人抗凝血酶Ⅲ生产工艺中病毒灭活/去除效果的验证

目的验证和评价人抗凝血酶Ⅲ(human antithrombin Ⅲ, AT-Ⅲ)生产工艺中有机溶剂/去污剂(solvent/detergent, S/D)法联合纳米膜过滤法灭活/去除病毒的可行性。方法采用S/D法作为AT-Ⅲ病毒灭活工艺, 纳米膜过滤法(20 nm孔径)作为其病毒去除工艺, 分析病毒灭活/去除工艺对AT-Ⅲ活性的影响;以伪狂犬病毒、辛德毕斯病毒、猪细小病毒、脑心肌炎病毒作为指示病毒, 对上述工艺进行病毒灭活/去除工艺效果的验证。结果 S/D法联合纳米膜过滤法可有效灭活/去除脂包膜病毒和非脂包膜病毒, 指示病毒滴度下降均>4 lg;且AT-Ⅲ的生物活性及其他各项指标未发生明显改变, 活性变化<10%。结论研究建立的S/D法联合纳米膜过滤法可有效灭活/去除AT-Ⅲ中的指示病毒, 该方法为凝血因子类制品的病毒灭活验证工艺提供了参考。     

纳米膜过滤和低pH孵放法去除/灭活静注人免疫球蛋白中病毒效果的验证

目的:验证纳米膜过滤法和低pH孵放法去除/灭活静注人免疫球蛋白中病毒的效果。方法:纳米膜过滤法选用猪细小病毒为指示病毒,低pH孵放法选用水疱性口炎病毒、辛德比斯病毒、HIV和伪狂犬病毒为指示病毒,高浓度静注人免疫球蛋白在pH4.6～5.0、30～32 ℃条件下作用不同时间后,取样检测样品中残余病毒滴度以评价病毒灭活效果...     

心肌肽溶液纳米膜过滤法去除猪细小病毒研究

目的：研究纳米膜过滤去除猪细小病毒的可行性。方法：用Viresolve Prefilter和孔径20nm的Viresolve Pro纳米膜两级串联过滤,滤膜面积为3.1cm2,使用压力30psi。结果：三批加载猪细小病毒的心肌1肽溶液样品病毒降低量均≥3.44 logs.滤后样品经盲传三代实验后未出现细胞病变。结论：该方法可有效去除猪细小病毒。     

去除小型无包膜病毒的纳米过滤法

病毒去除或灭活的工艺保证了血液制品的使用安全性。纳米膜过滤技术是血液制品生产工序中去除病毒的最有效的方法之一，然而，通过纳米膜过滤技术从免疫球蛋白(Ig)G或因子Ⅶ复合物等大分子蛋白制品中去除小病毒是困难的，因为这类蛋白的大小和病毒类似。为了实现用纳米膜过滤技术从这些蛋白中分离去除病毒，就需要改变其中一种物质的大小。     

两个不同厂家试剂盒检测EB病毒EA-IgA、VCA-IgA的比较

目的 比较分析两个不同厂家试剂检测EB病毒早期抗原IgA抗体(EA-IgA)、衣壳抗原IgA抗体(VCA-IgA),并做方法学评价.方法 分别用两个不同厂家的ELISA试剂盒检测184例鼻咽癌(NPC)患者及184例正常人的血清EA-IgA和VCA-IgA.结果 与欧蒙公司的试剂盒相比,IBL公司的试剂EA-IgA的阳性符合率为66.07%,阴性符合率为89.45%,总符合率为82.34%,Kappa值为0.57;VCA-IgA的阳性符合率为67.57%,阴性符合率为99.32%,总符合率为80.16%,Kappa值为0.62.结论 两个厂家的试剂盒在分别验证EA-IgA,VCA-IgA时,具有高度一致性.国内IBL公司生产的试剂可替代进口试剂.     

