上皮细胞基因差异表达芯片的研究

背景与目的近年研究发现硫化镍(NiS)可引起人支气管上皮细胞(humanbronchialepithelialcell,16HBE)发生恶性转化及转化细胞致癌性,其机制可能与NiS引起基因突变、多种转录因子的异常表达有关。为此,本研究利用NiS恶性转化的体外培养细胞模型,用cDNA微阵列技术研究经NiS转化后的16HBE细胞基因的差异表达,从基因组水平探讨NiS所致细胞恶变的相关基因差异改变。方法分别提取16HBE和经NiS单独处理发生转化的NiS16HBE细胞的总RNA,逆转录合成cDNA并以Cy3dCTP和Cy5dCTP荧光素分别标记制作探针。探针混合后与含4000个人类基因的芯片杂交。以ScanArray4000扫描仪扫描芯片,以GenPixPro3.0软件分析荧光信号,然后对差异表达的基因进行生物学信息分析。结果NiS16HBE细胞样本与16HBE细胞样本比较,呈现差异表达的基因有151个(3.78%),其中81个(53.64%)上调,70个(46.36%)下调。结论NiS的转化作用与应激反应基因、免疫相关基因、DNA合成和修复基因、代谢相关基因、原癌基因和抑癌基因等多类基因的异常表达有关。     

cDNA芯片检测STAT5诱骗核苷酸对K562细胞凋亡相关基因的影响

目的：转录因子STAT5在慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)中组成性激活,并与CML细胞恶性表型密切相关,本研究用cDNA芯片检测方法探讨诱骗核苷酸(decoy ODNs)抑制STAT5对白血病K562细胞株凋亡相关基因的影响。方法：分别提取decoy ODNs处理前后的K562细胞总RNA,逆转录合成Cy3、Cy5标记的cDNA探针,与人14K基因表达谱cDNA芯片(V2.0)杂交,扫描获得数据后,用Genespring软件分析对照组和实验组的差异表达基因,半定量RT- PCR验证cDNA芯片结果。结果：2张cDNA芯片检测重复性良好(R=0.9799)。在13824个标记的基因中,检出413个上调基因,其中包括：TIAF1、GAB1、GYPA、DAPK3、TNFRSF1B、IRF1和PML等在内的18个凋亡相关基因；在检出的332个下调基因中,发现PIM1、CCND2、CCND1、MYC和BCL2L1等在内的11个凋亡相关基因；部分基因经半定量RT-PCR证实与cDNA芯片结果一致。结论：Decoy ODNs抑制STAT5信号通路后可引起K562细胞多种凋亡相关基因的变化,本实验为进一步研究STAT5信号通路所调控的凋亡相关基因提供了依据。     

雷公藤内酯醇对胰腺癌细胞株SW1990基因表达谱的影响

目的:应用基因表达谱芯片研究胰腺癌细胞株(SW1990)在雷公藤内酯醇作用后其基因表达的差异性。方法:用Cy5和Cy3两种荧光染料通过逆转录反应将加药组和对照组的SW1990细胞的mRNA分别标记成两种探针,并与载有一组靶基因的表达谱芯片杂交,通过扫描荧光强度,计算机软件分析,寻找经雷公藤内酯醇作用后表达有差异的基因。对芯片结果中两个表达有改变的基因行荧光定量PCR验证。结果:胰腺癌细胞SW1990受雷公藤内酯醇作用4h后,共筛选出11条差异表达基因,且全部下调。结论:雷公藤内酯醇可能部分通过下调C-MYC、ETS2、TGIF、RTP801等基因来发挥其有效的抗肿瘤特性。     

益气养阴方抑制肿瘤转移及对肿瘤相关基因表达谱的影响

背景与目的： 探讨益气养阴方抑制肿瘤转移及对肿瘤相关基因表达谱的影响。 材料与方法：制备20只小鼠肌肉移植瘤模型,随机分为对照组和实验组,每组10只。对照组小鼠按0.01 ml/g灌胃生理盐水,实验组小鼠按0.01 ml/g灌胃益气养阴方水煎液(每毫升药液含4.3 g原生药材)。35 d后处死小鼠,称取移植瘤重量,计算肺转移瘤生长指数。同时提取肿瘤组织总RNA,用RT-PCR逆转录合成cDNA并分别用Cy3-dUTP、Cy5-dUTP标记对照组和药物组cDNA,与含有140 000点的小鼠基因表达谱芯片杂交,杂交芯片扫描结果用GenePixPro 3.0软件进行分析统计。 结果： 益气养阴方明显降低小鼠肌肉移植瘤重量(与对照组比较,P<0.01),肺转移瘤生长指数也明显少于对照组(与对照组比较,P<0.05),差异基因表达谱分析表明本方对与肿瘤浸润转移、信号转导、细胞增殖、细胞凋亡及与代谢等有关的多个靶位基因进行调节。 结论： 益气养阴方具有抑制肿瘤转移的作用。     

基因芯片技术筛选非小细胞肺癌A549细胞顺铂耐药相关基因的研究

目的:采用基因芯片技术筛选人非小细胞肺癌(NSCLC)耐顺铂(DDP)A549细胞与A549细胞之间的差异表达基因,为进一步研究其耐DDP相关分子机制提供资料。方法:分别抽取耐DDPA549细胞与A549细胞的总RNA,采用逆转录的方法,制成cDNA链,并以2种荧光Cy5和Cy3标记后作为探针,与含有17101条人类16KcDNA基因表达谱芯片进行杂交,扫描荧光强度,并用计算机进行分析,寻找两组差异表达基因。结果:在17101条基因中,3株A549/DDP和3株A549细胞共同差异表达基因24条,其中上调基因12条,下调基因12条。结论:A549细胞发生DDP耐药过程中有多个基因参与,两者共同差异表达的24条基因可能参与其耐DDP分子机制。     

松胞素 B对白血病 K562细胞基因表达谱的影响

背景与目的：近年来兴起的DNA芯片技术能在一次杂交中同时监测数以千计的基因表达,能大大加速肿瘤药作用机制的研究和药物治疗靶点的发现。本研究的目的是利用基因表达谱芯片研究松胞素B（cytochalasinB,CB,旧称细胞松弛素B）对白血病K562细胞基因表达谱的影响。方法：利用限制性显示RCR（restriction disphalPCR,RD-PCR)技术扩增K562细胞cDNA片段。取其中277个cDNA片段按设计的矩阵打印在玻片上,制成基因芯片;用CB处理K562细胞24h,分别提取对照组和处理组细胞总RNA,将两组等量的细胞总RNA纯化为mRNA,反转录为cDNA,利用RD-PCR技术进行扩增标记;与芯片杂交后扫描分析处理前后表达差异的基因。结果：在所收集的探针中,对照组和处理组细胞间存在差异表达的基因。共筛选到CB处理后表达下调的基因18条。结论：CB诱导后的K562细胞部分基因表达呈下调趋势,其中大部分基因与细胞增殖,信号转导,转录调节相关。     

寡核苷酸阵列引物延伸技术在p53基因突变检测中的应用

背景与目的越来越多的研究表明,许多疾病的发生、个体化治疗及预后与基因的SNP密切相关,对其快速、准确的检测在基因组研究和应用中具有重要的意义。本文应用寡核苷酸阵列引物延伸法对人类肿瘤相关性最高的基因——p53基因进行SNPs的平行检测。方法根据寡核苷酸基因芯片上延伸引物的设计原则设计出12条p53基因第三外显子上的SNP检测的延伸引物,点样制备7×8点阵的寡核苷酸基因芯片,将巢式PCR扩增出的p53基因片段与芯片杂交,在Klenow酶的介导下进行荧光标记的碱基延伸反应、洗脱、扫描。同时p53基因片段进行测序分析。结果经荧光检测分析,芯片经延伸反应后出现了明显的Cy3-dUTP或Cy5-dCTP荧光标记信号,检测灵敏度好,结果与测序验证结果一致。结论采用寡核苷酸芯片的阵列引物延伸技术可以在基因水平实现对p53基因的多个位点的高灵敏度平行检测,是一种高效、价廉、准确的SNP检测方法。     