脊髓灰质炎病毒中和抗体检测血清参考品的制备及稳定性

目的 制备抗脊髓灰质炎(脊灰)病毒血清作为检测参考品,并研究其稳定性.方法 用1、2、3型脊灰病毒分别接种非洲绿猴肾细胞,收获病毒液,超滤浓缩后纯化病毒抗原,并进行蛋白含量和纯度检测.用纯化的病毒抗原免疫新西兰白兔获得分别抗3个型别的血清,过滤、分装、冻干后,进行无菌检验、支原体检验、水分测定,用微量细胞病变抑制法进行特异性检测.3名实验员各标定5次候选参考品的中和抗体效价,计算变异系数.血清放置于-20℃进行稳定性分析.结果 纯化的1、2、3型脊灰病毒抗原蛋白含量分别为12.3、10.4、9.8μg/ml.电泳蛋白条带的相对分子质量与文献报道一致.高效液相色谱法检测的1、2、3型脊灰病毒抗原蛋白纯度分别为100％、99％和96％.抗各型脊灰病毒血清仅可中和对应型别,而不能中和另两个型别脊灰病毒或肠道病毒.无菌检验、支原体检验结果及水分含量(均低于3％)均符合药典要求.血清参考品的抗1、2、3型脊灰病毒中和抗体效价分别为73 587、3 264、34 857.候选参考品在-20℃放置5年后中和抗体效价未降低(t=-1.25,P=0.225).结论 制备的抗1、2、3型脊灰病毒冻干血清参考品稳定性好,适用于检测Sabin株脊灰灭活疫苗免疫原性及脊灰病毒特异性中和抗体.     

抗柯萨奇病毒A组2型单克隆抗体制备及ELISA抗原检测方法的建立

目的  制备抗柯萨奇病毒A组2型( coxsackievirus A2,CV-A2)单克隆抗体（单抗）,建立CV-A2抗原检测方法。方法  用纯化后的CV-A2全病毒颗粒免疫小鼠,筛选获得抗CV-A2单抗。建立CV-A2抗原检测方法,确定线性范围,对其准确度、精密度、稳定性、专属性进行验证。用 ELISA检测病毒颗粒纯化过程中样品的抗原含量。结果  制备了高效价的抗CV-A2单抗并建立 ELISA抗原检测方法,检测范围为5.00~320.00 ng/ml。高、中、低3个浓度样品准确度验证回收率在89.58%~104.78%之间。重复性验证变异系数分别为2.10%、2.47%、6.18%。中间精密度验证变异系数分别为2.89%、2.69%、1.94%。耐用性验证回收率在84.26%~114.21%之间。包被微孔板于37℃放置3d,样品回收率在90.31%~103.11%之间。专属性验证结果显示该方法只识别CV-A2抗原,与其他抗原均无交叉反应。结论  建立并验证了CV-A2 ELISA抗原检测方法,可应用于病毒纯化过程中样品的抗原检测,还可应用于含CV-A2的手足口病多价疫苗的CV-A2抗原含量检测。     

以敏感的逆转录酶及抗原捕获ELISA检测人类免疫缺陷症病毒的敏感性比较

试验用病毒系从传代培养的T细胞系(CEM)中生长的人类免疫缺陷症病毒(HIV)分离物获得,在电镜下计数经染色的病毒样颗粒。逆转录酶(RT)试验是将50μl病毒样品与50μl 2倍浓缩的RT试验缓冲液结合,37℃温育22小时。用Abbott和Du Pont两种试剂盒作抗原捕获(AC)ELISA。Abbott试剂盒用人抗HIV抗体包被聚苯乙烯珠捕获病毒抗原,然后加兔抗HIV抗体及羊抗兔IgG-辣根过氧物酶结合物,再加底物邻苯二胺。DuPont试剂盒系将兔抗HIV p24抗体包被96孔微量板,检测系统为生物素化兔抗HIV p24抗体和链霉亲和素-辣根过氧物酶结合物,邻苯二胺为底物。结果证明,病毒多聚酶活性与病毒颗粒     