胃癌患者原癌基因和抑癌基因的表达谱研究

目的 :用基因表达谱芯片对人正常胃和胃癌组织原癌和抑癌基因表达的差异进行研究比较。方法 :利用胃和胃癌组织的mRNA通过逆转录方法 ,将Cy3和Cy5 2种荧光分别标记到 2组cDNA上制成探针 ,然后和表达谱芯片进行杂交后扫描 ,通过计算机分析判定 2种基因是否在上述组织中存在差异表达。结果 :在 195条原癌及抑癌基因中 ,存在差异表达的共 13条 ,表达上调的 6条 (0 0 71% ) ,表达下调的 7条 (0 0 83% )。结论 :认为应用这种方法识别出的 2种基因对胃癌的诊断和治疗具有重要的潜在价值     

胰腺癌伴淋巴结转移的基因芯片研究

目的 利用基因芯片技术分析伴与不伴淋巴结转移胰腺癌组织中的差异表达基因。方法 将4000个人类全长基因的PCR产物点样于特殊处理后的玻片上制备基因芯片。用逆转录的方法,分别将两种荧光Cy3-dUTP和Cyt-dUTP标记正常胰腺组织和胰腺癌组织mRNA,以制备cDNA探针,并与芯片杂交。以ScanArray 3000荧光扫描仪扫描芯片上两种荧光信号,获得的荧光信号图像用计算机分析。每点上两种荧光信号的强度分别代表Cy3-dUTP和Cy5-dUTP的量。最后,计算每点的Cy5和Cy3比值。结果 在所检测的2例伴淋巴结转移和2例不伴淋巴结转移的胰腺癌标本中,56个基因（其中包括24个已知基因）有表达差异。结论 基因芯片技术为阐明人类胰腺癌伴淋巴结转移的特异性基因表达提供了有效方法。     

沙棘籽渣黄酮诱导人乳腺癌细胞凋亡相关基因的表达谱变化

背景与目的:研究显示,沙棘含有多种黄酮类化合物,具有抗氧化、防辐射等作用。cDNA基因表达谱芯片技术具有高通量、高效、快捷的特点,本实验拟利用cDNA基因表达谱芯片研究沙棘籽渣黄酮(flavonoidsfromseedresiduesofHippophaerhamnoidesL.,FHR)诱导人乳腺癌细胞Bcap鄄37凋亡相关基因的表达谱变化。方法:抽提FHR作用前后的Bcap鄄37细胞总RNA,经逆转录合成荧光分子(Cy3/Cy5)标记的cDNA探针,与含有13824个cDNA基因的人14K基因表达谱芯片杂交,利用Genespring软件分析实验组和对照组之间差异表达的基因,对所获得的基因进行生物信息学分析。结果:实验组与对照组中表达上调的基因有305条,表达下调的基因有361条。差异表达的与细胞凋亡相关的基因有32条,占芯片基因总数的0.23%,其中表达上调的有25条(平均Ratio值为3.071),下调的有7条(平均Ratio值为0.418)。生物信息学分析表明,FHR在对Bcap鄄37细胞作用的过程中,该32条差异表达基因与Bcap鄄37细胞凋亡有关,其中包括CTNNB1、TSSC3、IGFBP4、IGFBP6、GADD34、TNFRSF10B、Caspase鄄9和PCNA等。结论:FHR诱导Bcap鄄37细胞凋亡的机制是由多基因协同,并通过胞内和胞外信号转导途径共同调节完成。     