柯萨奇病毒A组10型抗原双抗体夹心ELISA定量方法的建立及应用

目的 建立柯萨奇病毒A组10型（coxsackievirus A10,CV-A10）抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法,用于CV-A10生产过程样品和四价手足口病疫苗的质量控制。方法  以纯化的CV-A10抗原分别免疫绵羊和小鼠获得羊免疫血清和杂交瘤单克隆抗体(单抗)细胞株,以杂交瘤细胞株免疫小鼠制备腹水,羊血清和小鼠腹水分别经亲和层析后获得纯化羊抗CV-A10多克隆抗体（多抗）和小鼠抗CV-A10单抗。采用微量细胞病变法测定纯化多抗和单抗中和抗体效价。分别以纯化羊多抗作为包被抗体、小鼠单抗作为检测抗体,进行配对筛选研究,建立CV-A10抗原定量双抗体夹心ELISA;对方法的线性、专属性、准确度、精密度、范围进行验证,并对CV-A10抗原生产过程中的样品和成品进行检测。结果 纯化抗CV-A10单抗和多抗均具有中和抗体活性。以多抗作为包被抗体、7株单抗作为检测抗体进行配对,其中5株单抗配对成功,选择CY166-14R作为检测抗体用于CV-A10抗原定量检测ELISA的建立;对检测方法进行优化,确定以羊多抗作为包被抗体的使用稀释比例为1：5 000〜1：10 000、小鼠单抗检测抗体稀释比例1 ：2 000〜1：4 000。建立的CV-A10抗原定量检测方法范围为0.42〜10. 00 U/ml,线性决定系数≥0. 99;该方法仅能特异性检测CV-A10抗原,与其他抗原或物质（肠道病毒71型、CV-A6、CV-A16、M199、DMEM、Vero细胞蛋白、牛血清）无交叉反应;对高、中、低浓度样品进行测定,测定值/理论值在95%〜110%之间,相对标准偏差在15%以内。结论 建立了 CV-A10抗原定量双抗体夹心ELISA,该方法在一定范围内的线性、专属性、准确度、精密度均较好,可用于CV-A10抗原生产过程样品和成品的质量控制,为CV-A10抗原的体外效力评价提供方法学基础。     

Sabin株脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原定量检测ELISA方法的建立及应用

目的  建立Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗（Sabin strain inactivated poliovirus vaccine,sIPV）D抗原定量检测的双抗体夹心ELISA方法,用于sIPV的体外效力评价。方法  以纯化D抗原分别免疫西门塔尔牛和BALB/c小鼠,获得牛免疫血清和小鼠单克隆抗体（单抗）杂交瘤细胞株,以杂交瘤细胞株免疫小鼠制备单抗腹水。牛血清和小鼠腹水分别经沉淀和亲和层析后得到纯化牛多克隆抗体（多抗）和小鼠单抗。以多抗为包被抗体、单抗为检测抗体进行配对筛选,建立D抗原定量检测的双抗体夹心ELISA。对方法的线性、范围、特异性、准确度、精密度以及在sIPV制备过程中样品检测的适用性进行验证。结果  纯化多抗和单抗均具有中和抗体活性,纯度分别达到80%和90%以上。经抗体配对筛选,确定3H10、901、1H10作为检测抗体,分别用于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原定量检测ELISA的建立。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型包被抗体的使用浓度分别为1:8 000、1:8 000、1:10 000, 3H10、901、1H10检测抗体的使用浓度分别为1:10 000、1:20 000、1:10 000。建立的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原检测方法的检测范围分别为0.4~13.0、0.4~12.0和0.4~20.0 DU/ml,线性回归决定系数≥0.99。该法能特异性检出D抗原,与C抗原、不同型别D抗原以及生产过程中的其他物质无交叉反应。用该法对高、中、低浓度样品进行测定,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型测定值/理论值（×100%）分别为97%～111%、91%～104%和95%～102%、相对标准偏差分别为≤7%、≤9%和≤10%;采用该法检测sIPV生产过程中的样品,显示出抗原纯化趋势。结论  建立了脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原定量检测ELISA方法,可有效用于sIPV的体外效力评价。     

人抗凝血酶Ⅲ生产工艺中病毒灭活／去除效果的验证

目的  验证和评价人抗凝血酶Ⅲ（human antithrombin Ⅲ,AT-Ⅲ）生产工艺中有机溶剂/去污剂（solvent/detergent,S/D）法联合纳米膜过滤法灭活／去除病毒的可行性。方法  采用S/D法作为AT-Ⅲ病毒灭活工艺,纳米膜过滤法（20 nm孔径）作为其病毒去除工艺,分析病毒灭活／去除工艺对AT-Ⅲ活性的影响;以伪狂犬病毒、辛德毕斯病毒、猪细小病毒、脑心肌炎病毒作为指示病毒,对上述工艺进行病毒灭活／去除工艺效果的验证。结果   S/D法联合纳米膜过滤法可有效灭活／去除脂包膜病毒和非脂包膜病毒,指示病毒滴度下降均>4 lg;且AT-Ⅲ的生物活性及其他各项指标未发生明显改变,活性变化<10%。结论  研究建立的S/D法联合纳米膜过滤法可有效灭活／去除AT-Ⅲ中的指示病毒,该方法为凝血因子类制品的病毒灭活验证工艺提供了参考。     