In vivo tumor imaging using a near-infrared-labeled endostatin molecule

PURPOSE: Endostatin is a 20-kD C-terminal fragment of collagen XVIII and is a potent inhibitor of angiogenesis. Imaging technologies that use near-infrared (NIR) fluorescent probes are well suited to the laboratory setting. The goal of this study was to determine whether endostatin labeled with a NIR probe (Cy5.5) could be detected in an animal after intraperitoneal injection and whether it would selectively localize in a tumor. METHODS: Endostatin was conjugated to Cy5.5 monofunctional dye and purified from free dye by gel filtration. LLC, a murine tumor, was implanted in C57BL/6 mice. The tumors were allowed to grow to 350 mm(2), at which point the mice were injected with 100 microg/100 microL endostatin-Cy5.5 and imaged at various points under sedation. Imaging was performed using a lightproof box affixed to a fluorescent microscope mounted with a filter in the NIR bandwidth (absorbance maximum 675 nm and emission maximum 694 nm). Images were captured by a CCD and desktop computer and stored as 16-bit Tiff files. The mice were also serially imaged for uptake into the tumor and washout from the tumor. RESULTS: After intraperitoneal injection, endostatin-Cy5.5 was quickly absorbed, producing a NIR fluorescent image of the tumors at 24 h that persisted through 7 days. However, the signal peaked at 42 h after injection. Control animals included mice containing green fluorescent protein (GFP) under the control of an actin promotor, which expresses GFP in every cell; tumor-free mice injected with endostatin-Cy5.5; mice with tumors that were not injected with endostatin-Cy5.5; and mice with tumors injected with dye alone. In the four sets of control animals, no NIR photon emissions were detected at 24 hours or 5 days. Only the GFP mouse was detected using the GFP filter. Unlike previous analogous studies with 4-N-(S-glutathionylacetyl)amino) phenylarsenoxide (GSAO)-Cy5.5 in which the tumor image faded with time, the endostatin-Cy5.5 NIR signal was emitted from the tumor up to 7 days after injection, the last time point examined. CONCLUSION: The results of this study demonstrated that endostatin covalently bound to Cy5.5 will migrate from a distant intraperitoneal injection site to a tumor. These data indicate that endostatin-Cy5.5 is appropriate for selectively imaging tumors in experimental animals. Furthermore, data suggest that the anti-angiogenic effect of endostatin occurs through a local mechanism of action, within the tumor or tumor vasculature, rather than through a systemic mechanism.     

Near-infrared fluorescent imaging of tumor apoptosis

Noninvasive imaging using radioactive annexin V is an emerging strategy for the assessment of cell death in vivo (F. G. Blankenberg, and H. W. Strauss. Apoptosis, 6: 117-123, 2001.). Therefore, we investigated whether annexin V labeled with the fluorophore Cy5.5 (Cy) could serve as a probe for imaging of tumor apoptosis using near infrared fluorescence (NIRF). We prepared active Cy-annexin (an equimolar dye:protein ratio) that bound to apoptotic Jurkat T cells and an inactive Cy-annexin probe (>2 dyes/mol protein) that did not. Active Cy annexin was used to image a 9L gliosarcoma, constitutively expressing green fluorescent protein marker, and the CR8 variant of Lewis lung carcinoma, stably transfected to express DsRed2. The expression of transfected fluorescent protein provided an indication of tumor margins and a means of defining tumor-associated NIRF signal intensity with both tumor models. Tumors were imaged with and without cyclophosphamide treatment. In both tumor models active Cy-annexin V tumor NIRF signal increased two to three times after the treatment. Tumor NIRF signal developed by 75 min after active Cy-annexin injection and remained for a 20-h observation period. Inactive annexin V was used as a control in the CR8 carcinoma experiments and resulted in a low nonspecific signal. With the 9L gliomosacrcoma model, active Cy-annexin V bound to both tumor cells (Cy-annexin V staining only) and endothelial cells (costained with Cy-annexin V and antibody to the endothelial marker CD31). Our results demonstrate that active Cy-annexin can be used as a NIRF probe to image apoptosis from outside an intact living animal and may provide nonradioactive method of measuring the antiproliferative effects of cancer chemotherapeutic regimens.     