低pH孵放法对人免疫球蛋白中病毒的灭活效果及制品质量的影响

目的 :探讨低 pH孵放法对人免疫球蛋白制品中加入的指示病毒的灭活效果及对其主要质量指标的影响 ,以完善生产工艺 ,使制品更安全有效。方法 :取经低温乙醇法制备的人免疫球蛋白原液作样品 ,分为 2组 ,分别调 pH至 4 .1±s 0 .3和6.90±0 .10 ,经除菌 ,分别按与样品体积比 1∶9的比例加入Sindbis病毒 (滴度 8.5LogTCID·mL- 1)与VSV病毒 (滴度 8.67LogTCID·mL- 1)培养液 ,孵放 (2 4 .0± 1.0 )°C ,并于 0 ,7,14,2 1d取样检测 2种指示病毒滴度 ,同时检测制品单体 +二聚体含量、HBs抗体、白喉抗体效价、制品纯度及观察制品热稳定性。结果 :经低 pH孵放法〔pH 4 .1± 0 .3,(2 4 .0±1.0 )°C〕 ,孵放 2 1d)灭活 ,VSV病毒及Sindbis病毒滴度下降均达 6.5logTCID5 0·0 .1mL- 1以上 ,且制品主要几项质量指标未见影响。结论 :低 pH孵放法对人免疫球蛋白制品病毒灭活效果好 ,对制品质量无影响     

静脉注射人免疫球蛋白工艺中的病毒灭活方法初探

 目的   研究静脉注射人免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin,IVIG）工艺中辛酸处理联合20 nm膜过滤的病毒灭活/去除方法。方法   分别将脂包膜Sindbis病毒和伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV）加入pH(4.6±0.1)和pH(5.3±0.1)IVIG中间品（辛酸沉淀后上清液）,在(7.47±0.39)、(14.47±0.39)和(22.47±0.39) mmol/L辛酸条件下维持(25±1) ℃处理120 min;将非脂包膜猪细小病毒（porcine parovirus,PPV）加入pH(6.0±0.2)IVIG中间品（层析流穿液）,用20 nm膜过滤。检测所有样品处理前后的病毒滴度。 结果   (25±1) ℃处理120 min后,pH(4.6±0.1) IVIG中间品经(7.47±0.39)和(14.47±0.39) mmol/L辛酸钠处理后的残余病毒滴度均≤0.50lg,pH(5.3±0.1) IVIG中间品分别经(14.47±0.39)和(22.47±0.39) mmol/L辛酸处理后的残余病毒滴度均≤0.50lg;20 nm膜过滤可使IVIG中间品的PPV滴度下降≥4.00lg。2种处理方法的结果均符合相关规定的要求。结论   在一定条件下,辛酸处理联合20 nm膜过滤可有效灭活/去除IVIG生产过程的相关病毒。     

我省首次从脑炎患者中检测出Colti病毒抗体

在的几年乙脑流行季节，从福州地区部分医院采集２到６７例临床脑炎患者的血清（双份血清２０对，单份血清４７份），用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）和血凝抑制试验分别检测出Ｃｏｌｔｉ病毒和乙脑病毒抗体，用上述两种方法检测的结果，有上血清抗体反应类型，第一仅查到Ｃｏｌｔｉ病毒抗体，占４．４５％）；第二种是仅查到乙脑病毒抗体，占２０．９％；第三种是查到Ｃｏｌｔｉ病毒抗体，又查到乙脑病毒抗体，占２３．９％；第四     

病毒消口服液微生物限度检查方法验证

目的：根据《中国药典》2005年版要求，对病毒消口服液的微生物限度检查进行方法验证。方法：培养基稀释法和薄膜过滤法。结果：采用薄膜过滤法处理样品符合《中国药典》2005版微生物限度检查的要求。结论：以薄膜过滤法验证试验结果为依据．确定本品微生物限度检查方法。     

传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP2比较及高表达毒株的分离

对29个传染性法氏囊病病毒（IBDV）的病理组织和毒株分别增殖后,采用不连续蔗糖密度梯度离心的方法纯化病毒,经SDS-PAGE分析,病毒结构蛋白VP2在不同毒株表达量有较大差异。对其中OOZB和99TA32个VP2相对高表达的IBD病理组织样品进行病毒分离,获得了2个IBDV VP2相对高表达毒株。     