抗癌生物活性肽对BGC-823 细胞基因表达的影响*

目的:利用基因芯片技术分析一种新型抗癌生物制剂- 抗癌生物活性肽对人胃癌BGC-823 细胞的基因表达谱调控的影响,并对部分差异表达基因进行RT-PCR 检测,从而验证芯片的有效性。方法:订制表达谱芯片,分别将400 条和648 条人类基因的PCR 产物点样于特殊处理后的玻璃片上制备基因表达谱芯片。以加入不同浓度抗癌生物活性肽及处理不同时间的BGC-823 细胞为实验组,以生理盐水处理的BGC-823 细胞作为对照组,当确定最佳作用时间及抗癌生物活性肽有效作用浓度后,分别提取实验组与对照组细胞的总RNA,反转录成cDNA ,以两种荧光素Cy5 和Cy3 标记后作为探针,与制备好的表达谱芯片进行杂交,以生物信息学方法进行数据的处理和分析,并将其中的差异表达基因p15和HSP 701B 进行RT-PCR 的验证。结果:两张芯片上差异表达的基因共47个,其中上调27个,下调20个。这些基因按照功能分类涉及细胞周期、代谢酶、免疫相关、细胞凋亡、抑癌基因等类别,包括HSP 701B、HSP 75、HSP 90、磷脂酶D2（PLD 2）、凋亡抑制基因（IEX-1L）、人类杆状病毒IAP 重复序列3、E2 泛素耦联酶Ubch5c、人类缺氧诱导因子1 α 亚基、γ- 干扰素、TNF 诱导因子、人类黑色素瘤抗原p15基因等。同时RT-PCR 结果验证了芯片的检测的有效性。结论:抗癌生物活性肽具有调控人胃癌BGC-823 细胞基因表达的作用,其中对抑癌基因、热休克蛋白家族基因等有较明显的影响;基因芯片可以为阐明抗癌药物的作用机制提供有力的分子基础。      

肺腺癌及其转移淋巴结的基因表达谱研究

背景与目的： 利用基因芯片技术研究肺腺癌组织及其转移淋巴结组织基因表达差异。 材料与方法： 分别抽取3例肺腺癌组织、转移淋巴结组织的总RNA,通过逆转录合成cDNA,以两种荧光cy5和cy3标记,制备cDNA探针,并与含有1 152个人类全长基因的cDNA基因芯片进行杂交。以ScanArray4000荧光扫描仪扫描芯片上两种荧光信号,用计算机处理和分析。 结果： 3例肺腺癌组织和转移淋巴结组织标本中,8个基因有共同表达差异,其中上调基因5个,下调基因3个。 结论： 肺腺癌组织和转移淋巴结组织之间存在着基因表达差异,两者比较共表达差异的8个基因可能与肺腺癌的发展、转移有关。     

应用cDNA芯片分析与食管鳞癌相关的基因表达

目的：应用cDNA芯片技术研究食管鳞癌的异常基因表达,并对这些基因的功能进行初步分析。方法：选择382个肿瘤相关基因克隆,制备成cDNA芯片,提取食管鳞癌组织以及相应正常食管组织RNA,反转录后标记为cDNA探针,与自行制备的cDNA芯片杂交,经扫描及分析后筛选出两种组织中差异表达基因。结果：发现差异表达基因75个,表达上调基因44个,下调基因31个,包括癌基因、抑癌基因、细胞周期相关蛋白、粘附因子、基质金属蛋白酶、信号传导因子、生长因子及其受体、与细胞代谢相关的酶等。结论：食管鳞癌的发生发展涉及多基因改变,cDNA芯片技术是疾病基因筛选的有效方法。     

鼻咽癌T3-4N0期患者免疫相关基因的表达

背景与目的鼻咽癌患者发生颈部区域淋巴结转移是比较普遍的现象,但鼻咽癌T34N0期患者尽管肿瘤生长已超出鼻咽腔却不表现区域淋巴结转移的特征。为了探讨与这种现象有关的免疫相关因素,本研究对鼻咽癌T3鄄4N0期患者的外周血免疫细胞基因表达进行了研究。方法分离28例鼻咽癌T3-4N0期治疗前患者、例鼻咽癌28T1-2N2鄄3期治疗前患者和56例建康人的外周血淋巴细胞。分别提取这三组外周血免疫细胞的mRNA。以各组的mRNA为模板,反转录制备标有Cy5或Cy3荧光素的cDNA探针,将来自鼻咽癌样品的Cy5cDNA探针分别与来自健康人的Cy3-cDNA探针混合后,分为T1鄄2N2鄄3与T3鄄4N0组分别在480点的免疫相关基因芯片上进行杂交。将Cy5/Cy3<0.5定为鼻咽癌患者免疫细胞中的下调基因,Cy5/Cy3>2.0定为上调基因。以T1-2N2-3与T3-4N0患者免疫细胞的RNA为模板,用实时定量RT鄄PCR方法对2组芯片中Cy5/Cy3值>4.0(4条)和<0.25(3条)基因的表达进行测定。结果在2组基因芯片实验中,共有157条基因的Cy5/Cy3比值有明显的差异。其中106条基因的Cy5/Cy3值下调,条基因的51Cy5/Cy3值上调。实时定量RT鄄PCR检查显示,在来自T3鄄4N0期患者的样品中编码CD86、CD69、NFKB的基因的表达量比来自T1鄄2N2鄄3期患者的样品高。结论鼻咽癌T1鄄2N2鄄3与T3鄄4N0期群     

胚胎肺和正常肺组织基因表达谱差异

背景与目的:利用基因芯片技术研究胚胎肺和正常肺组织基因表达谱差异,筛选出人肺在发育过程中基因的变化.材料与方法:分别抽取胚胎肺组织和正常肺组织的总RNA并纯化mRNA,用逆转录的方法,将各mRNA的两种荧光cy5和cy3标记的cDNA链做探针,并与含有1 152条人类全长基因芯片上进行杂交.以ScanArray4000荧光扫描仪扫描芯片上两种荧光信号,用计算机处理和分析.结果:胚胎肺和正常肺组织比较差异2倍以上基因共有317条,其中193条表达增加,124条表达降低.结论:胚胎肺和正常肺组织之间存在有基因差异,初步证明人肺组织在发育过程中受环境影响.     

The gene expression profile of highly metastatic human ovarian cancer cell line by gene chip

In this paper, gene chip technique was used to analyze the difference of gene expression patterns in highly metastatic human ovarian tumor cell line HO-8910PM and in normal ovarian epithelial cells to explore the tumor-associated gene-cluster and its function in the process of occurrence an development of ovarian carcinoma. It will be helpful to comprehensively understand the molecular mechanism of cell transformation, to provide the molecular markers and target genes for clinical diagnosis a…     

基因芯片筛选食管鳞癌患者癌及癌旁组织差异表达基因

 目的 探讨食管鳞癌（ESCC）患者癌组织基因表达谱。 方法 取3例无ESCC家族史的癌及癌旁组织等量混合,抽提RNA,将RNA逆转录合成相应cDNA,以Cy5和Cy3标记cDNA作为探针,在含 有14 000点人类基因组芯片(BiostarH-140s)上进行杂交。用Scanarray 4000扫描仪扫描芯片荧光信号图像,用GenePix Pro 3.0软件对扫描图像进行数字化处理和分析。 结果依Ratio(cy5/cy3)>2.0或<0.5的数据项为差异表达的基因共1 855个。含表达序列标签(EST)844个,下调基因378个,上调基 因466个。在1 011个已知功能的基因中,下调基因560个,上调基因451个。包含各类功能基因。同时与6例具有家族史ESCC组织差异基因进行了初步分析。经与NCBI基因库比对,有8个基因相同,且异常表达这与报道相符。 结论 基因芯片是一高效筛选食管癌相关基因的方法。在ESCC的发生、发展中存在着大量异常表达基因。