狂犬病病毒滴度直接免疫荧光检测的优化及验证

目的对狂犬病病毒滴度直接免疫荧光检测(direct immunofluorescence assay, DFA)进行优化及验证, 使其更好地应用于规模化生产中的质量控制。方法采用不同的病毒培养温度(35、37 ℃)、培养时间(24、48 h)、接种细胞(Vero细胞、BSR细胞)以及稀释倍数(3、5、10倍)对狂犬病病毒滴度进行DFA, 并对病毒滴度结果进行统计学分析。对优化方法进行重复性和中间精密度验证, 并对多个批次样品采用小鼠颅内滴定法和DFA进行滴度检测, 分析其相关性。结果优化的条件为37 ℃培养24 h、接种BSR细胞、5倍系列稀释病毒。DFA重复性和中间精密度变异系数均小于2%。16份样品的小鼠颅内滴定法与DFA滴度显著相关, 相关系数为0.952, 且P值小于0.000 1。结论优化后的DFA快速、准确, 且与小鼠颅内滴定法一致性较好, 能够替代后者作为狂犬病疫苗规模化生产的质量控制方法。     

水痘-带状疱疹病毒膜抗原荧光抗体试验的建立与评价

目的  建立用于检测血清中水痘-带状疱疹病毒（varicella-zoster virus,VZV)特异性抗体的膜抗原荧光抗体（fluorescent antibody to membrane antigen,FAMA）试验并对其进行验证和评价。方法  用VZV感染细胞作为抗原制备抗原载玻片,以异硫氰酸荧光素标记的羊抗人IgG为二抗建立FAMA试验。对试验的灵敏度、特异性和重复性进行验证。用FAMA试验和市售ELISA试剂盒对200份血浆样品中的抗VZV抗体进行检测。采用Spearman秩相关检验对两种方法的检测结果进行比较。结果 FAMA试验的灵敏度为0.04 IU/ml,与常见的人疱疹病毒（单纯疱疹病毒1和2型、人巨细胞病毒）没有交叉反应且重复性良好。经FAMA试验检测,200份血浆样品的抗体阳性率为93.5%,抗体几何平均效价为1:18.1,检测结果与市售ELISA试剂盒的符合率为90.0%。两种方法的检测结果具有相关性,Spearman秩相关系数为0.49,P<0.000 1。结论  建立的方法具有良好的灵敏度、特异性和重复性,可用于血清中抗VZV抗体的检测。     

诱导型一氧化氮合酶反义RNA重组腙相关病毒载体的构建

目的应用分子克隆技术构建携带诱导型一氧化氮合酶(iNOS)反义基因片断的重组腺病毒载体(rAAV-AsiNOS)。方法应用RT-PCR技术扩增iNOS目的基因片断,EcoRⅠ和XbaⅠ内切酶分别双酶切pAAV-MCS质粒和iNOS基因,经过胶回收和纯化后,住T4连接酶作用下,构建rAAV-AsiNOS重组质粒,并转化到感受态细菌XL-10中,进行鉴定和测序,293细胞病毒包装,重组腺相关病毒载体大量扩增,滴度和感染率的测定以及浓缩和纯化。结果从SD大鼠脑缺血区域中扩增的iNOS特异性片段大小分别为361bp;经双酶切和连接成重组质粒rAAV-AsiNOS;PCR鉴定结果显示重组质粒rAAV-AsnNOS目的基因产物特异性片段大小为593bp;基因测序结果显示iNOS基因片段分别反向克隆到pAAV的MCS,成功地构建携带反义iNOS基因的重组质粒rAAV-AsiNOS;经测算病毒原液的滴度为(6～12)×107个/ml,对PC12细胞的感染率约为70%;分离浓缩和纯化重组腺相关病毒载体,获得较高的病毒滴度,均约2×1010个病毒颗粒/ml,去除腺病毒等影响因素。结论成功构建携带iNOS反义基因的腺相关病毒载体,测序证实iNOS基因片断分别反向克隆到的腺相关病毒载体上;证实重组腺相关载体能够传染PC12细胞,转染率为70%。     

联合检测HIV抗体的试剂盒对抗-HIV-2的敏感性

许多检测人类免疫缺陷症病毒(HIV)抗体的试剂盒可同时检测血清中抗HIV-1和HIV-2抗体。为调查其中9种试剂盒对抗-HIV-2的敏感性,作者从塞内加尔、塞拉利昂、葡萄牙、法国和英国收集了16份HIV-2感染病人的血清样品,用阴性人血清进行稀释。所有16份样品经竞争性抗-HIV-2放射免疫法(RIA)(92%以上抑制)测定及与HIV-2包膜抗原gp36均呈强反应。用竞争性抗-HIV-1 RIA检测或与HIV-1包膜抗原gp41均无反应。8种联合检测HIV-1/HIV-2